人乳头瘤病毒16、18型在乳腺癌组织中的表达
作者：任占平 黄健辉 石喆 蒋一强 陈蔚麟 阮伶
单位：蒋一强(广西医科大学，广西南宁530021)任占平 黄健辉 石喆(广西柳州人民医院病理科，广西柳州545001)；陈蔚麟(广西柳州人民医院病理科，广西柳州545001)；阮伶(广西柳州人民医院病理科，广西柳州545001)
关键词：乳腺肿瘤；人乳头瘤病毒；免疫组化；原位杂交
癌症000114
摘 要：目的：探讨人乳头瘤病毒(HPV)16、18型感染与人乳腺癌病因学的关系。方法：采用免疫组化法(SP)检测HPV16、18E6蛋白在10例正常乳腺组织，45例乳腺癌组织中的表达并对癌组中13例HPV16、18E6蛋白阳性材料进行HPV16、18DNA原位杂交检测。结果：癌组中HPV16、18E6阳性率为53.3%(24/45)，而正常乳腺组织中均为阴性表达。HPV16、18DNA阳性率为38.5%(5/13)。结论：高危型HPV16、18感染可能涉及乳腺癌的发生过程。
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分类号：R737.9 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0048-03
Expression of papillomavirus types 16 and 18 in breast cancer
REN Zhan-ping， HUANG Jian-hui， SHI Zhe， et al.
(Department of Pathology， Liuzhou People’s Hospital， Guangxi 545001， P.R.China)
Abstract：Objective：To found the etiologic relationship between human papillomavirus ( HPV)types 16 and18 infection and human breast cancer. Methods： Using streptavidin/peroxidase(SP)immunohistochemical technique10 cases of normal breast tissues and 45 cases of breast cancers were studied on the expression of HPV 16 and 18 E6 protein，and 13 cases of HPV 16 and 18 E6 protein positive were studied by in situ hybridization using HPV 16 and18 DNA probes in cancer group. Results： HPV 16 and 18 E6 protein positive rate was 53.3 % ( 24/45) in cancer group， and HPV 16 and 18 DNA positive rate was 38.5 % ( 5/13) in 13 cases positively expressing HPV 16 and 18 E6 proteins, but all of 10 cases of the normal breast tissues showed negative expression in HPV 16 and 18 E6 protein. Conclusion： HPV 16 and 18 infection may be involved in the carcinogenesis of breast cancer.
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Key words：Breast neoplasma; Human papillomavirus; Immunohistochemistry; In situ hybridization ▲
高危组人乳头瘤病毒(HPV)16、18型感染已被证实与肛门及生殖器部位发生的恶性肿瘤的病因学密切相关。本文采用免疫组化和原位杂交技术检测HPV16、18E6蛋白和HPV16、18DNA在乳腺癌组织中的表达，旨在探讨HPV16、18型感染在人乳腺癌发生中的作用。
1材料和方法
1.1材料来源
45例女性乳腺癌、10例正常乳腺组织材料取自本院1996年～1997年手术切除已确诊的病例蜡块，乳腺癌的病理诊断参照《中国常见恶性肿瘤诊断规范·乳腺癌分册》进行组织学分型，其中单纯癌15例，浸润性导管癌10例，硬癌7例，导管内癌5例，粘液腺癌3例，乳腺派杰氏病伴导管内3例，乳头状瘤恶变2例。标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。
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1.2方法
1.2.1免疫组化检测：免疫组化采用SP法，HPV16、18E6单抗(HPV-C1P5)为SantaCruz公司产品，购自武汉博士德生物公司；SP试剂盒为Zymed公司产品，HPV16、18E6免疫组化染色的操作步骤按文献进行[1]。以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性标记。实验用已知宫颈鳞癌HPV16、18DNA阳性且HPV16、18E6蛋白阳性的组织切片作阳性对照，用PBS液取代一抗作阴性对照。
