空调系统冷却塔水分离军团菌报告
作者：王琳 李丽云 万超群
单位：王琳(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)；李丽云(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)；万超群(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)
关键词：冷却塔；军团菌；气溶胶
中国医科大学学报000110 摘要 目的：对沈阳市五家单位中央空调系统冷却塔水进行细菌学调查。方法：对空调系统冷却塔水进行细菌培养，并经细菌生化学、聚合酶链式反应(PCR)、核酸杂交技术(Southern法)等加以验证。结果：沈阳市外环境中有军团菌存在。结论：对这些细菌在冷却塔水中存在的意义进行分析，提出了改进设计、水质消毒监测、相应人群血清学调查的建议。
Report of Legionnaires′ Bacteria Isolated From Cooling Tower Water in Air-conditioning System
, http://www.100md.com
Wang Lin Li Liyun Wan Chaoqun
(Institiute of Respiratory Diseases,China Medical University,Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:Our purpose was to investigate the bacteriology of legionnaires′ disease(LD),and study the legionnaires′ bacteria in 5 central air-conditioning systems in shenyang. Methods:Bacteria culture,characteristic of biochemistry,polymerase chain reaction(PCR),and southern hybridization were used to show LDB in cooling tower water. Results:Two of central air-conditioning sysytem contain legionella pneumophila serogroup 5(Lp5). Conclusion:LDB exists in the environment of Shenyang. By analyzing the LDB in the cooling tower water,we find a good method to improve design,surveillant water quality,and detect antibody in the relative group's serum.
, 百拇医药
KEY WORDS cooling tower; legionnaires bacteria; aerosol
自Morris[1]从水及土壤中分离出军团菌，又相继在世界许多地区的自然环境及人工水体中证明有军团菌存在，尤以冷热水管及与中央空调装置有关的循环冷却水系统多见[2～5]。通过流动水或由冷却塔喷雾飘移而产生的气溶胶如受到军团菌污染，以吸入的方式传染给人，可导致散发的军团菌病甚至引发大规模的集团发病。由于这种细菌可引起人类严重的疾病和构成潜在的威胁而又无特异性预防措施[6，7]，我们于1995年10月对部分装有中央空调设备的宾馆、医院进行了细菌学调查，现将调查情况报告如下。
1 材料与方法
1.1 取样及处理 1995年10月以无菌玻瓶取冷却塔水各500 ml，4 500 r/min离心30 min，倾去上清留取沉渣液约10 ml，4℃冰箱保存待检。
, 百拇医药
1.2 细菌的分离培养 将沉渣液混匀，5 000 r/min离心10 min，取沉淀物接种于加有万古霉素、多粘菌素的BCYE培养基，置烛缸中37℃培养5～7 d，挑取可疑菌落再接种于BCYE培养基，选取在此培养基生长的纯培养作为疑似菌株进行鉴定。
1.3 菌株的生物学鉴定 疑为军团菌按文献[8]鉴定。
1.4 血清学试验 以嗜肺军团菌第1～6血清型为对照与分离出的细菌作凝集反应，并作间接荧光抗体染色检查(IFA)。
1.5 聚合酶链式反应 用酚氯仿法提取可疑菌落DNA，琼脂糖凝胶电泳观察相应碱基对处有无明亮区带。
1.6 核酸杂交(Southern法) 将电泳后的琼脂糖凝胶DNA以毛细管法转移至硝酸纤维素膜，Digoxin标记探针与固定其上的DNA杂交并测定G+C含量。
, 百拇医药
2 结果
BCYE培养基上生长灰白色、圆形稍凸、湿润光泽、挑之有粘稠感的菌落，呈革兰氏染色阴性杆菌，分离出的细菌生化性状见表1。
表1 分离出的细菌的生化性状
Table 1 Biochemistry characteristic of isolated bacteria 试验
