人绒毛膜滋养层细胞的培养
作者：孔令红 刘忠 陈士岭 彭彩娥 徐静萍
单位：孔令红(第一军医大学南方医院妇产科，广东 广州 510515)；刘忠(第一军医大学细胞生物学教研室，广东 广州 510515)；陈士岭(第一军医大学南方医院妇产科，广东 广州 510515)；彭彩娥(第一军医大学南方医院妇产科，广东 广州 510515)；徐静萍(第一军医大学南方医院妇产科，广东 广州 510515)
关键词：绒毛膜滋养层细胞；胰酶；DNA酶
第一军医大学学报000103
摘要：取妊娠6～ 10周的人妊娠早期绒毛膜，用胰酶/DNA酶消化，换瓶纯化处理，经光镜和电镜检测证实，我们建立了稳定的人绒毛膜滋养层细胞培养体系。
中图分类号：R318 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0010-02
, 百拇医药
Culture of human trophoblastic cells
KONG Ling-hong, CHEN Shi-ling, PENG Cai-e, XU Jing-ping
(Department of Gynecology and Obstetrics, Nanfang Hospital)
LIU Zhong
(Department of Cell Biology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: The chorionic villi, 6～ 10 weeks of gestation, were digested by trypsin/DNase and purified by changing culture plate. The results of light and electron microscopic detection confirmed that a human trophoblast system was established.
, 百拇医药
Key words: trophoblast; trypsin; DNase
以往在进行胎盘的生殖内分泌学研究时，一般都采用组织贴块法获得绒毛膜滋养层细胞。但采用组织贴块法原代细胞培养时间长，且易混杂一定数量的成纤维细胞。我们参考文献[1]采用胰酶/DNA酶消化法，并进行了改进，寻求建立稳定的人绒毛膜滋养层细胞体外培养体系。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM、F12培养基购自美国生物技术有限公司；超级小牛血清购自杭州四季青公司；胰酶购自Difco公司；DNA酶购自天象人公司；培养板购自丹麦Nunc公司。
1.2 方法
1.2.1 人绒毛膜滋养层细胞的培养 取妊娠6～ 10周、发育正常、自愿流产的孕妇绒毛。在无菌超净台内，用D-Hanks液冲洗3次，去除血污。用手术剪剪去蜕膜等其它物质，将绒毛剪碎。用0.25%胰酶和DNA酶(15 000 U/L)在37° C水浴消化10 min，200目筛网过滤，滤液用含10%(V/V)培养液中和胰酶的活性。将未消化完全的组织同法消化过滤后与第一次的滤液汇集，800 r/min离心5 min，取上清液。0.5%台盼蓝染色计数，用含10%(V/V)培养液混匀稀释成5×108 /L左右，吸入培养瓶，在37° C、5% CO2 孵育箱培养1 h后，将附壁未牢的绒毛膜滋养层细胞换瓶继续培养；弃去仍附壁的间质细胞。当原代培养的细胞长满瓶壁的90%左右时(3～ 4 d)就可进行传代。
, 百拇医药
1.3 人绒毛膜滋养层细胞的鉴定
1.3.1 HE染色光镜观察 六孔培养板经紫外灯照射30 min，内置高压消毒的盖玻片。将细胞消化、离心、稀释为5×108 /L，传到培养板内的盖玻片上。12 h后细胞附壁伸展, 取出用PBS冲洗、纯丙酮固定10 min，做HE染色。苏木素染色10 min，自来水冲洗，0.5%盐酸酒精分色，自来水冲洗，伊红染色1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，光镜观察。
1.3.2 透射电镜观察 选用第4代生长良好的细胞，按常规消化，在有尖端的琼脂管内1 000 r/min离心5 min。加戊二醛固定10 min。切割下含有细胞团的琼脂块，再固定2 h。1%锇酸后固定2 h。50%～ 100%梯度丙酮脱水，树脂浸透及包埋，70° C聚合8 h。超薄切片铀染30 min，铅染10～ 15 min，染色后透射电镜观察。
