肝素对Ⅱ度烧伤大鼠免疫功能的影响
作者：罗攀 岑瑛 赵景华 于蓉
单位：罗攀(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041); 岑瑛(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041); 赵景华(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041); 于蓉(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041)
关键词：肝素；创伤；烧伤；免疫
华西医学000116 摘 要：为了研究肝素对Ⅱ度烧伤大鼠免疫功能的影响，我们将10只SD大鼠随机分为两组，制成20%面积深Ⅱ度烧伤后，分别给予肝素及生理盐水皮下注射，一天一次治疗，进行免疫学检测。结果发现：肝素组淋巴细胞转化率显著提高，吞噬细胞吞噬功能明显增强，而溶血空斑实验则两组无显著性差异。提示肝素可增强细胞免疫及吞噬细胞功能，但对体液免疫无影响。
分类号：R644 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1002-0179(2000)01-0032-02
The Effect of Heparin on Immune Function of Second Degree Burned Rats
LUO Pan CEN Ying ZHAO Jing-hua
(Department of Plastic and Burn Surgery，First University Hospital，West China University of Medical Sciences，Chengdu，610041)
Abstract：In order to study the effect of heparin on immune function of second degree burned rats，a randomized controlled trial was designed.After 20% of total body surface area，deep second-degree burn was created.10 SD rats were treated with heparin，or subcutaneous injection of normal saline. The immune function of the rats was tested.The heparin group showed significant improvement in lymphocyte transformation ratio and phagocytotic capacity of phagocyte，but the two groups had no significant difference on hemolytic plaque test.It was suggested that heparin could enhance the cellular immunity and phagocytotic activity of phagocyte，but had no influence on the humoral immunity.
, 百拇医药
Key words：Heparin；Burn；Trauma；Immunity▲
近年研究发现，肝素有一定的免疫调节作用〔1～3〕，但对于其免疫调节的范围尚不太清楚。本实验的目的在于从体液免疫、细胞免疫及单核巨噬细胞系统三个方面初步探讨肝素免疫调节的范围。
1 实验过程及方法
1.1 实验动物及材料 10只雌性SD大鼠由华西科大学实验动物中心提供，体重200g～260g。肝素钠注射液为常州生化千红制药有限公司生产，剂型为12500单位/支。
1.2 Ⅱ度烧伤动物模型的建立 大鼠在5%水合氯醛腹腔麻醉下用脱毛剂脱去背部的毛，清水洗净脱毛剂，揩干，用90℃衡温水蒸气烫其背部10秒造成20%面积深Ⅱ度烧伤(组织学证实)。
1.3 实验方法 大鼠随机分为实验组与对照组两组，每组5只。于烧伤前一天腹腔注射10%绵羊红细胞悬液1ml。两组均于烧伤后1小时腹腔注射生理盐水1ml，次日起每日皮下注射生理盐水1ml。实验组于生理盐水中加入25u肝素。伤后第三天将大鼠用断颈法处死。
, 百拇医药
1.4 实验指标
1.4.1 淋巴细胞转化实验(LT) 无菌条件下取大鼠脾细胞，用Hank’s液洗涤两次，无血清RPMI1640洗涤一次，用5%FCS-RPMI1640调制成2×106/ml组胞悬液。将细胞悬液加入96孔平底细胞培养板，100μl/孔，每孔作3复孔，其中2孔加刺激剂，为转化孔，加入ConA，2ng/孔。另一孔不加刺激剂，作为对照孔。平板置37℃，5%CO2条件培养72小时。终止培养前14小时，加入3H-TdR，luCi/孔。用多头细胞收集仪收集细胞，测CPM值，计算复孔平均值。
1.4.2 溶血空斑实验(PFC) 无菌条件下取大鼠脾细胞，用Hank’s液洗涤两次，无血清RPMI1640洗涤一次。用5%FCS-RPMI1640调制成5×105/ml细胞悬液。分别取脾细胞悬液100μl，10%绵羊红细胞50μl，补体50μl，RPMI1640 100μl，混匀加入两个小室内，孵育1小时(37℃)。计空斑数。
, 百拇医药
1.4.3 吞噬实验 无菌条件下取腹腔巨噬细胞，加腹腔液2～3滴于一张清洁玻片上，用等量的1%鸡红细胞悬液滴于玻片上，摇晃均匀。置玻片于平皿内盖好，37℃条件下放置3小时后取出，在生理盐水内涮洗二次，洗去未吸附的细胞。自然干燥后，瑞氏染色，油镜观察结果。计算吞噬百分率(100个巨噬细胞中吞有鸡红细胞者所占比率)。
