HPLC法对不同产地两头尖中皂苷D的定量分析
作者：李勇 张惠 刘大有
单位：长春中医学院中药系 130021
关键词：两头尖；皂苷D；HPLC；定量分析
中草药000108摘 要 以两头尖皂苷D(raddeanoside D)为含量测定指标，采用HPLC法测定了产于黑龙江、吉林、辽宁、山东共10个药材中皂苷D的含量，分别为0.355 0%、0.321 3%、0.280 7%、0.219 6%，本法快速、简便、重现性好，为两头尖质量控制和评价提供了可靠的依据。
Quantitative Analysis of Raddeanoside D in Radde Anemone Rhizome (Anemone raddeana) from Different Habitats by HPLC
Li Yong, Zhang Hui and Liu Dayou
, 百拇医药
Department of Traditional Chinese Materia Medica, Changchun College of TCM (Changchun 130021)
Abstract Using raddeanoside D, the main active constituent of Anemone raddeana Regel, as the quality control criteria, 10 samples of the herbal drug collected from different localities of Heilongjiang, Jilin, Liaoning and Shandong provinces were analysed by HPLC. Results showed that the average raddeanoside D contents were 0.355 0%, 0.321 3%, 0.280 7% and 0.219 6% respectively. This method was proved to be quick, simple and reproducible, and provided a reliable basis for the quality control and evaluation of A.raddeana.
, 百拇医药
Key words Anemone raddeana Regel raddeanoside D HPLC quantitative analysis▲
中药两头尖为毛茛科银莲花属植物多被银莲花Anemone raddeana Regel的干燥根茎，首载于明代刘文泰所著《本草品汇精要》中，临床上具有“祛风湿、消痈肿”的作用，用于风寒温痹、四肢拘挛、骨节疼痛、疮痈溃烂[1]等症。两头尖皂苷D(raddeanosede D)为其主要活性成分[2]。药理研究表明皂苷D具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、镇静、抑菌、溶血作用[3，4]。我们选用两头尖皂苷D为含量测定指标，对我国东北及山东四省产两头尖中皂苷D进行了HPLC法定量分析，为两头尖内在质量控制提供了科学依据。
1 仪器与试药
LC-6A高效液相色谱仪(日本)：包括LC-6A高压溶剂输送泵，SPD-6A紫外-可见检测器、CR-4A色谱数据处理机；两头尖皂苷D对照品由长春中医学院明兴药物研究室自制，经光谱鉴定，并经HPLC分析为单一峰，纯度为98.5471%；10个两头尖的产地和采集时间见表1，经长春中医学院邓明鲁教授鉴定为多被银莲花Anemon raddeana Regel的根茎。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱为Shimpack C18柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)；流动相为甲醇-水(7∶3)；流速为1 mL/min；检测波长为207 nm；纸速为1.0 mm/min;灵敏度为0.30 AUFS。
2.2 标准曲线的制作：精密称取干燥至恒重的两头尖皂苷D对照品2 mg，加流动相溶解并定容至1 mL，作为对照品溶液。分别以2，4，6，8，10 μL进样测定，以皂苷D的峰面积积分值为纵坐标，皂苷D对照品的量为横坐标，绘制标准曲线，得一不通过原点的直线，其回归方程为：Y=38 747.9X-654.9，r=0.999 8。皂苷D标准品在4.0～20.0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.3 样品的测定：取两头尖于60 ℃烘干24 h，粉碎过60目筛。精密称取10种不同产地采集的两头尖样品各1.5 g，分别置于索氏提取器中，加甲醇回流提取4 h，提取液浓缩至干，残渣加少量水溶解，用乙醚萃取4次，乙醚层用水洗3次，合并水层，再用水饱和的正丁醇萃取5次，合并正丁醇层，减压浓缩至干。残渣用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，吸取5 μL进样测定，结果见表1和图1。
, http://www.100md.com
