重新认识乙型肝炎防治中的几个问题
作者：张定凤
单位：张定凤(400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所)
关键词：
中华医学杂志000101 乙型肝炎仍为当前危害我国广大人民健康的常见病、多发病，部分病人发展成为肝硬化及肝癌，危及生命。近年来，由于核苷酸类似物抗乙型肝炎病毒(HBV)取得进展，最近对乙型肝炎的发病机理及病毒清除规律也有新的发现，使我们不得不重新认识防治乙型肝炎的有关问题。
一、HBV慢性持续感染的原因是清除病毒能力不足，还是抑制病毒复制能力低下？
采用拉美夫定治疗乙型肝炎，测定HBV的动力学改变，人体血浆内HBV的半衰期为24 h，平均存活期为34.6 h，平均病毒繁殖周期为24.7 h，每日病毒更新率为50%，每日病毒繁殖量可达1011拷贝[1]。应用爱德和维(Adefovir)治疗乙型肝炎，发现乙型肝炎病毒的清除呈双相性。第1相为迅速清除期，HBV在血浆中的半衰期为1.1±0.3 d，每天清除游离病毒达48%。第2相为缓慢清除期，HBV的半衰期为18±7 d，反映了感染的肝细胞消失的状况[2]。一般而言，病人血浆中HBV水平取决于病毒复制速率、机体制约病毒复制的调节作用以及人体清除病毒的能力。但从上述资料看来，不论病人对乙型肝炎病毒的免疫状况如何，均能迅速清除血浆中的病毒，因此，控制乙型肝炎病毒感染的关键似在于加强机体制约机制，抑制病毒复制。
, http://www.100md.com
二、抑制病毒复制的关键是细胞毒性T细胞，还是细胞因子？
长期以来，认为细胞介导免疫，特别是细胞毒性T细胞是造成肝炎患者肝脏免疫损害及清除病毒的关键。近年来，一系列报道发现一些细胞因子，特别是IFNγ、肿瘤坏死因子α及白细胞介素2，在转基因小鼠的肝组织内可以减低HBV信使RNA含量，这可能是加速胞浆内信使RNA降解的结果。细胞毒性T细胞识别特异抗原后分泌的IFNγ及肿瘤坏死因子α，可以通过非细胞溶解性清除病毒基因产物，包括肝内核壳蛋白及病毒复制中间产物[3]。最近，在猩猩的急性HBV感染的实验中，进行了连续的肝穿刺活检、免疫组化及核酸电泳分析，发现肝内HBV DNA，包括松弛环状DNA及cccDNA，均于肝内出现T细胞浸润及出现肝损害前完全消失，说明感染细胞核内的cccDNA及细胞浆中HBV复制中间体均可通过非细胞病毒病变性抗病毒机制清除，主要为通过细胞因子的作用[4]。这一发现引起了学者们的广泛注意，改变了过去认为清除病毒主要通过CD8+T细胞破坏感染的肝细胞的观点，但对细胞因子如何清除病毒的机理仍有待深入研究。
, 百拇医药
三、肝脏仅仅是靶器官，还是免疫器官？
近年来的研究发现，肝细胞不仅仅是效应T细胞攻击的靶细胞，而且是免疫反应中活化的免疫调节细胞，利用肝细胞膜的组织相容抗原、粘附分子及细胞因子的受体表达，可以成为辅助细胞对细胞免疫起调节作用[5]。最近的研究证明，肝组织的肝实质细胞、Kuffer细胞、Pit细胞(肝内NK细胞)以及窦状隙内皮细胞，激活后可以产生多种细胞因子。我们实验室发现肝实质细胞除产生Fas及TNF受体外，还和T细胞一样，可以产生FasL及TNF-α[6]。HBV的X基因对肝细胞FasL表达有激活作用[7]。内毒素及干扰素γ可激活HepG2细胞表达TNF-α。TNF-α以及内毒素也可激活HepG2细胞表达Fas-L。内毒素还可激活Kuffer细胞表达IFNγ、TNF-α、IL-4及IL-12等，激活窦状隙内皮细胞表达FasL[8]。激活Fas及TNF受体，不仅仅是决定细胞存亡，根据细胞内信号传导系统及细胞内状况不同，还可能促进细胞再生，或者通过JNK激活其他信号系统[9]。上述猩猩急性HBV感染的HBV DNA早期清除，显然为肝组织内各种细胞成份的相互作用，通过细胞因子及TNF受体系统，发挥了非溶细胞性清除病毒作用。有人发现核心启动子对TNF-α、IFNγ及IFNα敏感[10]。核心启动子是复制的关键性调节因子，调节3.5kb和3.4kb mRNA合成。抑制核心启动子可以抑制HBV DNA的合成。最近，发现肝脏局部产生的IFNγ及TNF-α可通过控制HBV RNA的 3个结合蛋白P45、P39及P26的水平，影响HBV RNA的转录及核内HBV RNA的释放[11]。