1.4.4 副作用观察 每日观察大鼠创面及排泄物，检查有无出血现象。
1.5 本实验均采用t检验进行统计学分析
2 实验结果
2.1 淋巴细胞转化实验 结果见表1。显示实验组淋巴细胞转化为淋巴母细胞进行增殖的数量明显高于对照组(P<0.005)。提示实验组的细胞免疫水平高于对照组。
2.2 溶血空斑试验(PFC试验) 试验结果如表2所示。经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。提示实验组体液免疫水平与对照组无差异。
, 百拇医药
2.3 吞噬试验 结果如表3所示。实验组较对照组巨噬细胞吞噬功能明显增强(P<0.05)，提示肝素可增强巨噬细胞吞噬功能。
2.4 每日观察大鼠创面及排泄物，未发现出血现象。
表1.淋巴细胞转化试验 组别
增殖率(%)
均数(X，%)
标准差(S，%)
P
实验组
58
72
76
, 百拇医药
70
61
67.4
7.60
<0.05
对照组
46
56
52
26
43
44.6
11.54
, 百拇医药
表2.溶血空斑试验 组别
空斑数
均数(X，%)
标准差(S，%)
P
实验组
180
200
150
170
130
166
27.01
, 百拇医药
>0.05
对照组
140
180
160
110
190
156
32.09
表3.吞噬试验 组别
吞噬百分率(%)
均数(X，%)
标准差(S，%)
, 百拇医药
P
实验组
92
87
80
94
79
86.4
6.80
<0.05
对照组
83
76
, http://www.100md.com 81
73
72
77.0
4.85
3 讨论
通过对Ⅱ度烧伤大鼠的随机对照研究，可得出以下结论：肝素可增强机体细胞免疫水平及巨噬细胞吞噬能力，但对体液免疫无影响。
淋巴细胞转化试验是指T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原如PHA、ConA等工特异性抗原刺激后，能转化为淋巴母细胞，随后可发生分裂增殖。根据T细胞的转化率可判断机体细胞免疫水平。溶血空斑试验是一种利用补体介导的抗原抗体反应检测抗体形成细胞的方法，常作为检测体液免疫的指标。吞噬试验则是检测巨噬细胞吞噬能力，反映了机体非特异性免疫功能水平〔4〕。本试验结果显示，两组间淋巴细胞转化及吞噬试验有显著性差异，而溶血空斑试验则无明显差异(P>0.05)，提示肝素有增强巨噬细胞功能及细胞免疫功能的作用，而对体液免疫则无影响。
, 百拇医药
Zellweger R等〔1〕证实肝素可提高出血性休克小鼠脾细胞释放IL-2和IL-3的能力及促进脾和腹膜巨噬细胞释放IL-6的能力恢复。Dziarski R等〔2〕亦观察临床用量肝素可增强鼠T细胞增殖反应。
研究发现，肝素可增强IL-1对IL-1依赖的辅助T细胞克隆的促生长作用，也可增强这些细胞上IL-1受体的表达。提示肝素可直接与T细胞反应，上调其IL-1受体表达，从而增强其对IL-1的反应性〔3〕。研究已证实，淋巴细胞表面存在肝素结合位点〔5〕。其中CD2和CD4淋巴细胞表面上的肝素结合位点已被确定〔6，7〕。但肝素如何与淋巴细胞结合，以及结合后如何具体调节淋巴细胞功能目前仍不太淋楚，尚有待进一步研究。
本实验采用的剂量标准明显低于临床抗凝剂是。通过每日观察创面及排泄物，未发现有出血现象，表明此剂量下不易引起出血的副作用。■
, 百拇医药
参考文献：
[1] Zellweger R，Ayala A，Zhu XL et al.A novel nonanticoagulant heparin improves splenocyte and peritoneal macrophage immune function after trauma-hemorrhage and resusciation.J Surg Res，1995；59(1)∶211～218.
[2] Dziarski R.Enhancement of mixed leukocyte reaction and cytotoxic antitumor responses by heparin.J Immunol，1989；143∶356～365.
[3] Dziarski R.Synergirtic enhancemet of T cell response and interleukin-1 receptor expression by interleukin-1 and heparin of dextran sulfate.Cell Immunol，1992；145∶100～110.
, 百拇医药
[4] 郑武飞，主编：医学免疫学，第一版，北京：人民卫生出版社，1989，126～128。
[5] Parish CR，Snowedn JM.Lymphocytes express a diverse array of specific receptors for sulfated polysaccharides.Cell Immunol.1985；91∶201～204.
[6] Parish CR，Mcphun V，Warren HS.Is a natural ligand of the T lymphocyte CD2 molecule a sulfated carbohyadrate？J Immunol，1988；141∶3498.
[7] Lederman S，Gulick R，CHess L.Dextran sulfate and Heparin interact with CD4 molecules to inhibit the binding of coat protein (gp120) of HIV.J Immumol，1989；143(4)∶1149～1154.
