多种癌基因检测在青、老年胃癌中的对比研究
作者：秦环龙 林擎天
单位：秦环龙(上海市第六人民医院普外科 200233)；林擎天(上海市第六人民医院普外科 200233)
关键词：胃癌；基因；免疫组化
临床外科杂志000113
摘 要：目的 观察多种癌基因在青、老年胃癌中异常表达特点及临床意义。方法 取94例胃癌手术后石蜡切片，采用免疫组化法检测p53、p21ras、C-erbB-2和nm23-H1的表达情况。结果 p53在分化较差、浸润超出浆膜、有淋巴结转移的青年人胃癌的阳性表达率明显高于老年患者(P<0.01)；p21ras在浸润超出浆膜和有淋巴结转移的青年人胃癌阳性表达率显著高于老年人胃癌(P<0.01)。C-erbB-2在其相同组织学分化程度、浸润深度和淋巴结转移情况，青年人胃癌的阳性表达率均高于老年组(P<0.05)。nm23-H1在相同组织学分化程度和浸润深度，两组无明显差异，而在淋巴结转移方面，青年人胃癌组明显高于老年组(P<0.01)。结论 多种肿瘤标记物联合检测，均提示青年人胃癌有较强的浸润、转移能力，预后差。
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分类法：R573 文献标识码：A
文章编号：1005-6483(2000)01-0025-03
Comparation studies on the multi-tumor-oncogene expression in gastric cancer between young and aged patients
QIN Huanlong,LIN Qingtian.
(Department of Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital，Shanghai 200233，China)
Abstract：Objective To compare the difference of the expression of p53、p21ras、C-erbB-2 and nm23-H1 between young and aged gastric cancer.Methods The expressions of p53、p21ras、c-erbB-2 and nm23-H1 were detected immunohistochemically in 94 surgical specimens.Results The positive rate of p53 in young patient was higher than that of aged patient in less differentiation、invasion over stomach and lymph node metastasis(LNM),P<0.01.The positive rate of p21ras in young patient was higher than that of aged patient in invasion over stomach and LNM,P<0.01.The positive rate of c-erbB-2 with the same depth of invasion and LNM in young patient was higher than that of aged patient，P<0.05.The positive rate of nm23-H1 in the same LNM in the young patients was higher than that of aged patients,P<0.01.Conclusion Determination of p53、p21ras、c-erbB-2 and nm23-H1 multi-tumor-marker immunohistochemically suggested the ability of invasion and metastasis in the young patient were higher,and that predicted prognosis of young gastric cancer was poorer.
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Key words：Gastric cancer；Gene；Immunohistochemistry
胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其病死率居各种恶性肿瘤之首位。近年来，青年人胃癌的发病率逐年增高。青年人胃癌以低分化腺癌居多，具有侵袭力强、局部淋巴结转移高以及预后较差等特点。我们应用同一组织连续切片免疫组化同步检测青、老年人胃癌组织p53、p21ras、C-erbB-2和nm23-H1的蛋白产物，分析它们在青年人胃癌中异常表达的特点和临床意义。材料和方法
1.材料：收集1982年1月～1998年5月手术后胃癌存档蜡块。选择其中青年组(年龄≤35岁)34例，老年组(年龄≥65岁)60例。标本均经常规10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，分别进行免疫组化和HE染色。按肿瘤分化程度、浸润深度和有无淋巴结转移来观察下列癌基因的表达变化情况。
2.主要试剂：鼠抗人p53单克隆抗体(Novocastra)、鼠抗人pan-ras单克隆抗体(Oncogene Science,Inc)、兔抗人C-erbB-2多克隆抗体(DAKO)、nm23-H1单克隆抗体(DAKO)、LSAB试剂盒(DAKO)和ABC试剂盒(Vector)购于上海华美公司。