2 结果
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2.1 人绒毛膜滋养层细胞的培养
倒置显微镜下可见原代培养8 h后，人绒毛膜滋养层细胞附壁变形。细胞体积大，呈长多边形。胞浆丰富，核大卵园形。可见少量含多核的合胞体细胞，也杂有极少量梭状细胞。绒毛膜滋养层细胞生长旺盛，3 d左右需要传代。
2.2 人绒毛膜滋养层细胞的鉴定
HE染色光镜下可见绒毛膜滋养层细胞呈长多边形，胞浆呈淡红色，核为浅紫色；间质细胞呈长梭状。透射电镜下可见滋养层细胞膜外布满微绒毛，胞质中线粒体大而多，游离核糖体和多聚核蛋白体丰富；高尔基复合体明显，位居核旁。粗面内质网与线粒体相贴近。有些滑面内质网扩大成小管和小泡，胞质中还可见到电子密度高的脂滴、膜包颗粒和髓样小体。核较大，核内异染色质少而分散，染色浅。
3 讨论
体外培养绒毛膜滋养层细胞大体可分为组织贴块法及胰酶消化法，但组织贴块法原代细胞生长周期长，约需10 d，且容易混杂由间质细胞分化来的成纤维细胞。而采用胰酶消化法，3 d左右就可以迅速得到更纯的绒毛膜细胞滋养层细胞。我们在消化过程的后期加入DNA酶可以辅助消化DNA样物质所形成的胶状物，从而使更多的细胞游离出来[1,2]。
, http://www.100md.com
由于条件限制，国外的学者为获得人绒毛膜滋养层细胞，一般取足月产的胎盘。这时绒毛膜细胞滋养层细胞的量较少，且细胞老化，活力低，不能分裂传代，因而很难保证实验所需的性状稳定的滋养层细胞。而且原代培养的细胞成分复杂，难以纯化。我们取材的是孕6～ 10周绒毛，组织成分比较单一，除去绒毛轴心的少量间质细胞，所剩几乎都是绒毛膜滋养层细胞。细胞活力良好，分裂增殖快，能够满足实验需要，保证每次重复实验结果的可信性与可比性。
人妊娠早期绒毛主要含有外层的滋养层细胞和轴心的间质细胞；滋养层细胞又分为细胞滋养层和合体滋养层细胞。原代培善时因合体细胞体积较大，易被剪切损伤，附壁能力较差；合体细胞分化成熟，不能进行再分裂，传代培养中的合体细胞主要由细胞滋养层细胞融合分化而来。Lysiak[3]报道体外培养人绒毛滋养层细胞，合体细胞约占38%。间质细胞一般都残留于未消化完全的组织内。因间质细胞附壁生长能力较强，原代培养1 h后，我们将附壁能力相对较差的滋养层细胞轻轻吹打下来换瓶培养，可以进一步达到纯化细胞的目的。
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细胞培养体系的建立有一点不可缺少，那就是细胞鉴别。绒毛膜滋养层细胞主要是与由间质分化来的成纤维细胞相鉴别。通过光镜观察细胞的大体形态、生长特性就可粗略鉴别；绒毛膜细胞滋养层细胞形态为长多边形，而成纤维细胞为长梭形，纹理呈编织样生长。透射电镜下细胞滋养上皮细胞含有丰富的利于激素分泌的内质网、高尔基体和脂滴。观察的结果证明我们所培养的细胞就是滋养层细胞，细胞纯度符合实验要求。
总之，取人孕6～ 10周的绒毛，用胰酶消化法，经换瓶纯化处理，可以获得较纯且稳定的绒毛膜滋养层细胞体系，为以下的实验提供合乎要求的处理对象。
参考文献
[1]李荣皓、庄临之. 人细胞滋养层细胞的无血清培养与生长因子的作用[J].中国科学B辑，1990, (9):963～5.
[2]Maria IGL，Soares TJ, Cowen GM et al . Demonstration of functional cytokine-placental interaction CSF-1 and GM-CSF stimulate human cytotrophoblast differentiation and peptide hormone secretion[J]. Exp Cell Res, 1994, 214:46～51.
[3]Lysiak JJ，Hunt SJ, Lei PD et al. Localization of transforming growth factor a in the human placenta and decidua: role in trophoblast growth[J]. Biol Reprod, 1993, 49:885～91.