结 果
氧化酶
+
过氧化氢酶
+
马尿酸水解
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+
明胶液化(明胶柱法)
+
糖发酵
-
淀粉酶
+
中国预科院微生物流行病所军团病组提供的标准菌株第一种第5血清型为对照，与分离出的细菌做凝集反应，结果见表2。
表2 凝集反应结果
Table 2 Results of coagulating reaction 菌 种
血清型别
, http://www.100md.com
1
2
3
4
5
6
标准株
-
-
-
-
+
-
SY9501
, 百拇医药
-
-
-
-
+
-
SY9502
-
-
-
-
+
-
用1∶8诊断用血清和分离出的两个菌株混合孵育后加入异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记的羊抗兔免疫球蛋白做间接荧光抗体染色检查(IFA)，结果呈嗜肺军团菌第5血清型阳性。
, 百拇医药
聚合酶链式反应示分离两个菌株在1012 Kb处均有明亮区带。核酸杂交测得G+C含量符合嗜肺军团菌。
3 讨论
在军团菌的研究中从流行环境中检出的菌株以空调系统冷却塔水较多，国内外相继在空调系统冷却塔水中分离出军团菌。
冷却塔作为空调系统的一部分，在冷却过程中约有1%循环水蒸发散失，须添加淡水。如果疏于管理，塔内淤泥、冷却塔构件、水中无机质如钙、镁、铁以及细菌、原虫、藻类构成的共生关系均可为军团菌生存繁殖提供养料，水中包括军团菌在内的微生物浓度逐渐增高，若相对湿度由30%升至80%，军团菌生存时间显著延长；水压保持在60 psi以上足以形成5 μm的污染气溶胶，更易进入肺泡致病。此次分离的两株细菌初步鉴定为嗜肺军团菌血清5型(Lp5)，在尚未证实有军团菌病流行的情况下，从公共场所的空调系统中分离到此菌，表明在沈阳市外环境中有军团菌存在。尽管军团菌病散发病例的发生与空调系统冷却塔之间无直接的职业性接触联系，也并不是所有的爆发流行均与此有关，但空调系统冷却塔污染仍是导致军团菌感染的主要原因之一。
, http://www.100md.com
因此，针对空调系统应改进设计，避免选用适宜军团菌生长的材料如塑料、橡胶；定期清洁冷却塔，去除其中的生物膜、沉淀物、腐蚀物。由于军团菌是一类水生菌群，生存环境界限广泛，水中存活时间较长，水质跟踪监测及水的消毒十分重要，可采取加氯、加热、化学药品、臭氧、紫外线、金属电离等消毒法并投入杀藻剂，使大致菌量低于103 cfu/L，消除污染的气溶胶来源；对医院、宾馆等集体住所人员、空调设备下的工作人员定期进行血清学检查。
本实验拟测定采样单位相关人群血清抗体，这将对今后军团菌感染的预防研究提供参考资料。
参考文献
1，George K Morris,Charlotte M Patton,James C Feeley. Isolation of the Legionnaires′ disease bacterium from environment sample. Ann Intern Med,1979,90:664-666
, 百拇医药
2，Theodore，C Eickhoff.，Epidemiology，of，Legionnaires′，disease. Ann Intern Med,1979,90:499-502
3，Jeffrey D Band,，Martin Laventure,，Jeffrey P Davis.，Epidemic Legionnaires′ disease airborne transmission down a chimney. JAMA,1981,245:2404-2407
4，W Lanier Thacker,，Robert F Benson,，Lesley Hawes,，et al. Legionella fairfieldensis sp.nov. isolated from cooling tower waters in Australia. J Clin Microbiol,1991,29:475-478
, http://www.100md.com
5，Robert F Benson,W Lanier Thacker,J A Lanser,et al. Legionella adelaidensis,a new species isolated from cooling tower water. J Clin Microbiol,1991,29:1004-1006
6，唐英春，黄铃，廖适生.从，空调系统冷却塔水中分离，出军团病杆菌.中华流行病学杂志，1985，6(4)：193～195
7，彭展文，张绪团，谢慈芬，等.空调系统冷凝水检测嗜肺性军团病杆菌研究(摘要).中华预防医学杂志，1986，20(3)：177～178
8，武建国.军团菌病.第1版，南京：东南大学出版社，1990.14，131～132
收稿1998-12-17, 百拇医药