表1 10个两头尖样品产地、采集时间和皂苷D的含量 产地
采集时间
(1997年)
平均含量
(%)
RSD
(%)
吉林左家
05-11
0.318 4
1.32
吉林靖宇
, 百拇医药
05-13
0.320 6
2.67
吉林桦甸
05-15
0.324 9
3.97
吉林天岗
05-12
0.328 4
2.73
黑龙江阿城
05-15
, 百拇医药
0.352 7
3.39
黑龙江一面坡
05-14
0.355 2
4.41
黑龙江亚伯利
05-07
0.357 3
3.89
辽宁凤坡
05-08
0.280 2
, 百拇医药
4.37
辽宁清原
05-06
0.281 2
2.52
山东昆嵛山
05-04
0.219 6
4.55
A-标准品 B-两头尖样品 C-皂苷D
图1 两头尖皂苷D和两头尖样品HPLC图
, 百拇医药
2.4 加样回收率试验：精密称取已知皂苷D含量的吉林省桦甸产两头尖样品粉末1.5 g 3份，分别精密加入皂苷D对照品5 mg，按照样品测定项下方法进行处理，残渣用甲醇定容于5 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，测定，计算回收率，结果平均回收率：100.41%，RSD=0.83%。
2.5 精密度试验：在上述色谱条件下，对同一浓度的对照品溶液连续5次进样，得峰面积X为6 462，RSD为2.06%。
2.6 重现性试验：按照样品测定方法，对桦甸产两头尖样品进行5次平行试验，皂苷D的含量RSD为1.68%。
2.7 稳定性试验：在室温条件下，将样品溶液在1，2，3，4，12，24 h进样测定，含量不变，说明样品溶液在24 h内稳定。
3 讨论
, 百拇医药
3.1 我们曾对两头尖药材进行冷浸、渗漉、加热回流等提取方法的比较试验研究，结果以索氏提取器加热回流提取测得的两头尖皂苷D含量最高。
3.2 中药两头尖产于吉林、黑龙江、辽宁和山东四省，对我国四省产两头尖中皂苷D含量测定的结果表明，上述四省分布的两头尖有从南向北依次增高的趋势，这一结果是否与气候、土壤等因素的影响有关，有待进一步深入研究。■
国家“九.五”攻关项目“中药材质量标准规范化研究”资助项目
李勇：Address:Li Yong, Department of Chinese Materia Medica, Changchun College of Traditional Chinese Medicine, Changchun
参考文献
1，中华人民共和国药典(一部).广州：广东科技出版社，1995：143
2，刘大有，等.中草药，1984，15(4)：34
3，刘大有，等.长春中医学院学报，1987，2(3)：58
4，Wang Benxiang, at al. J Traditional Chinese Medicine，1985,5(1):61
(1999-04-05 收稿), 百拇医药
单位：长春中医学院中药系 130021
关键词：两头尖；皂苷D；HPLC；定量分析
中草药000108摘 要 以两头尖皂苷D(raddeanoside D)为含量测定指标，采用HPLC法测定了产于黑龙江、吉林、辽宁、山东共10个药材中皂苷D的含量，分别为0.355 0%、0.321 3%、0.280 7%、0.219 6%，本法快速、简便、重现性好，为两头尖质量控制和评价提供了可靠的依据。
Quantitative Analysis of Raddeanoside D in Radde Anemone Rhizome (Anemone raddeana) from Different Habitats by HPLC
Li Yong, Zhang Hui and Liu Dayou
, 百拇医药
Department of Traditional Chinese Materia Medica, Changchun College of TCM (Changchun 130021)
Abstract Using raddeanoside D, the main active constituent of Anemone raddeana Regel, as the quality control criteria, 10 samples of the herbal drug collected from different localities of Heilongjiang, Jilin, Liaoning and Shandong provinces were analysed by HPLC. Results showed that the average raddeanoside D contents were 0.355 0%, 0.321 3%, 0.280 7% and 0.219 6% respectively. This method was proved to be quick, simple and reproducible, and provided a reliable basis for the quality control and evaluation of A.raddeana.