收稿日期：1999-12-01, http://www.100md.com
单位：罗攀(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041); 岑瑛(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041); 赵景华(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041); 于蓉(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041)
关键词：肝素；创伤；烧伤；免疫
华西医学000116 摘 要：为了研究肝素对Ⅱ度烧伤大鼠免疫功能的影响，我们将10只SD大鼠随机分为两组，制成20%面积深Ⅱ度烧伤后，分别给予肝素及生理盐水皮下注射，一天一次治疗，进行免疫学检测。结果发现：肝素组淋巴细胞转化率显著提高，吞噬细胞吞噬功能明显增强，而溶血空斑实验则两组无显著性差异。提示肝素可增强细胞免疫及吞噬细胞功能，但对体液免疫无影响。
分类号：R644 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1002-0179(2000)01-0032-02
The Effect of Heparin on Immune Function of Second Degree Burned Rats
LUO Pan CEN Ying ZHAO Jing-hua
(Department of Plastic and Burn Surgery，First University Hospital，West China University of Medical Sciences，Chengdu，610041)
Abstract：In order to study the effect of heparin on immune function of second degree burned rats，a randomized controlled trial was designed.After 20% of total body surface area，deep second-degree burn was created.10 SD rats were treated with heparin，or subcutaneous injection of normal saline. The immune function of the rats was tested.The heparin group showed significant improvement in lymphocyte transformation ratio and phagocytotic capacity of phagocyte，but the two groups had no significant difference on hemolytic plaque test.It was suggested that heparin could enhance the cellular immunity and phagocytotic activity of phagocyte，but had no influence on the humoral immunity.
, 百拇医药
Key words：Heparin；Burn；Trauma；Immunity▲
近年研究发现，肝素有一定的免疫调节作用〔1～3〕，但对于其免疫调节的范围尚不太清楚。本实验的目的在于从体液免疫、细胞免疫及单核巨噬细胞系统三个方面初步探讨肝素免疫调节的范围。
1 实验过程及方法
1.1 实验动物及材料 10只雌性SD大鼠由华西科大学实验动物中心提供，体重200g～260g。肝素钠注射液为常州生化千红制药有限公司生产，剂型为12500单位/支。
1.2 Ⅱ度烧伤动物模型的建立 大鼠在5%水合氯醛腹腔麻醉下用脱毛剂脱去背部的毛，清水洗净脱毛剂，揩干，用90℃衡温水蒸气烫其背部10秒造成20%面积深Ⅱ度烧伤(组织学证实)。
1.3 实验方法 大鼠随机分为实验组与对照组两组，每组5只。于烧伤前一天腹腔注射10%绵羊红细胞悬液1ml。两组均于烧伤后1小时腹腔注射生理盐水1ml，次日起每日皮下注射生理盐水1ml。实验组于生理盐水中加入25u肝素。伤后第三天将大鼠用断颈法处死。
, 百拇医药
1.4 实验指标
1.4.1 淋巴细胞转化实验(LT) 无菌条件下取大鼠脾细胞，用Hank’s液洗涤两次，无血清RPMI1640洗涤一次，用5%FCS-RPMI1640调制成2×106/ml组胞悬液。将细胞悬液加入96孔平底细胞培养板，100μl/孔，每孔作3复孔，其中2孔加刺激剂，为转化孔，加入ConA，2ng/孔。另一孔不加刺激剂，作为对照孔。平板置37℃，5%CO2条件培养72小时。终止培养前14小时，加入3H-TdR，luCi/孔。用多头细胞收集仪收集细胞，测CPM值，计算复孔平均值。
1.4.2 溶血空斑实验(PFC) 无菌条件下取大鼠脾细胞，用Hank’s液洗涤两次，无血清RPMI1640洗涤一次。用5%FCS-RPMI1640调制成5×105/ml细胞悬液。分别取脾细胞悬液100μl，10%绵羊红细胞50μl，补体50μl，RPMI1640 100μl，混匀加入两个小室内，孵育1小时(37℃)。计空斑数。
, 百拇医药
1.4.3 吞噬实验 无菌条件下取腹腔巨噬细胞，加腹腔液2～3滴于一张清洁玻片上，用等量的1%鸡红细胞悬液滴于玻片上，摇晃均匀。置玻片于平皿内盖好，37℃条件下放置3小时后取出，在生理盐水内涮洗二次，洗去未吸附的细胞。自然干燥后，瑞氏染色，油镜观察结果。计算吞噬百分率(100个巨噬细胞中吞有鸡红细胞者所占比率)。
1.4.4 副作用观察 每日观察大鼠创面及排泄物，检查有无出血现象。