单位：王琳(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)；李丽云(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)；万超群(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)
关键词：冷却塔；军团菌；气溶胶
中国医科大学学报000110 摘要 目的：对沈阳市五家单位中央空调系统冷却塔水进行细菌学调查。方法：对空调系统冷却塔水进行细菌培养，并经细菌生化学、聚合酶链式反应(PCR)、核酸杂交技术(Southern法)等加以验证。结果：沈阳市外环境中有军团菌存在。结论：对这些细菌在冷却塔水中存在的意义进行分析，提出了改进设计、水质消毒监测、相应人群血清学调查的建议。
Report of Legionnaires′ Bacteria Isolated From Cooling Tower Water in Air-conditioning System
, http://www.100md.com
Wang Lin Li Liyun Wan Chaoqun
(Institiute of Respiratory Diseases,China Medical University,Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:Our purpose was to investigate the bacteriology of legionnaires′ disease(LD),and study the legionnaires′ bacteria in 5 central air-conditioning systems in shenyang. Methods:Bacteria culture,characteristic of biochemistry,polymerase chain reaction(PCR),and southern hybridization were used to show LDB in cooling tower water. Results:Two of central air-conditioning sysytem contain legionella pneumophila serogroup 5(Lp5). Conclusion:LDB exists in the environment of Shenyang. By analyzing the LDB in the cooling tower water,we find a good method to improve design,surveillant water quality,and detect antibody in the relative group's serum.
, 百拇医药
KEY WORDS cooling tower; legionnaires bacteria; aerosol
自Morris[1]从水及土壤中分离出军团菌，又相继在世界许多地区的自然环境及人工水体中证明有军团菌存在，尤以冷热水管及与中央空调装置有关的循环冷却水系统多见[2～5]。通过流动水或由冷却塔喷雾飘移而产生的气溶胶如受到军团菌污染，以吸入的方式传染给人，可导致散发的军团菌病甚至引发大规模的集团发病。由于这种细菌可引起人类严重的疾病和构成潜在的威胁而又无特异性预防措施[6，7]，我们于1995年10月对部分装有中央空调设备的宾馆、医院进行了细菌学调查，现将调查情况报告如下。
1 材料与方法
1.1 取样及处理 1995年10月以无菌玻瓶取冷却塔水各500 ml，4 500 r/min离心30 min，倾去上清留取沉渣液约10 ml，4℃冰箱保存待检。
, 百拇医药
1.2 细菌的分离培养 将沉渣液混匀，5 000 r/min离心10 min，取沉淀物接种于加有万古霉素、多粘菌素的BCYE培养基，置烛缸中37℃培养5～7 d，挑取可疑菌落再接种于BCYE培养基，选取在此培养基生长的纯培养作为疑似菌株进行鉴定。
1.3 菌株的生物学鉴定 疑为军团菌按文献[8]鉴定。
1.4 血清学试验 以嗜肺军团菌第1～6血清型为对照与分离出的细菌作凝集反应，并作间接荧光抗体染色检查(IFA)。
1.5 聚合酶链式反应 用酚氯仿法提取可疑菌落DNA，琼脂糖凝胶电泳观察相应碱基对处有无明亮区带。
1.6 核酸杂交(Southern法) 将电泳后的琼脂糖凝胶DNA以毛细管法转移至硝酸纤维素膜，Digoxin标记探针与固定其上的DNA杂交并测定G+C含量。
, 百拇医药
2 结果
BCYE培养基上生长灰白色、圆形稍凸、湿润光泽、挑之有粘稠感的菌落，呈革兰氏染色阴性杆菌，分离出的细菌生化性状见表1。
表1 分离出的细菌的生化性状
Table 1 Biochemistry characteristic of isolated bacteria 试验
结 果
氧化酶
+
过氧化氢酶
+
马尿酸水解
, http://www.100md.com
+
明胶液化(明胶柱法)
+
糖发酵
-
淀粉酶
+