, 百拇医药
四、HBV的低复制状态
HBV低复制状态时，患者血清中HBV DNA用通常斑点杂交法不能测出，而用PCR法检测HBV DNA及复制中间体为阳性，血清 HBeAg阴性，HBsAg阳性，也可阴性，见于急性肝炎恢复期，甚至出现抗HBs后；核苷酸类似物治疗后也可以出现一个较长时期低复制状态；还包括目前临床上常见的大量HBsAg阳性无症状性携带者，肝功能可以正常或者波动。过去常认为是HBV DNA和宿主基因整合的结果。最近，有人采用HBV DNA不同区域的RT-PCR，包括HBV-DR区引物，以判定HBV DNA是处于复制状态还是和宿主基因整合，发现血清HBsAg阴性患者也可出现HBV DNA复制的中间产物，而且DR重变区完整，认为HBV DNA处于低复制状态。低复制状态的HBV DNA有无变异，目前尚不了解，同时感染HIV的患者伴HBV DNA低复制状态发现有基因片段缺失。低复制状态的HBV DNA多数处于肝内，肝外是否也有HBV DNA低复制，有待进一步研究。HBV低复制状态中，部分肝细胞仍有病毒抗原表达，可以激发机体免疫应答及Fas及FasL表达，造成肝细胞损害，虽然肝功能正常，仍有少数人进入肝硬化或并发肝癌。乙型肝炎患者血清HBsAg转为阴性，多数人为康复指征，少数有HBV DNA低复制者也可并发肝癌[12]。HBV DNA低复制状态的机理尚不完全了解。病毒的基因变异可以导致病毒复制能力减低，如Lamivudine治疗中出现的YMDD变异株。另外，宿主因素可能更为重要。核酸类似物治疗后的HBV DNA低复制状态，如不出现血清HBe Ag/抗HBe转换，停药后病毒复制迅速反跳，而急性肝炎恢复后的低复制状态，多数呈稳定低水平，提示机体免疫或肝细胞的活性状态对控制病毒复制有重要作用。
, 百拇医药
总之，由于核苷酸类似物有效抗HBV的药物不断涌现，DNA疫苗等生物治疗取得了可喜的苗头，为今后清除HBV感染提供了可能。最近，对HBV DNA清除规律的进一步认识，也为今后探索有效的治疗途径提供了基础。但要获取抗病毒治疗完全有效的措施，今后仍应加强下列领域的研究：
1.加强非溶细胞性清除病毒的机制研究。目前，认为细胞因子，特别是TNF-α及IFNγ有重要作用，但其实际作用的分子生物学基础仍然不了解，TNF-α在重症肝炎发病中认为与诱导肝细胞凋亡有关，肝切除患者血清中TNF-α水平又反映肝细胞再生的速率，而目前又认为和清除HBV DNA及其复制中间体有关，其细胞内信号传递系统十分复杂，如何发挥上述三重作用，枢纽在什么地方，目前尚不了解。阻断IFNγ后，可以消除细胞毒性T细胞的抗HBV作用，但采用IFNγ治疗乙型肝炎抑制其复制状态是无效的，甚至不能加强IFNα的抗病毒作用。IFNγ可能作为一个细胞活化的标志，各种细胞因子在细胞内的信号传递中的 stat蛋白，常有交叉反应。所以，进一步了解细胞因子清除病毒的机理，了解肝的各种细胞成份活化状态对清除病毒的作用，采用细胞因子或采用调节肝内各种细胞活性状态，或许对今后治疗乙型肝炎有一定帮助。
, 百拇医药
2.加强对HBV低复制状态的机理研究，探索病毒因素及宿主因素的相互关系，了解部分肝细胞支持HBV DNA低度复制的生物学基础和细胞间差异，探索进一步彻底清除病毒的规律，迎接彻底治愈乙型肝炎的新世纪的到来。■
参考文献：
[1]Zeujem S，de Man RA，Honkoop P，et al. Dynamics of hepatitis B virus infection in vivo. J Hepatol，1997，27:431-436.