1.5 本实验均采用t检验进行统计学分析
2 实验结果
2.1 淋巴细胞转化实验 结果见表1。显示实验组淋巴细胞转化为淋巴母细胞进行增殖的数量明显高于对照组(P<0.005)。提示实验组的细胞免疫水平高于对照组。
2.2 溶血空斑试验(PFC试验) 试验结果如表2所示。经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。提示实验组体液免疫水平与对照组无差异。
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2.3 吞噬试验 结果如表3所示。实验组较对照组巨噬细胞吞噬功能明显增强(P<0.05)，提示肝素可增强巨噬细胞吞噬功能。
2.4 每日观察大鼠创面及排泄物，未发现出血现象。
表1.淋巴细胞转化试验 组别
增殖率(%)
均数(X，%)
标准差(S，%)
P
实验组
58
72
76
, 百拇医药
70
61
67.4
7.60
<0.05
对照组
46
56
52
26
43
44.6
11.54
, 百拇医药
表2.溶血空斑试验 组别
空斑数
均数(X，%)
标准差(S，%)
P
实验组
180
200
150
170
130
166
27.01
, 百拇医药
>0.05
对照组
140
180
160
110
190
156
32.09
表3.吞噬试验 组别
吞噬百分率(%)
均数(X，%)
标准差(S，%)
, 百拇医药
P
实验组
92
87
80
94
79
86.4
6.80
<0.05
对照组
83
76
, http://www.100md.com 81
73
72
77.0
4.85
3 讨论
通过对Ⅱ度烧伤大鼠的随机对照研究，可得出以下结论：肝素可增强机体细胞免疫水平及巨噬细胞吞噬能力，但对体液免疫无影响。
淋巴细胞转化试验是指T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原如PHA、ConA等工特异性抗原刺激后，能转化为淋巴母细胞，随后可发生分裂增殖。根据T细胞的转化率可判断机体细胞免疫水平。溶血空斑试验是一种利用补体介导的抗原抗体反应检测抗体形成细胞的方法，常作为检测体液免疫的指标。吞噬试验则是检测巨噬细胞吞噬能力，反映了机体非特异性免疫功能水平〔4〕。本试验结果显示，两组间淋巴细胞转化及吞噬试验有显著性差异，而溶血空斑试验则无明显差异(P>0.05)，提示肝素有增强巨噬细胞功能及细胞免疫功能的作用，而对体液免疫则无影响。
, 百拇医药
Zellweger R等〔1〕证实肝素可提高出血性休克小鼠脾细胞释放IL-2和IL-3的能力及促进脾和腹膜巨噬细胞释放IL-6的能力恢复。Dziarski R等〔2〕亦观察临床用量肝素可增强鼠T细胞增殖反应。
研究发现，肝素可增强IL-1对IL-1依赖的辅助T细胞克隆的促生长作用，也可增强这些细胞上IL-1受体的表达。提示肝素可直接与T细胞反应，上调其IL-1受体表达，从而增强其对IL-1的反应性〔3〕。研究已证实，淋巴细胞表面存在肝素结合位点〔5〕。其中CD2和CD4淋巴细胞表面上的肝素结合位点已被确定〔6，7〕。但肝素如何与淋巴细胞结合，以及结合后如何具体调节淋巴细胞功能目前仍不太淋楚，尚有待进一步研究。
本实验采用的剂量标准明显低于临床抗凝剂是。通过每日观察创面及排泄物，未发现有出血现象，表明此剂量下不易引起出血的副作用。■
, 百拇医药
参考文献：
[1] Zellweger R，Ayala A，Zhu XL et al.A novel nonanticoagulant heparin improves splenocyte and peritoneal macrophage immune function after trauma-hemorrhage and resusciation.J Surg Res，1995；59(1)∶211～218.
[2] Dziarski R.Enhancement of mixed leukocyte reaction and cytotoxic antitumor responses by heparin.J Immunol，1989；143∶356～365.
[3] Dziarski R.Synergirtic enhancemet of T cell response and interleukin-1 receptor expression by interleukin-1 and heparin of dextran sulfate.Cell Immunol，1992；145∶100～110.
, 百拇医药
[4] 郑武飞，主编：医学免疫学，第一版，北京：人民卫生出版社，1989，126～128。
[5] Parish CR，Snowedn JM.Lymphocytes express a diverse array of specific receptors for sulfated polysaccharides.Cell Immunol.1985；91∶201～204.
[6] Parish CR，Mcphun V，Warren HS.Is a natural ligand of the T lymphocyte CD2 molecule a sulfated carbohyadrate？J Immunol，1988；141∶3498.
[7] Lederman S，Gulick R，CHess L.Dextran sulfate and Heparin interact with CD4 molecules to inhibit the binding of coat protein (gp120) of HIV.J Immumol，1989；143(4)∶1149～1154.
收稿日期：1999-12-01, http://www.100md.com