细胞凋亡与周围神经损伤后运动神经元死亡
作者：张文明 朱维钦 林建华
单位：福建医科大学附属第一医院骨科 福州 350005
关键词：
中华创伤杂志000117 凋亡是一种完全不同于坏死的细胞死亡方式，是由于内、外因素激发细胞本身自杀程序引起的，又称程序性细胞死亡。细胞凋亡是多细胞生物生命过程中不可缺少的一部分，与细胞增殖、分化等一样，是个体发育成熟所必需的。这种在生理状态下发生的凋亡可以使一个组织的细胞数保持动态平衡，维持生物个体的内稳态。凋亡在脊椎动物中枢及周围神经系统发育过程中也起重要作用，多种类型的神经元在与它们的靶细胞形成突触联系后不久，约半数或更多的神经元发生凋亡。这种生理性凋亡可持续至出生后的一段时间。在发育过程中存活的运动神经元也可在幼年和成年时受各种因素如病毒感染、缺血、创伤等影响发生病理性凋亡。有研究表明，周围神经轴突切断后，可诱导部分运动神经元发生凋亡[1，2]。
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一、凋亡的形态学特征
细胞死亡可分为细胞坏死和细胞凋亡两种方式。1972年Kerr等首先描述了凋亡形态学特征。此后，这种病理现象得到广泛的确认，至90年代已成为多学科的研究热点。凋亡与坏死最本质的区别就是前者是一个主动、有程序的细胞死亡过程，需要精确的基因转录和蛋白质合成。其特征性变化是细胞的DNA核小体间裂解，DNA降解成许多大小不一的寡核苷酸片段，其末端为3'-羟基，在琼脂糖电泳上呈特征性的梯形DNA条带，这些条带是由不同倍数的180～200个碱基对的核苷酸片段组成的。凋亡的形态学特征包括:早期细胞表面皱缩，体积变小，与邻近细胞正常连接减少；细胞膜发泡或芽变，胞浆浓缩，内质网扩张并与细胞膜融合；染色质固缩，浓聚于核膜附近，形成月芽形结构。随后细胞膜内陷，把细胞裂解成大小不等的小碎片，由膜包裹，内含碎裂的染色质和细胞器，称为凋亡小体。凋亡小体随后被邻近的细胞吞噬、消化。周围组织未发生炎症反应。而坏死的形态学特征是细胞在各种因素影响下细胞膜通透性增加，导致细胞及其细胞器肿胀，溶酶体破裂，最终细胞膜破裂和细胞结构崩解，细胞内容物外溢引起周围炎症反应[2]。
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二、凋亡细胞的检测方法有如下几种[2-4]
1.利用其形态学特征判断细胞凋亡。
2.凝胶电泳上呈现特征性梯形DNA条带判断细胞凋亡。
3.原位末端标记法检测DNA片段判断凋亡。
4.流式细胞仪检测凋亡细胞。
5.免疫组织化学法检测神经元凋亡特异蛋白。
三、运动神经元的生理性死亡和轴突切断后的病理性死亡
脊椎动物脊髓运动神经元在正常发育过程中，约半数会发生程序性细胞死亡。细胞死亡发生在神经元支配靶区阶段，推测是一种竞争失败溃变死亡。没有与靶区建立突触联系的神经元未能从靶细胞获得足够量的特异性神经营养因子，而这些因子是神经元存活所必需。也有人认为，这是神经元自身根据生物钟启动死亡程序合成一种杀手蛋白引起的，神经营养因子可避免这种现象发生。这种生理性神经元凋亡可延续至动物出生后一段时间。
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轴突是整个神经元的一部分，轴突损伤实质是一种细胞损伤，必然影响相应的神经元胞体，这反映在被称为"轴突反应"的胞体形态学和生化改变上。轴突损伤部位、程度、动物年龄、种属不同，轴突反应相差很大。轻者胞体短暂退变后很快进入再生，重者可引起细胞死亡。动物年龄越小，神经元胞体对轴突损伤反应越敏感。实验切断新生大鼠面神经，可诱导大量运动神经元死亡。利用原位标记DNA片段(Tunel技术)，在轴突切断后12～16 h即可检测到DNA快速裂解成寡核苷酸片段，说明凋亡机制参与了神经元死亡。凋亡细胞的出现与甲酚紫染色神经元数目的大量减少也相一致。B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)是一种凋亡抑制基因，其编码的膜相关蛋白可抑制细胞死亡，在过度表达Bcl-2的转基因鼠上进行同样实验，结果在实验侧与对侧都未检测到凋亡的神经元[5，6]。实验也表明，无论生理性细胞死亡或者轴突损伤引起运动神经元死亡均需要主动的基因表达和蛋白质及RNA合成，使用蛋白质和RNA合成抑制剂可明显减少自然发生和轴突损伤诱导的运动神经元死亡[7]。成年动物轴突损伤是否引起运动神经元死亡，仍有争议。不同实验设计有不同结果，面神经、坐骨神经、颈神经根切断不引起运动神经元死亡；神经根性撕脱伤和非常靠近脊髓(<4 mm)的根性切断伤可引起相应节段脊髓运动神经元死亡[8-10]。但其死亡性质未见研究报道。