[2]Tsiang M,Rooney JF, Toolc JJ，et al. Biphasic clearance kinetics of hepatitis B virus from patients during adefovir dipivoxil therapy.Hepatology，1999，29:1836-1869.
, 百拇医药
[3]Chisari FV. Hepatitis B virus transgenic mice: Insight into the virus and disease.Hepatology，1995，22:1316-1325.
[4]Guidotti LG, Rochford R, Chung J, et al. Viral clearance without destruction of infected cells during acute HBV infection.Science，1999，248:825-828.
[5]Volpes R，Van den Oord JJ，Desmet VJ. Can hepatocytes serve as “activated ” immunomodulating cells in the immune response?J Hepatol，1992, 16:228-240.
, 百拇医药
[6]秦波，张定凤，马英, 等.乙型肝炎患者肝组织Fas/FasL表达及其在肝细胞凋亡中的作用. 中华肝脏病杂志，1999, 5:88-90.
[7]张大志，张定凤，陶小红，等. 乙肝病毒X基因对肝细胞Fas-L表达的激活作用. 中华肝脏病杂志，1999，7：67-68.
[8]Muschen M, Warskulat U, Douillard P，et al. Regulation of CD95 (APO-1/Fas) receptor and ligand expression by lipopolysaccharide and dexamethasone in parenchymal and nonparenchymal rat liver cells.Hepatology，1998, 27:200-208.
[9]Magnusson C, Vaux DL. Signalling by CD95 and TNF receptor: Not only life and death.Immunol Cell Biol 1999, 77:41-46.
, http://www.100md.com
[10]Kojiel MJ. Cytokines in viral hepatitis. Semin Liver Dis，1999, 19:156-169.
[11]Heise T, Guidotti LG, Cavanaugh VJ. Hepatitis B virus-Binding Proteins associated with cytokine-induced clearance of viral RNA from the liver of transgene mice.J Virol，1999, 73:474-478.
[12]Liaw YF, Chen YC, Sheen LS. Spontaneous clearance of hepatitis B surface antigen in chronic hepatitis B virus infection eonters a favorable response.Hepatology，1999, 29:296-297.
收稿日期：1999-10-28, http://www.100md.com
单位：张定凤(400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所)
关键词：
中华医学杂志000101 乙型肝炎仍为当前危害我国广大人民健康的常见病、多发病，部分病人发展成为肝硬化及肝癌，危及生命。近年来，由于核苷酸类似物抗乙型肝炎病毒(HBV)取得进展，最近对乙型肝炎的发病机理及病毒清除规律也有新的发现，使我们不得不重新认识防治乙型肝炎的有关问题。
一、HBV慢性持续感染的原因是清除病毒能力不足，还是抑制病毒复制能力低下？
采用拉美夫定治疗乙型肝炎，测定HBV的动力学改变，人体血浆内HBV的半衰期为24 h，平均存活期为34.6 h，平均病毒繁殖周期为24.7 h，每日病毒更新率为50%，每日病毒繁殖量可达1011拷贝[1]。应用爱德和维(Adefovir)治疗乙型肝炎，发现乙型肝炎病毒的清除呈双相性。第1相为迅速清除期，HBV在血浆中的半衰期为1.1±0.3 d，每天清除游离病毒达48%。第2相为缓慢清除期，HBV的半衰期为18±7 d，反映了感染的肝细胞消失的状况[2]。一般而言，病人血浆中HBV水平取决于病毒复制速率、机体制约病毒复制的调节作用以及人体清除病毒的能力。但从上述资料看来，不论病人对乙型肝炎病毒的免疫状况如何，均能迅速清除血浆中的病毒，因此，控制乙型肝炎病毒感染的关键似在于加强机体制约机制，抑制病毒复制。