中国预科院微生物流行病所军团病组提供的标准菌株第一种第5血清型为对照，与分离出的细菌做凝集反应，结果见表2。
表2 凝集反应结果
Table 2 Results of coagulating reaction 菌 种
血清型别
, http://www.100md.com
1
2
3
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标准株
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SY9501
, 百拇医药
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SY9502
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用1∶8诊断用血清和分离出的两个菌株混合孵育后加入异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记的羊抗兔免疫球蛋白做间接荧光抗体染色检查(IFA)，结果呈嗜肺军团菌第5血清型阳性。
, 百拇医药
聚合酶链式反应示分离两个菌株在1012 Kb处均有明亮区带。核酸杂交测得G+C含量符合嗜肺军团菌。
3 讨论
在军团菌的研究中从流行环境中检出的菌株以空调系统冷却塔水较多，国内外相继在空调系统冷却塔水中分离出军团菌。
冷却塔作为空调系统的一部分，在冷却过程中约有1%循环水蒸发散失，须添加淡水。如果疏于管理，塔内淤泥、冷却塔构件、水中无机质如钙、镁、铁以及细菌、原虫、藻类构成的共生关系均可为军团菌生存繁殖提供养料，水中包括军团菌在内的微生物浓度逐渐增高，若相对湿度由30%升至80%，军团菌生存时间显著延长；水压保持在60 psi以上足以形成5 μm的污染气溶胶，更易进入肺泡致病。此次分离的两株细菌初步鉴定为嗜肺军团菌血清5型(Lp5)，在尚未证实有军团菌病流行的情况下，从公共场所的空调系统中分离到此菌，表明在沈阳市外环境中有军团菌存在。尽管军团菌病散发病例的发生与空调系统冷却塔之间无直接的职业性接触联系，也并不是所有的爆发流行均与此有关，但空调系统冷却塔污染仍是导致军团菌感染的主要原因之一。
, http://www.100md.com
因此，针对空调系统应改进设计，避免选用适宜军团菌生长的材料如塑料、橡胶；定期清洁冷却塔，去除其中的生物膜、沉淀物、腐蚀物。由于军团菌是一类水生菌群，生存环境界限广泛，水中存活时间较长，水质跟踪监测及水的消毒十分重要，可采取加氯、加热、化学药品、臭氧、紫外线、金属电离等消毒法并投入杀藻剂，使大致菌量低于103 cfu/L，消除污染的气溶胶来源；对医院、宾馆等集体住所人员、空调设备下的工作人员定期进行血清学检查。
本实验拟测定采样单位相关人群血清抗体，这将对今后军团菌感染的预防研究提供参考资料。
参考文献
1，George K Morris,Charlotte M Patton,James C Feeley. Isolation of the Legionnaires′ disease bacterium from environment sample. Ann Intern Med,1979,90:664-666
, 百拇医药
2，Theodore，C Eickhoff.，Epidemiology，of，Legionnaires′，disease. Ann Intern Med,1979,90:499-502
3，Jeffrey D Band,，Martin Laventure,，Jeffrey P Davis.，Epidemic Legionnaires′ disease airborne transmission down a chimney. JAMA,1981,245:2404-2407
4，W Lanier Thacker,，Robert F Benson,，Lesley Hawes,，et al. Legionella fairfieldensis sp.nov. isolated from cooling tower waters in Australia. J Clin Microbiol,1991,29:475-478
, http://www.100md.com
5，Robert F Benson,W Lanier Thacker,J A Lanser,et al. Legionella adelaidensis,a new species isolated from cooling tower water. J Clin Microbiol,1991,29:1004-1006
6，唐英春，黄铃，廖适生.从，空调系统冷却塔水中分离，出军团病杆菌.中华流行病学杂志，1985，6(4)：193～195
7，彭展文，张绪团，谢慈芬，等.空调系统冷凝水检测嗜肺性军团病杆菌研究(摘要).中华预防医学杂志，1986，20(3)：177～178
8，武建国.军团菌病.第1版，南京：东南大学出版社，1990.14，131～132
收稿1998-12-17, 百拇医药