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四、轴突损伤诱导运动神经元死亡的可能机制与保护方法
体外培养的运动神经元在神经营养因子撤离情况下可发生凋亡，而且神经系统正常发育过程大量神经元凋亡也发生在神经元与靶细胞建立突触联系阶段。因此，推测神经元存活需要来自靶器官的某些特异性的神经营养成分。轴突切断后使运动神经元与靶器官失去联系，新生和幼年动物神经元死亡可能是缺乏逆行运输的各种靶源性神经营养因子。轴突损伤后应用神经营养因子能保护和减轻运动神经元死亡也支持这种推测。同时，成年动物轴突切断时保留足够长度的近端轴突对脊髓运动神经元存活有重要意义，因为残端轴突的雪旺细胞可分泌足够量的神经营养因子，这些因子是神经元存活所必需的。在颈神经根性撕脱伤诱导运动神经元死亡实验中，使用各种神经营养因子也能明显减少神经元死亡[11-14]。这些都说明无论成年或幼年动物运动神经元存活都需要神经营养因子，但这些因子是如何调节细胞存活的尚不清楚。轴突切断伤是如何引起运动神经元死亡的详细机制还不明确。谷氨酸是中枢神经系统内主要兴奋性神经递质，它释放紊乱时通过谷氨酸受体N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)产生神经毒性作用。有研究认为，谷氨酸受体NMDA参与轴突损伤引起运动神经元死亡，应用NMDA受体拮抗剂可减轻轴突损伤引起的运动神经元死亡[7]。一氧化氮(NO)是一种有神经毒性的气体物质。NO是在一氧化氮合酶(NOS)催化下合成的。有证据表明，NO参与了轴突切断引起的运动神经元死亡。应用NOS抑制剂硝基精氨酸可使神经元死亡数目明显减少，应用神经营养因子也抑制了NOS的表达，使神经元免于死亡[9]。虽然轴突损伤诱导运动神经元死亡的详细机制尚不完全清楚，但从其触发因素的多相性提示，细胞的多个独立通路可能在死亡细胞中导致相似的形态学改变。一个强有力的证据便是抗凋亡基因Bcl-2能抑制极广泛的凋亡触发因素引发的神经元凋亡，说明细胞凋亡至少存在着一条最终通路。Bcl-2可能抑制了此通路上的一个中心环节，或者保护了细胞内凋亡程序的重要靶成分。研究表明，凋亡参与了轴突损伤诱导的运动神经元死亡。这对神经元损伤病理机制的认识是一大进步，有益于开辟保护被损伤神经元的新途径。目前，已有多种抗凋亡的药物和方法能保护实验动物受损神经元，使其免于死亡[15]。
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参考文献：
[1]Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267:1456-1462.
[2]Lo AC, Houenou LJ, Oppenheim RW. Apoptosis in the nervous system: morphological features, methods, pathology, and prevention. Arch Histol Cytol,1995, 58:139-149.
[3]Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R,et al. A new method to detect apoptosis in paraffin sections: in situ end-labelling of fragmented DNA.J Histochem Cytochem, 1993 , 41: 7-12.
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[4]Garrah JM, Bisby MA,Rossiter JP. Immunolabelling of the cytoplasm and processes of apoptotic facial motoneurons following axotomy in the neonatal rat. Acta Neuropathol Berl, 1998,95:223-228.