1998-11-13, 百拇医药
单位：孔令红(第一军医大学南方医院妇产科，广东 广州 510515)；刘忠(第一军医大学细胞生物学教研室，广东 广州 510515)；陈士岭(第一军医大学南方医院妇产科，广东 广州 510515)；彭彩娥(第一军医大学南方医院妇产科，广东 广州 510515)；徐静萍(第一军医大学南方医院妇产科，广东 广州 510515)
关键词：绒毛膜滋养层细胞；胰酶；DNA酶
第一军医大学学报000103
摘要：取妊娠6～ 10周的人妊娠早期绒毛膜，用胰酶/DNA酶消化，换瓶纯化处理，经光镜和电镜检测证实，我们建立了稳定的人绒毛膜滋养层细胞培养体系。
中图分类号：R318 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0010-02
, 百拇医药
Culture of human trophoblastic cells
KONG Ling-hong, CHEN Shi-ling, PENG Cai-e, XU Jing-ping
(Department of Gynecology and Obstetrics, Nanfang Hospital)
LIU Zhong
(Department of Cell Biology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: The chorionic villi, 6～ 10 weeks of gestation, were digested by trypsin/DNase and purified by changing culture plate. The results of light and electron microscopic detection confirmed that a human trophoblast system was established.
, 百拇医药
Key words: trophoblast; trypsin; DNase
以往在进行胎盘的生殖内分泌学研究时，一般都采用组织贴块法获得绒毛膜滋养层细胞。但采用组织贴块法原代细胞培养时间长，且易混杂一定数量的成纤维细胞。我们参考文献[1]采用胰酶/DNA酶消化法，并进行了改进，寻求建立稳定的人绒毛膜滋养层细胞体外培养体系。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM、F12培养基购自美国生物技术有限公司；超级小牛血清购自杭州四季青公司；胰酶购自Difco公司；DNA酶购自天象人公司；培养板购自丹麦Nunc公司。
1.2 方法
1.2.1 人绒毛膜滋养层细胞的培养 取妊娠6～ 10周、发育正常、自愿流产的孕妇绒毛。在无菌超净台内，用D-Hanks液冲洗3次，去除血污。用手术剪剪去蜕膜等其它物质，将绒毛剪碎。用0.25%胰酶和DNA酶(15 000 U/L)在37° C水浴消化10 min，200目筛网过滤，滤液用含10%(V/V)培养液中和胰酶的活性。将未消化完全的组织同法消化过滤后与第一次的滤液汇集，800 r/min离心5 min，取上清液。0.5%台盼蓝染色计数，用含10%(V/V)培养液混匀稀释成5×108 /L左右，吸入培养瓶，在37° C、5% CO2 孵育箱培养1 h后，将附壁未牢的绒毛膜滋养层细胞换瓶继续培养；弃去仍附壁的间质细胞。当原代培养的细胞长满瓶壁的90%左右时(3～ 4 d)就可进行传代。
, 百拇医药
1.3 人绒毛膜滋养层细胞的鉴定
1.3.1 HE染色光镜观察 六孔培养板经紫外灯照射30 min，内置高压消毒的盖玻片。将细胞消化、离心、稀释为5×108 /L，传到培养板内的盖玻片上。12 h后细胞附壁伸展, 取出用PBS冲洗、纯丙酮固定10 min，做HE染色。苏木素染色10 min，自来水冲洗，0.5%盐酸酒精分色，自来水冲洗，伊红染色1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，光镜观察。
1.3.2 透射电镜观察 选用第4代生长良好的细胞，按常规消化，在有尖端的琼脂管内1 000 r/min离心5 min。加戊二醛固定10 min。切割下含有细胞团的琼脂块，再固定2 h。1%锇酸后固定2 h。50%～ 100%梯度丙酮脱水，树脂浸透及包埋，70° C聚合8 h。超薄切片铀染30 min，铅染10～ 15 min，染色后透射电镜观察。