1.2.2原位杂交检测：取癌组单纯癌和浸润性导管癌中共13例HPV16、18E6蛋白阳性材料进行HPV16、18DNA原位杂交的检测，地高辛标记的HPV16/18DNA探针试剂盒由解放军总医院分子病理室提供，购自北京中山生物公司。操作步骤按试剂盒操作步骤进行。用已知宫颈鳞癌HPV16、18DNA阳性切片作阳性对照，以无探针杂交液作阴性对照。以细胞核内呈现紫蓝色颗粒为阳性标记。
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2结果
HPV16、18E6免疫组化检测的结果见表1。
表1HPV16、18E6免疫组化检测结果 类型
例数
HPV16、18E6阳性(%)
乳腺癌
45
24(53.3)
单纯癌
15
9
浸润性导管癌
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10
5
硬癌
7
3
导管内癌
5
2
粘液腺癌
3
2
派杰氏病伴导管内癌
3
1
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乳头状瘤恶变
2
2
正常乳腺组织
10
0(0)
EB阳性定位于细胞核，部份胞核阳性者胞浆内也呈阳性表达，阳性细胞小灶或广泛分布(图1)。癌组中E6总阳性率达53.3%(24/45)，多种组织学类型的乳腺癌组织中均显示有HPV16、18E6的阳性表达，癌组中27例E6阳性者，10例在其癌旁组织见伴有乳腺腺病改变，其中4例在腺病区腺泡上皮细胞核内见到E6阳性。在3例派杰氏病伴导管内癌中，1例在其导管内癌区内见到E6阳性。
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图1 HPV16、18E6蛋白在乳腺单纯癌癌细胞核内的阳性表达(SP法染色×400)
对癌组中单纯癌和浸润性导管癌13例免疫组化检测E6蛋白阳性材料进行HPV16/18DNA原位杂交检测显示，HPV16、18DNA阳性率为38.5%(5/13)，其中单纯癌中阳性3例(3/9)，浸润性导管癌中阳性2例(2/5)，阳性细胞散在或小灶状分布，阳性信号定位于细胞核内且呈非细颗粒状“整合型”表达(图2)。
图2 乳腺癌癌细胞核内显示HPV16、18DNA杂交阳性信号(原位杂交×400)
3讨论
HPV16、18型感染与起源于人腺上皮发生的恶性肿瘤的关系已日益引起人们的重视，1988年，Tase等[2]首先在人宫颈腺癌中证实有HPV16和18型DNA的存在。随后，人们采用分子生物学技术相继在人大肠癌、胃癌组织中检出HPV16、18DNA序列[3,4]，而病毒感染与人乳腺癌病因学的关系一直是人们研究和期待有所发现的热点。1995年Lespargnard等[5]曾采用PCR和原位杂交方法检测10例乳腺髓样癌中EB病毒基因，结果未能证实EB病毒感染与乳腺髓样癌之间的联系。1990年，Kulski等[4]采用滤膜原位杂交法检测了3例乳腺癌中HPV6/11/16/18DNA，但均为阴性。鉴于乳腺作为女性一个重要性征器官且与人类生育、繁殖活动密切相关，其乳腺小叶腺泡通过各级导管最后与乳头鳞状上皮相过渡并开口于外界，而HPV作为与性行为有直接因果关系的一类重要感染因子，其通过乳管开口感染乳腺腺泡上皮和导管上皮的可能性是存在的。我们检测的结果证实在人乳腺癌组织中有高危HPV16、18E6蛋白的表达，在癌组13例E6阳性材料中，HPV16、18DNA原位杂交也证实有HPV16、18DNA的存在。此外，在4例癌旁伴有乳腺腺病的腺泡上皮细胞核内及2例属于乳腺癌前病变—多发性中小导管乳头状瘤发展形成的乳头状瘤恶变材料中均有HPV16、18E6阳性表达。从而表明，高危HPV16、18DNA型感染作为乳腺癌病因学中的一个重要因素的可能性是大大的增加了。
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Cooper等[2]的研究证实，HPV16、18型在宫颈腺癌中主要以整合的形式存在，HPV16、18感染腺上皮后，其DNA整合于人细胞基因组中，HPV16、18DNA的整合导致其E6、E7基因得以持续保存和表达。HPV16、18的E6、E7蛋白可分别与p53、Rb抑癌基因结合并导致其抑癌功能失活，使得细胞周期调控失调，细胞异常增殖。此外，实验研究证实，来自高危HPV的E6蛋白亦可永生化人类乳房上皮细胞且E6尚可通过激活端粒酶而使正常细胞永生化[6,7]。本组癌组中HPV16、18阳性率达53.3%，提示HPV16、18感染在人乳腺癌的发生机制中可能起着一个关键的作用，今后进一步对乳腺癌组织中不同型别的HPVDNA进行分析以及对乳腺癌前病变材料开展检测，将使我们进一步了解HPV感染与乳腺癌发生的相互关系。
HPV16、18E6单抗对HPV16、18型感染具有较高的特异性和敏感性且可用于福尔马林固定、石蜡包埋的组织中[1,8]。本组检测中免疫组化阳性率高于原位杂交法，我们认为可能与常规将整个切除的乳腺和癌灶组织固定于福尔马林中不利HPVDNA保存所致，如能采取手术切除标本后，取薄块癌组织迅速地固定，以有效地保存DNA，则有助于HPVDNA检出率的提高。
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基金项目：本课题获广西自然科学基金(9912043)资助
*通讯作者：Tel：86-722-2812439
Fax：86-772-2855233
参考文献：
[1]任占平，石喆，陈蔚麟，等.宫颈癌组织中HPV16、18E6蛋白表达的观察[J].中华病理杂志，1997，26：161.