[5]De Bilbao F, Dubois Dauphin M. Time course of axotomy-induced apoptotic cell death in facial motoneurons of neonatal wild type and Bcl-2 transgenic mice. Neuroscience, 1996, 71:1111-1119.
[6]Rossiter JP, Riopelle RJ, Bisby MA. Axotomy-induced apoptotic cell death of neonatal rat facial motoneurons: time course analysis and relation to NADPH diaphorase activity. Exp Neurol, 1996 , 138:33-44.
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[7]Iwasaki Y,Ikeda K, Shiojima T, et al. CNQX prevents spinal motoneuron death following sciatic nerve transection in newborn rats. J Neurol Sci, 1995, 134:21-25.
[8]Yan Q, Matheson C, Lopez T, et al. The biological responses of axotomized adult motoneurons to brain-derived neurotrophic factor. J Neurosci, 1994,14:5281-5291.
[9]Wu W, Li L.Inhibition of nitric oxide synthase reduces motoneuron death due to spinal root avulsion. Neurosci Lett, 1993, 153:121-124.
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[10]Gu Y, Spasic Z, Wu W. The effects of remaining axons on motoneuron survival and NOS expression following axotomy in the adult rat. Dev Neurosci, 1997, 19:255-259.
[11]Tan SA, Deglon N, Zurn AD,et al. Rescue of motoneurons from axotomy-induced cell death by polymer encapsulated cells genetically engineered to release CNTF. Cell Transplant, 1996, 5:577-587.
[12]Houenou LJ, Oppenheim RW, Li L, et al. Regulation of spinal motoneuron survival by GDNF during development and following injury. Cell Tissue Res, 1996, 286: 219-223.
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[13]Curtis R, Adryan KM, Zhu Y, et al. Retrograde axonal transport of ciliary neurotrophic factor is increased by peripheral nerve injury. Nature, 1993, 365: 253-255.
[14]Li L, Wu W, Lin LH, et al. Rescue of adult mouse motoneurons from injury-induced cell death by glial cell line-derived neurotrophic factor. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92:9771-9775.
[15]Glicksman MA,Chiu AY, Dionne CA, et al. CEP-1347/KT7515 prevents motor neuronal programmed cell death and injury-induced dedifferentiation in vivo. J Neurobiol,1998,35:361-370.
收稿日期：1998-12-08, http://www.100md.com
单位：福建医科大学附属第一医院骨科 福州 350005
关键词：
中华创伤杂志000117 凋亡是一种完全不同于坏死的细胞死亡方式，是由于内、外因素激发细胞本身自杀程序引起的，又称程序性细胞死亡。细胞凋亡是多细胞生物生命过程中不可缺少的一部分，与细胞增殖、分化等一样，是个体发育成熟所必需的。这种在生理状态下发生的凋亡可以使一个组织的细胞数保持动态平衡，维持生物个体的内稳态。凋亡在脊椎动物中枢及周围神经系统发育过程中也起重要作用，多种类型的神经元在与它们的靶细胞形成突触联系后不久，约半数或更多的神经元发生凋亡。这种生理性凋亡可持续至出生后的一段时间。在发育过程中存活的运动神经元也可在幼年和成年时受各种因素如病毒感染、缺血、创伤等影响发生病理性凋亡。有研究表明，周围神经轴突切断后，可诱导部分运动神经元发生凋亡[1，2]。