, 百拇医药
Key words Anemone raddeana Regel raddeanoside D HPLC quantitative analysis▲
中药两头尖为毛茛科银莲花属植物多被银莲花Anemone raddeana Regel的干燥根茎，首载于明代刘文泰所著《本草品汇精要》中，临床上具有“祛风湿、消痈肿”的作用，用于风寒温痹、四肢拘挛、骨节疼痛、疮痈溃烂[1]等症。两头尖皂苷D(raddeanosede D)为其主要活性成分[2]。药理研究表明皂苷D具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、镇静、抑菌、溶血作用[3，4]。我们选用两头尖皂苷D为含量测定指标，对我国东北及山东四省产两头尖中皂苷D进行了HPLC法定量分析，为两头尖内在质量控制提供了科学依据。
1 仪器与试药
LC-6A高效液相色谱仪(日本)：包括LC-6A高压溶剂输送泵，SPD-6A紫外-可见检测器、CR-4A色谱数据处理机；两头尖皂苷D对照品由长春中医学院明兴药物研究室自制，经光谱鉴定，并经HPLC分析为单一峰，纯度为98.5471%；10个两头尖的产地和采集时间见表1，经长春中医学院邓明鲁教授鉴定为多被银莲花Anemon raddeana Regel的根茎。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱为Shimpack C18柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)；流动相为甲醇-水(7∶3)；流速为1 mL/min；检测波长为207 nm；纸速为1.0 mm/min;灵敏度为0.30 AUFS。
2.2 标准曲线的制作：精密称取干燥至恒重的两头尖皂苷D对照品2 mg，加流动相溶解并定容至1 mL，作为对照品溶液。分别以2，4，6，8，10 μL进样测定，以皂苷D的峰面积积分值为纵坐标，皂苷D对照品的量为横坐标，绘制标准曲线，得一不通过原点的直线，其回归方程为：Y=38 747.9X-654.9，r=0.999 8。皂苷D标准品在4.0～20.0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.3 样品的测定：取两头尖于60 ℃烘干24 h，粉碎过60目筛。精密称取10种不同产地采集的两头尖样品各1.5 g，分别置于索氏提取器中，加甲醇回流提取4 h，提取液浓缩至干，残渣加少量水溶解，用乙醚萃取4次，乙醚层用水洗3次，合并水层，再用水饱和的正丁醇萃取5次，合并正丁醇层，减压浓缩至干。残渣用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，吸取5 μL进样测定，结果见表1和图1。
, http://www.100md.com
表1 10个两头尖样品产地、采集时间和皂苷D的含量 产地
采集时间
(1997年)
平均含量
(%)
RSD
(%)
吉林左家
05-11
0.318 4
1.32
吉林靖宇
, 百拇医药
05-13
0.320 6
2.67
吉林桦甸
05-15
0.324 9
3.97
吉林天岗
05-12
0.328 4
2.73
黑龙江阿城
05-15
, 百拇医药
0.352 7
3.39
黑龙江一面坡
05-14
0.355 2
4.41
黑龙江亚伯利
05-07
0.357 3
3.89
辽宁凤坡
05-08
0.280 2
, 百拇医药
4.37
辽宁清原
05-06
0.281 2
2.52
山东昆嵛山
05-04
0.219 6
4.55
A-标准品 B-两头尖样品 C-皂苷D
图1 两头尖皂苷D和两头尖样品HPLC图
, 百拇医药
2.4 加样回收率试验：精密称取已知皂苷D含量的吉林省桦甸产两头尖样品粉末1.5 g 3份，分别精密加入皂苷D对照品5 mg，按照样品测定项下方法进行处理，残渣用甲醇定容于5 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，测定，计算回收率，结果平均回收率：100.41%，RSD=0.83%。
2.5 精密度试验：在上述色谱条件下，对同一浓度的对照品溶液连续5次进样，得峰面积X为6 462，RSD为2.06%。
2.6 重现性试验：按照样品测定方法，对桦甸产两头尖样品进行5次平行试验，皂苷D的含量RSD为1.68%。
2.7 稳定性试验：在室温条件下，将样品溶液在1，2，3，4，12，24 h进样测定，含量不变，说明样品溶液在24 h内稳定。
3 讨论
, 百拇医药
3.1 我们曾对两头尖药材进行冷浸、渗漉、加热回流等提取方法的比较试验研究，结果以索氏提取器加热回流提取测得的两头尖皂苷D含量最高。
3.2 中药两头尖产于吉林、黑龙江、辽宁和山东四省，对我国四省产两头尖中皂苷D含量测定的结果表明，上述四省分布的两头尖有从南向北依次增高的趋势，这一结果是否与气候、土壤等因素的影响有关，有待进一步深入研究。■
国家“九.五”攻关项目“中药材质量标准规范化研究”资助项目
李勇：Address:Li Yong, Department of Chinese Materia Medica, Changchun College of Traditional Chinese Medicine, Changchun
参考文献
1，中华人民共和国药典(一部).广州：广东科技出版社，1995：143
2，刘大有，等.中草药，1984，15(4)：34
3，刘大有，等.长春中医学院学报，1987，2(3)：58
4，Wang Benxiang, at al. J Traditional Chinese Medicine，1985,5(1):61
(1999-04-05 收稿), 百拇医药