[2]Cooper K， Herrington CS， Lo ES -F， et al . Integration of human papillomavirus types 16 and 18 in cervical adenocarcinoma[J]. J Clin Pathol， 1992， 45： 382～ 384.
, 百拇医药
[3]Kirgan D， Manalo P， Hall M， et al. Association of human papillomavirus and colon neoplasms[J]. Arch Surg， 1990， 125： 862～ 865.
[4]Kulski JK， Demeter T， Matavdzic S， et al . Survey of histologic specimens of human cancer for human papillomavirus types 6/11/16/18 by filter in situ hybridization[J]. Am J Clin Pathol， 1990， 94： 566～ 570.
[5]Lespagnard L， Cochaux P， Larsimont D， et al . Absence of Epstein-Barr virus in carcinoma of the breast as demonstrated by immunophenotyping， in situ hybridization and polymerase chain reation[J]. Am J Clin Pathol， 1995， 103： 449～ 452.
, http://www.100md.com
[6]Arends MJ， Buckley CH， Wells M. Aetiology， pathologenesis and pathology of cervical neoplasia[J]. J Clin Pathol， 1998， 51： 96～ 103.
[7]陈华波，于修平.人乳头瘤病毒E6及E7蛋白研究进展[J].国外医学.微生物学分册，1998，21(5)：11.
[8]任占平.HPV16、HPV18E6单抗SP法染色体会[J].临床与实验病理学杂志，1997，13(3)：284.
收稿日期：1999-02-01, http://www.100md.com
单位：蒋一强(广西医科大学，广西南宁530021)任占平 黄健辉 石喆(广西柳州人民医院病理科，广西柳州545001)；陈蔚麟(广西柳州人民医院病理科，广西柳州545001)；阮伶(广西柳州人民医院病理科，广西柳州545001)
关键词：乳腺肿瘤；人乳头瘤病毒；免疫组化；原位杂交
癌症000114
摘 要：目的：探讨人乳头瘤病毒(HPV)16、18型感染与人乳腺癌病因学的关系。方法：采用免疫组化法(SP)检测HPV16、18E6蛋白在10例正常乳腺组织，45例乳腺癌组织中的表达并对癌组中13例HPV16、18E6蛋白阳性材料进行HPV16、18DNA原位杂交检测。结果：癌组中HPV16、18E6阳性率为53.3%(24/45)，而正常乳腺组织中均为阴性表达。HPV16、18DNA阳性率为38.5%(5/13)。结论：高危型HPV16、18感染可能涉及乳腺癌的发生过程。
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分类号：R737.9 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0048-03
Expression of papillomavirus types 16 and 18 in breast cancer
REN Zhan-ping， HUANG Jian-hui， SHI Zhe， et al.
(Department of Pathology， Liuzhou People’s Hospital， Guangxi 545001， P.R.China)
Abstract：Objective：To found the etiologic relationship between human papillomavirus ( HPV)types 16 and18 infection and human breast cancer. Methods： Using streptavidin/peroxidase(SP)immunohistochemical technique10 cases of normal breast tissues and 45 cases of breast cancers were studied on the expression of HPV 16 and 18 E6 protein，and 13 cases of HPV 16 and 18 E6 protein positive were studied by in situ hybridization using HPV 16 and18 DNA probes in cancer group. Results： HPV 16 and 18 E6 protein positive rate was 53.3 % ( 24/45) in cancer group， and HPV 16 and 18 DNA positive rate was 38.5 % ( 5/13) in 13 cases positively expressing HPV 16 and 18 E6 proteins, but all of 10 cases of the normal breast tissues showed negative expression in HPV 16 and 18 E6 protein. Conclusion： HPV 16 and 18 infection may be involved in the carcinogenesis of breast cancer.