, http://www.100md.com
二、抑制病毒复制的关键是细胞毒性T细胞，还是细胞因子？
长期以来，认为细胞介导免疫，特别是细胞毒性T细胞是造成肝炎患者肝脏免疫损害及清除病毒的关键。近年来，一系列报道发现一些细胞因子，特别是IFNγ、肿瘤坏死因子α及白细胞介素2，在转基因小鼠的肝组织内可以减低HBV信使RNA含量，这可能是加速胞浆内信使RNA降解的结果。细胞毒性T细胞识别特异抗原后分泌的IFNγ及肿瘤坏死因子α，可以通过非细胞溶解性清除病毒基因产物，包括肝内核壳蛋白及病毒复制中间产物[3]。最近，在猩猩的急性HBV感染的实验中，进行了连续的肝穿刺活检、免疫组化及核酸电泳分析，发现肝内HBV DNA，包括松弛环状DNA及cccDNA，均于肝内出现T细胞浸润及出现肝损害前完全消失，说明感染细胞核内的cccDNA及细胞浆中HBV复制中间体均可通过非细胞病毒病变性抗病毒机制清除，主要为通过细胞因子的作用[4]。这一发现引起了学者们的广泛注意，改变了过去认为清除病毒主要通过CD8+T细胞破坏感染的肝细胞的观点，但对细胞因子如何清除病毒的机理仍有待深入研究。
, 百拇医药
三、肝脏仅仅是靶器官，还是免疫器官？
近年来的研究发现，肝细胞不仅仅是效应T细胞攻击的靶细胞，而且是免疫反应中活化的免疫调节细胞，利用肝细胞膜的组织相容抗原、粘附分子及细胞因子的受体表达，可以成为辅助细胞对细胞免疫起调节作用[5]。最近的研究证明，肝组织的肝实质细胞、Kuffer细胞、Pit细胞(肝内NK细胞)以及窦状隙内皮细胞，激活后可以产生多种细胞因子。我们实验室发现肝实质细胞除产生Fas及TNF受体外，还和T细胞一样，可以产生FasL及TNF-α[6]。HBV的X基因对肝细胞FasL表达有激活作用[7]。内毒素及干扰素γ可激活HepG2细胞表达TNF-α。TNF-α以及内毒素也可激活HepG2细胞表达Fas-L。内毒素还可激活Kuffer细胞表达IFNγ、TNF-α、IL-4及IL-12等，激活窦状隙内皮细胞表达FasL[8]。激活Fas及TNF受体，不仅仅是决定细胞存亡，根据细胞内信号传导系统及细胞内状况不同，还可能促进细胞再生，或者通过JNK激活其他信号系统[9]。上述猩猩急性HBV感染的HBV DNA早期清除，显然为肝组织内各种细胞成份的相互作用，通过细胞因子及TNF受体系统，发挥了非溶细胞性清除病毒作用。有人发现核心启动子对TNF-α、IFNγ及IFNα敏感[10]。核心启动子是复制的关键性调节因子，调节3.5kb和3.4kb mRNA合成。抑制核心启动子可以抑制HBV DNA的合成。最近，发现肝脏局部产生的IFNγ及TNF-α可通过控制HBV RNA的 3个结合蛋白P45、P39及P26的水平，影响HBV RNA的转录及核内HBV RNA的释放[11]。
, 百拇医药
四、HBV的低复制状态
HBV低复制状态时，患者血清中HBV DNA用通常斑点杂交法不能测出，而用PCR法检测HBV DNA及复制中间体为阳性，血清 HBeAg阴性，HBsAg阳性，也可阴性，见于急性肝炎恢复期，甚至出现抗HBs后；核苷酸类似物治疗后也可以出现一个较长时期低复制状态；还包括目前临床上常见的大量HBsAg阳性无症状性携带者，肝功能可以正常或者波动。过去常认为是HBV DNA和宿主基因整合的结果。最近，有人采用HBV DNA不同区域的RT-PCR，包括HBV-DR区引物，以判定HBV DNA是处于复制状态还是和宿主基因整合，发现血清HBsAg阴性患者也可出现HBV DNA复制的中间产物，而且DR重变区完整，认为HBV DNA处于低复制状态。低复制状态的HBV DNA有无变异，目前尚不了解，同时感染HIV的患者伴HBV DNA低复制状态发现有基因片段缺失。低复制状态的HBV DNA多数处于肝内，肝外是否也有HBV DNA低复制，有待进一步研究。HBV低复制状态中，部分肝细胞仍有病毒抗原表达，可以激发机体免疫应答及Fas及FasL表达，造成肝细胞损害，虽然肝功能正常，仍有少数人进入肝硬化或并发肝癌。乙型肝炎患者血清HBsAg转为阴性，多数人为康复指征，少数有HBV DNA低复制者也可并发肝癌[12]。HBV DNA低复制状态的机理尚不完全了解。病毒的基因变异可以导致病毒复制能力减低，如Lamivudine治疗中出现的YMDD变异株。另外，宿主因素可能更为重要。核酸类似物治疗后的HBV DNA低复制状态，如不出现血清HBe Ag/抗HBe转换，停药后病毒复制迅速反跳，而急性肝炎恢复后的低复制状态，多数呈稳定低水平，提示机体免疫或肝细胞的活性状态对控制病毒复制有重要作用。
, 百拇医药
总之，由于核苷酸类似物有效抗HBV的药物不断涌现，DNA疫苗等生物治疗取得了可喜的苗头，为今后清除HBV感染提供了可能。最近，对HBV DNA清除规律的进一步认识，也为今后探索有效的治疗途径提供了基础。但要获取抗病毒治疗完全有效的措施，今后仍应加强下列领域的研究：