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一、凋亡的形态学特征
细胞死亡可分为细胞坏死和细胞凋亡两种方式。1972年Kerr等首先描述了凋亡形态学特征。此后，这种病理现象得到广泛的确认，至90年代已成为多学科的研究热点。凋亡与坏死最本质的区别就是前者是一个主动、有程序的细胞死亡过程，需要精确的基因转录和蛋白质合成。其特征性变化是细胞的DNA核小体间裂解，DNA降解成许多大小不一的寡核苷酸片段，其末端为3'-羟基，在琼脂糖电泳上呈特征性的梯形DNA条带，这些条带是由不同倍数的180～200个碱基对的核苷酸片段组成的。凋亡的形态学特征包括:早期细胞表面皱缩，体积变小，与邻近细胞正常连接减少；细胞膜发泡或芽变，胞浆浓缩，内质网扩张并与细胞膜融合；染色质固缩，浓聚于核膜附近，形成月芽形结构。随后细胞膜内陷，把细胞裂解成大小不等的小碎片，由膜包裹，内含碎裂的染色质和细胞器，称为凋亡小体。凋亡小体随后被邻近的细胞吞噬、消化。周围组织未发生炎症反应。而坏死的形态学特征是细胞在各种因素影响下细胞膜通透性增加，导致细胞及其细胞器肿胀，溶酶体破裂，最终细胞膜破裂和细胞结构崩解，细胞内容物外溢引起周围炎症反应[2]。
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二、凋亡细胞的检测方法有如下几种[2-4]
1.利用其形态学特征判断细胞凋亡。
2.凝胶电泳上呈现特征性梯形DNA条带判断细胞凋亡。
3.原位末端标记法检测DNA片段判断凋亡。
4.流式细胞仪检测凋亡细胞。
5.免疫组织化学法检测神经元凋亡特异蛋白。
三、运动神经元的生理性死亡和轴突切断后的病理性死亡
脊椎动物脊髓运动神经元在正常发育过程中，约半数会发生程序性细胞死亡。细胞死亡发生在神经元支配靶区阶段，推测是一种竞争失败溃变死亡。没有与靶区建立突触联系的神经元未能从靶细胞获得足够量的特异性神经营养因子，而这些因子是神经元存活所必需。也有人认为，这是神经元自身根据生物钟启动死亡程序合成一种杀手蛋白引起的，神经营养因子可避免这种现象发生。这种生理性神经元凋亡可延续至动物出生后一段时间。
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轴突是整个神经元的一部分，轴突损伤实质是一种细胞损伤，必然影响相应的神经元胞体，这反映在被称为"轴突反应"的胞体形态学和生化改变上。轴突损伤部位、程度、动物年龄、种属不同，轴突反应相差很大。轻者胞体短暂退变后很快进入再生，重者可引起细胞死亡。动物年龄越小，神经元胞体对轴突损伤反应越敏感。实验切断新生大鼠面神经，可诱导大量运动神经元死亡。利用原位标记DNA片段(Tunel技术)，在轴突切断后12～16 h即可检测到DNA快速裂解成寡核苷酸片段，说明凋亡机制参与了神经元死亡。凋亡细胞的出现与甲酚紫染色神经元数目的大量减少也相一致。B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)是一种凋亡抑制基因，其编码的膜相关蛋白可抑制细胞死亡，在过度表达Bcl-2的转基因鼠上进行同样实验，结果在实验侧与对侧都未检测到凋亡的神经元[5，6]。实验也表明，无论生理性细胞死亡或者轴突损伤引起运动神经元死亡均需要主动的基因表达和蛋白质及RNA合成，使用蛋白质和RNA合成抑制剂可明显减少自然发生和轴突损伤诱导的运动神经元死亡[7]。成年动物轴突损伤是否引起运动神经元死亡，仍有争议。不同实验设计有不同结果，面神经、坐骨神经、颈神经根切断不引起运动神经元死亡；神经根性撕脱伤和非常靠近脊髓(<4 mm)的根性切断伤可引起相应节段脊髓运动神经元死亡[8-10]。但其死亡性质未见研究报道。
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四、轴突损伤诱导运动神经元死亡的可能机制与保护方法
体外培养的运动神经元在神经营养因子撤离情况下可发生凋亡，而且神经系统正常发育过程大量神经元凋亡也发生在神经元与靶细胞建立突触联系阶段。因此，推测神经元存活需要来自靶器官的某些特异性的神经营养成分。轴突切断后使运动神经元与靶器官失去联系，新生和幼年动物神经元死亡可能是缺乏逆行运输的各种靶源性神经营养因子。轴突损伤后应用神经营养因子能保护和减轻运动神经元死亡也支持这种推测。同时，成年动物轴突切断时保留足够长度的近端轴突对脊髓运动神经元存活有重要意义，因为残端轴突的雪旺细胞可分泌足够量的神经营养因子，这些因子是神经元存活所必需的。在颈神经根性撕脱伤诱导运动神经元死亡实验中，使用各种神经营养因子也能明显减少神经元死亡[11-14]。这些都说明无论成年或幼年动物运动神经元存活都需要神经营养因子，但这些因子是如何调节细胞存活的尚不清楚。轴突切断伤是如何引起运动神经元死亡的详细机制还不明确。谷氨酸是中枢神经系统内主要兴奋性神经递质，它释放紊乱时通过谷氨酸受体N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)产生神经毒性作用。有研究认为，谷氨酸受体NMDA参与轴突损伤引起运动神经元死亡，应用NMDA受体拮抗剂可减轻轴突损伤引起的运动神经元死亡[7]。一氧化氮(NO)是一种有神经毒性的气体物质。NO是在一氧化氮合酶(NOS)催化下合成的。有证据表明，NO参与了轴突切断引起的运动神经元死亡。应用NOS抑制剂硝基精氨酸可使神经元死亡数目明显减少，应用神经营养因子也抑制了NOS的表达，使神经元免于死亡[9]。虽然轴突损伤诱导运动神经元死亡的详细机制尚不完全清楚，但从其触发因素的多相性提示，细胞的多个独立通路可能在死亡细胞中导致相似的形态学改变。一个强有力的证据便是抗凋亡基因Bcl-2能抑制极广泛的凋亡触发因素引发的神经元凋亡，说明细胞凋亡至少存在着一条最终通路。Bcl-2可能抑制了此通路上的一个中心环节，或者保护了细胞内凋亡程序的重要靶成分。研究表明，凋亡参与了轴突损伤诱导的运动神经元死亡。这对神经元损伤病理机制的认识是一大进步，有益于开辟保护被损伤神经元的新途径。目前，已有多种抗凋亡的药物和方法能保护实验动物受损神经元，使其免于死亡[15]。