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Key words：Breast neoplasma; Human papillomavirus; Immunohistochemistry; In situ hybridization ▲
高危组人乳头瘤病毒(HPV)16、18型感染已被证实与肛门及生殖器部位发生的恶性肿瘤的病因学密切相关。本文采用免疫组化和原位杂交技术检测HPV16、18E6蛋白和HPV16、18DNA在乳腺癌组织中的表达，旨在探讨HPV16、18型感染在人乳腺癌发生中的作用。
1材料和方法
1.1材料来源
45例女性乳腺癌、10例正常乳腺组织材料取自本院1996年～1997年手术切除已确诊的病例蜡块，乳腺癌的病理诊断参照《中国常见恶性肿瘤诊断规范·乳腺癌分册》进行组织学分型，其中单纯癌15例，浸润性导管癌10例，硬癌7例，导管内癌5例，粘液腺癌3例，乳腺派杰氏病伴导管内3例，乳头状瘤恶变2例。标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。
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1.2方法
1.2.1免疫组化检测：免疫组化采用SP法，HPV16、18E6单抗(HPV-C1P5)为SantaCruz公司产品，购自武汉博士德生物公司；SP试剂盒为Zymed公司产品，HPV16、18E6免疫组化染色的操作步骤按文献进行[1]。以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性标记。实验用已知宫颈鳞癌HPV16、18DNA阳性且HPV16、18E6蛋白阳性的组织切片作阳性对照，用PBS液取代一抗作阴性对照。
1.2.2原位杂交检测：取癌组单纯癌和浸润性导管癌中共13例HPV16、18E6蛋白阳性材料进行HPV16、18DNA原位杂交的检测，地高辛标记的HPV16/18DNA探针试剂盒由解放军总医院分子病理室提供，购自北京中山生物公司。操作步骤按试剂盒操作步骤进行。用已知宫颈鳞癌HPV16、18DNA阳性切片作阳性对照，以无探针杂交液作阴性对照。以细胞核内呈现紫蓝色颗粒为阳性标记。
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2结果
HPV16、18E6免疫组化检测的结果见表1。
表1HPV16、18E6免疫组化检测结果 类型
例数
HPV16、18E6阳性(%)
乳腺癌
45
24(53.3)
单纯癌
15
9
浸润性导管癌
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10
5
硬癌
7
3
导管内癌
5
2
粘液腺癌
3
2
派杰氏病伴导管内癌
3
1
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乳头状瘤恶变
2
2
正常乳腺组织
10
0(0)
EB阳性定位于细胞核，部份胞核阳性者胞浆内也呈阳性表达，阳性细胞小灶或广泛分布(图1)。癌组中E6总阳性率达53.3%(24/45)，多种组织学类型的乳腺癌组织中均显示有HPV16、18E6的阳性表达，癌组中27例E6阳性者，10例在其癌旁组织见伴有乳腺腺病改变，其中4例在腺病区腺泡上皮细胞核内见到E6阳性。在3例派杰氏病伴导管内癌中，1例在其导管内癌区内见到E6阳性。
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图1 HPV16、18E6蛋白在乳腺单纯癌癌细胞核内的阳性表达(SP法染色×400)
对癌组中单纯癌和浸润性导管癌13例免疫组化检测E6蛋白阳性材料进行HPV16/18DNA原位杂交检测显示，HPV16、18DNA阳性率为38.5%(5/13)，其中单纯癌中阳性3例(3/9)，浸润性导管癌中阳性2例(2/5)，阳性细胞散在或小灶状分布，阳性信号定位于细胞核内且呈非细颗粒状“整合型”表达(图2)。
图2 乳腺癌癌细胞核内显示HPV16、18DNA杂交阳性信号(原位杂交×400)
3讨论
HPV16、18型感染与起源于人腺上皮发生的恶性肿瘤的关系已日益引起人们的重视，1988年，Tase等[2]首先在人宫颈腺癌中证实有HPV16和18型DNA的存在。随后，人们采用分子生物学技术相继在人大肠癌、胃癌组织中检出HPV16、18DNA序列[3,4]，而病毒感染与人乳腺癌病因学的关系一直是人们研究和期待有所发现的热点。1995年Lespargnard等[5]曾采用PCR和原位杂交方法检测10例乳腺髓样癌中EB病毒基因，结果未能证实EB病毒感染与乳腺髓样癌之间的联系。1990年，Kulski等[4]采用滤膜原位杂交法检测了3例乳腺癌中HPV6/11/16/18DNA，但均为阴性。鉴于乳腺作为女性一个重要性征器官且与人类生育、繁殖活动密切相关，其乳腺小叶腺泡通过各级导管最后与乳头鳞状上皮相过渡并开口于外界，而HPV作为与性行为有直接因果关系的一类重要感染因子，其通过乳管开口感染乳腺腺泡上皮和导管上皮的可能性是存在的。我们检测的结果证实在人乳腺癌组织中有高危HPV16、18E6蛋白的表达，在癌组13例E6阳性材料中，HPV16、18DNA原位杂交也证实有HPV16、18DNA的存在。此外，在4例癌旁伴有乳腺腺病的腺泡上皮细胞核内及2例属于乳腺癌前病变—多发性中小导管乳头状瘤发展形成的乳头状瘤恶变材料中均有HPV16、18E6阳性表达。从而表明，高危HPV16、18DNA型感染作为乳腺癌病因学中的一个重要因素的可能性是大大的增加了。