1.加强非溶细胞性清除病毒的机制研究。目前，认为细胞因子，特别是TNF-α及IFNγ有重要作用，但其实际作用的分子生物学基础仍然不了解，TNF-α在重症肝炎发病中认为与诱导肝细胞凋亡有关，肝切除患者血清中TNF-α水平又反映肝细胞再生的速率，而目前又认为和清除HBV DNA及其复制中间体有关，其细胞内信号传递系统十分复杂，如何发挥上述三重作用，枢纽在什么地方，目前尚不了解。阻断IFNγ后，可以消除细胞毒性T细胞的抗HBV作用，但采用IFNγ治疗乙型肝炎抑制其复制状态是无效的，甚至不能加强IFNα的抗病毒作用。IFNγ可能作为一个细胞活化的标志，各种细胞因子在细胞内的信号传递中的 stat蛋白，常有交叉反应。所以，进一步了解细胞因子清除病毒的机理，了解肝的各种细胞成份活化状态对清除病毒的作用，采用细胞因子或采用调节肝内各种细胞活性状态，或许对今后治疗乙型肝炎有一定帮助。
, 百拇医药
2.加强对HBV低复制状态的机理研究，探索病毒因素及宿主因素的相互关系，了解部分肝细胞支持HBV DNA低度复制的生物学基础和细胞间差异，探索进一步彻底清除病毒的规律，迎接彻底治愈乙型肝炎的新世纪的到来。■
参考文献：
[1]Zeujem S，de Man RA，Honkoop P，et al. Dynamics of hepatitis B virus infection in vivo. J Hepatol，1997，27:431-436.
[2]Tsiang M,Rooney JF, Toolc JJ，et al. Biphasic clearance kinetics of hepatitis B virus from patients during adefovir dipivoxil therapy.Hepatology，1999，29:1836-1869.
, 百拇医药
[3]Chisari FV. Hepatitis B virus transgenic mice: Insight into the virus and disease.Hepatology，1995，22:1316-1325.
[4]Guidotti LG, Rochford R, Chung J, et al. Viral clearance without destruction of infected cells during acute HBV infection.Science，1999，248:825-828.
[5]Volpes R，Van den Oord JJ，Desmet VJ. Can hepatocytes serve as “activated ” immunomodulating cells in the immune response?J Hepatol，1992, 16:228-240.
, 百拇医药
[6]秦波，张定凤，马英, 等.乙型肝炎患者肝组织Fas/FasL表达及其在肝细胞凋亡中的作用. 中华肝脏病杂志，1999, 5:88-90.
[7]张大志，张定凤，陶小红，等. 乙肝病毒X基因对肝细胞Fas-L表达的激活作用. 中华肝脏病杂志，1999，7：67-68.
[8]Muschen M, Warskulat U, Douillard P，et al. Regulation of CD95 (APO-1/Fas) receptor and ligand expression by lipopolysaccharide and dexamethasone in parenchymal and nonparenchymal rat liver cells.Hepatology，1998, 27:200-208.
[9]Magnusson C, Vaux DL. Signalling by CD95 and TNF receptor: Not only life and death.Immunol Cell Biol 1999, 77:41-46.
, http://www.100md.com
[10]Kojiel MJ. Cytokines in viral hepatitis. Semin Liver Dis，1999, 19:156-169.
[11]Heise T, Guidotti LG, Cavanaugh VJ. Hepatitis B virus-Binding Proteins associated with cytokine-induced clearance of viral RNA from the liver of transgene mice.J Virol，1999, 73:474-478.
[12]Liaw YF, Chen YC, Sheen LS. Spontaneous clearance of hepatitis B surface antigen in chronic hepatitis B virus infection eonters a favorable response.Hepatology，1999, 29:296-297.
收稿日期：1999-10-28, http://www.100md.com