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参考文献：
[1]Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267:1456-1462.
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[5]De Bilbao F, Dubois Dauphin M. Time course of axotomy-induced apoptotic cell death in facial motoneurons of neonatal wild type and Bcl-2 transgenic mice. Neuroscience, 1996, 71:1111-1119.
[6]Rossiter JP, Riopelle RJ, Bisby MA. Axotomy-induced apoptotic cell death of neonatal rat facial motoneurons: time course analysis and relation to NADPH diaphorase activity. Exp Neurol, 1996 , 138:33-44.
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[7]Iwasaki Y,Ikeda K, Shiojima T, et al. CNQX prevents spinal motoneuron death following sciatic nerve transection in newborn rats. J Neurol Sci, 1995, 134:21-25.
[8]Yan Q, Matheson C, Lopez T, et al. The biological responses of axotomized adult motoneurons to brain-derived neurotrophic factor. J Neurosci, 1994,14:5281-5291.
[9]Wu W, Li L.Inhibition of nitric oxide synthase reduces motoneuron death due to spinal root avulsion. Neurosci Lett, 1993, 153:121-124.
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[10]Gu Y, Spasic Z, Wu W. The effects of remaining axons on motoneuron survival and NOS expression following axotomy in the adult rat. Dev Neurosci, 1997, 19:255-259.
[11]Tan SA, Deglon N, Zurn AD,et al. Rescue of motoneurons from axotomy-induced cell death by polymer encapsulated cells genetically engineered to release CNTF. Cell Transplant, 1996, 5:577-587.
[12]Houenou LJ, Oppenheim RW, Li L, et al. Regulation of spinal motoneuron survival by GDNF during development and following injury. Cell Tissue Res, 1996, 286: 219-223.
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[13]Curtis R, Adryan KM, Zhu Y, et al. Retrograde axonal transport of ciliary neurotrophic factor is increased by peripheral nerve injury. Nature, 1993, 365: 253-255.
[14]Li L, Wu W, Lin LH, et al. Rescue of adult mouse motoneurons from injury-induced cell death by glial cell line-derived neurotrophic factor. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92:9771-9775.
[15]Glicksman MA,Chiu AY, Dionne CA, et al. CEP-1347/KT7515 prevents motor neuronal programmed cell death and injury-induced dedifferentiation in vivo. J Neurobiol,1998,35:361-370.
收稿日期：1998-12-08, http://www.100md.com