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Cooper等[2]的研究证实，HPV16、18型在宫颈腺癌中主要以整合的形式存在，HPV16、18感染腺上皮后，其DNA整合于人细胞基因组中，HPV16、18DNA的整合导致其E6、E7基因得以持续保存和表达。HPV16、18的E6、E7蛋白可分别与p53、Rb抑癌基因结合并导致其抑癌功能失活，使得细胞周期调控失调，细胞异常增殖。此外，实验研究证实，来自高危HPV的E6蛋白亦可永生化人类乳房上皮细胞且E6尚可通过激活端粒酶而使正常细胞永生化[6,7]。本组癌组中HPV16、18阳性率达53.3%，提示HPV16、18感染在人乳腺癌的发生机制中可能起着一个关键的作用，今后进一步对乳腺癌组织中不同型别的HPVDNA进行分析以及对乳腺癌前病变材料开展检测，将使我们进一步了解HPV感染与乳腺癌发生的相互关系。
HPV16、18E6单抗对HPV16、18型感染具有较高的特异性和敏感性且可用于福尔马林固定、石蜡包埋的组织中[1,8]。本组检测中免疫组化阳性率高于原位杂交法，我们认为可能与常规将整个切除的乳腺和癌灶组织固定于福尔马林中不利HPVDNA保存所致，如能采取手术切除标本后，取薄块癌组织迅速地固定，以有效地保存DNA，则有助于HPVDNA检出率的提高。
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基金项目：本课题获广西自然科学基金(9912043)资助
*通讯作者：Tel：86-722-2812439
Fax：86-772-2855233
参考文献：
[1]任占平，石喆，陈蔚麟，等.宫颈癌组织中HPV16、18E6蛋白表达的观察[J].中华病理杂志，1997，26：161.
[2]Cooper K， Herrington CS， Lo ES -F， et al . Integration of human papillomavirus types 16 and 18 in cervical adenocarcinoma[J]. J Clin Pathol， 1992， 45： 382～ 384.
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[3]Kirgan D， Manalo P， Hall M， et al. Association of human papillomavirus and colon neoplasms[J]. Arch Surg， 1990， 125： 862～ 865.
[4]Kulski JK， Demeter T， Matavdzic S， et al . Survey of histologic specimens of human cancer for human papillomavirus types 6/11/16/18 by filter in situ hybridization[J]. Am J Clin Pathol， 1990， 94： 566～ 570.
[5]Lespagnard L， Cochaux P， Larsimont D， et al . Absence of Epstein-Barr virus in carcinoma of the breast as demonstrated by immunophenotyping， in situ hybridization and polymerase chain reation[J]. Am J Clin Pathol， 1995， 103： 449～ 452.
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[6]Arends MJ， Buckley CH， Wells M. Aetiology， pathologenesis and pathology of cervical neoplasia[J]. J Clin Pathol， 1998， 51： 96～ 103.
[7]陈华波，于修平.人乳头瘤病毒E6及E7蛋白研究进展[J].国外医学.微生物学分册，1998，21(5)：11.
[8]任占平.HPV16、HPV18E6单抗SP法染色体会[J].临床与实验病理学杂志，1997，13(3)：284.
收稿日期：1999-02-01, http://www.100md.com