2 结果
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2.1 人绒毛膜滋养层细胞的培养
倒置显微镜下可见原代培养8 h后，人绒毛膜滋养层细胞附壁变形。细胞体积大，呈长多边形。胞浆丰富，核大卵园形。可见少量含多核的合胞体细胞，也杂有极少量梭状细胞。绒毛膜滋养层细胞生长旺盛，3 d左右需要传代。
2.2 人绒毛膜滋养层细胞的鉴定
HE染色光镜下可见绒毛膜滋养层细胞呈长多边形，胞浆呈淡红色，核为浅紫色；间质细胞呈长梭状。透射电镜下可见滋养层细胞膜外布满微绒毛，胞质中线粒体大而多，游离核糖体和多聚核蛋白体丰富；高尔基复合体明显，位居核旁。粗面内质网与线粒体相贴近。有些滑面内质网扩大成小管和小泡，胞质中还可见到电子密度高的脂滴、膜包颗粒和髓样小体。核较大，核内异染色质少而分散，染色浅。
3 讨论
体外培养绒毛膜滋养层细胞大体可分为组织贴块法及胰酶消化法，但组织贴块法原代细胞生长周期长，约需10 d，且容易混杂由间质细胞分化来的成纤维细胞。而采用胰酶消化法，3 d左右就可以迅速得到更纯的绒毛膜细胞滋养层细胞。我们在消化过程的后期加入DNA酶可以辅助消化DNA样物质所形成的胶状物，从而使更多的细胞游离出来[1,2]。
, http://www.100md.com
由于条件限制，国外的学者为获得人绒毛膜滋养层细胞，一般取足月产的胎盘。这时绒毛膜细胞滋养层细胞的量较少，且细胞老化，活力低，不能分裂传代，因而很难保证实验所需的性状稳定的滋养层细胞。而且原代培养的细胞成分复杂，难以纯化。我们取材的是孕6～ 10周绒毛，组织成分比较单一，除去绒毛轴心的少量间质细胞，所剩几乎都是绒毛膜滋养层细胞。细胞活力良好，分裂增殖快，能够满足实验需要，保证每次重复实验结果的可信性与可比性。
人妊娠早期绒毛主要含有外层的滋养层细胞和轴心的间质细胞；滋养层细胞又分为细胞滋养层和合体滋养层细胞。原代培善时因合体细胞体积较大，易被剪切损伤，附壁能力较差；合体细胞分化成熟，不能进行再分裂，传代培养中的合体细胞主要由细胞滋养层细胞融合分化而来。Lysiak[3]报道体外培养人绒毛滋养层细胞，合体细胞约占38%。间质细胞一般都残留于未消化完全的组织内。因间质细胞附壁生长能力较强，原代培养1 h后，我们将附壁能力相对较差的滋养层细胞轻轻吹打下来换瓶培养，可以进一步达到纯化细胞的目的。
, http://www.100md.com
细胞培养体系的建立有一点不可缺少，那就是细胞鉴别。绒毛膜滋养层细胞主要是与由间质分化来的成纤维细胞相鉴别。通过光镜观察细胞的大体形态、生长特性就可粗略鉴别；绒毛膜细胞滋养层细胞形态为长多边形，而成纤维细胞为长梭形，纹理呈编织样生长。透射电镜下细胞滋养上皮细胞含有丰富的利于激素分泌的内质网、高尔基体和脂滴。观察的结果证明我们所培养的细胞就是滋养层细胞，细胞纯度符合实验要求。
总之，取人孕6～ 10周的绒毛，用胰酶消化法，经换瓶纯化处理，可以获得较纯且稳定的绒毛膜滋养层细胞体系，为以下的实验提供合乎要求的处理对象。
参考文献
[1]李荣皓、庄临之. 人细胞滋养层细胞的无血清培养与生长因子的作用[J].中国科学B辑，1990, (9):963～5.
[2]Maria IGL，Soares TJ, Cowen GM et al . Demonstration of functional cytokine-placental interaction CSF-1 and GM-CSF stimulate human cytotrophoblast differentiation and peptide hormone secretion[J]. Exp Cell Res, 1994, 214:46～51.
[3]Lysiak JJ，Hunt SJ, Lei PD et al. Localization of transforming growth factor a in the human placenta and decidua: role in trophoblast growth[J]. Biol Reprod, 1993, 49:885～91.
1998-11-13, 百拇医药