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3.方法：p53和p21ras表达的检测用LSAB法，Ⅰ抗浓度分别为1∶50和1∶25，CEA和C-erbB-2表达的检测用标准ABC法，Ⅰ抗浓度均为1∶50。nm23-H1和p21ras单克隆抗体及链霉素亲生物素-过氧化物酶(LSAB)试剂盒均由丹麦Dako公司生产。采用免疫组化LSAB法检测。Ⅰ抗浓度为1∶150和1∶100。用DAB显色，苏木素复染。细胞浆或细胞核呈明显棕色反应即为阳性。上述检测均做阳性和阴性对照。
4.统计：用χ2检验和四格表确切概率法分析。
结 果
1.各基因表达的一般特征：p53阳性反应均位于细胞核内，C-erbB-2和p21ras主要位于细胞膜，少部分位于细胞浆。nm23-H1为细胞浆着色。癌周组织、正常组织为阴性，背景清晰。
2.多基因表达与青、老年人胃癌的临床病理特征关系见表1、表2。
, 百拇医药
表1 p53、p21ras表达与临床病理特征关系(%) 临床因素
阳性表达
p53
p21ras
青年组
老年组
青年组
老年组
分化程度
分化较好
35.7
40.7
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28.6
25.4
分化较差
60.0**
42.4
30.0
33.3
浸润深度
浆膜以内
36.4
24.0
27.3
20.0
, 百拇医药
超出浆膜
52.2*#
25.7
60.9*#
25.7
淋巴结转移
无
33.3
21.1
22.2
26.3
有
, http://www.100md.com 64.0*＄
31.7
56.0*＄
34.1
注：*与老年组相比P<0.01；**与分化较好相比P<0.01
#与浆膜以内相比P<0.01；＄与无淋巴结转移相比P<0.01表2 C-erbB-2、nm23-H1与临床病理特征关系(%) 临床因素
阳性表达
C-erbB-2
nm23-H1
, http://www.100md.com
青年组
老年组
青年组
老年组
分化程度
分化较好
21.4*
37.0
42.8
33.3
分化较差
25.0*
, 百拇医药 39.4
35.0
36.4
浸润深度
浆膜以内
18.2*
28.0
27.3
28.0
超出浆膜
21.7*
31.4
26.1
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28.6
淋巴结转移
无
27.2*
36.8
33.3
42.1
有
24.0*
36.6
8.0#
34.1
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注：与老年组相比*P<0.05；＃P<0.01 分化较好：分化1级+2级，分化较差：分化3级+4级。p53在分化较差，浸润超出浆膜，有淋巴结转移的青年人胃癌的阳性表达率明显高于老年患者，P<0.01，并且明显高于分化较好、浸润未超出浆膜及无淋巴结转移的青年人胃癌，P<0.05。p21ras在浸润超出浆膜和有淋巴结转移的青年人胃癌阳性表达率明显高于老年人胃癌，P<0.01。且明显高于浸润深度在浆膜内和无淋巴结转移的青年人胃癌。C-erbB-2在其相同组织学分化程度、浸润深度和淋巴结转移情况，青年人胃癌的阳性表达率均高于老年组，P<0.05。nm23-H1在相同组织学分化程度和浸润深度的情况下，两组无明显差异(P>0.05)，而在淋巴结转移方面，青年人胃癌明显高于老年组，P<0.01。
讨 论
胃癌的发生发展是一个涉及多基因、多分子水平的多阶段过程[1]。目前，文献报道癌基因产物的检测，多数针对某单一癌基因的变化，其结果可比性较差，结论常常不一致。青年人胃癌有其发病特点，其癌基因的表达可能不同于其它年龄段的肿瘤，因此，同时多种癌基因表达情况的深入研究，对预测青年人胃癌的淋巴结转移趋势及侵袭能力，制定整套的治疗方案，使病人获得较好的预后具有重要的临床意义。
, 百拇医药
野生型p53基因是一种抑癌基因，通过对细胞生长的调控和促进程序性细胞死亡的发生而起抑癌作用。当其发生突变后，即变成突变型p53基因，从而失去抑癌功能，反而具有促进恶性转化的活性，促使静止期的细胞分裂增殖[2]。本研究发现，在分化程度较差、浸润超出浆膜及有淋巴结转移的患者中，青年人胃癌有较高的p53蛋白过度表达，明显高于老年组(P<0.01)，并明显高于分化较好、浸润未超出浆膜及无淋巴结转移的青年人胃癌(P<0.05)。初步结果提示p53基因的高表达，使胃癌细胞具有更大的侵袭力，可能是青年人胃癌较老年人胃癌恶性程度高、预后差、进展快的原因之一。
有研究表明，p21ras基因高表达提示胃癌细胞的增生和浸润能力增强，是胃癌恶性程度高的表现。王杉等[3]报道有淋巴结转移的结直肠癌p21ras过度表达率明显高于无淋巴结转移者。众多学者认为，p21ras基因表达与肿瘤浸润、转移密切相关[4]，这为研究p21ras的表达与青年人胃癌淋巴结转移的关系提供了重要参考依据。我们的研究表明，青年人胃癌p21ras蛋白表达阳性率在组织分化程度方面与老年组并无差异，而与肿瘤浸润深度、细胞增殖和转移显著相关，显著高于老年人胃癌组，且明显高于浸润深度在浆膜内和无淋巴结移的青年人胃癌。提示p21ras基因异常表达在青年人胃癌细胞增殖、发展和转移中起重要作用。
, 百拇医药
癌基因C-erbB-2(又称HER-2/neu)编码一组生长因子受体，其序列与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)相似，其蛋白产物激活苏氨酸蛋白激酶活性，参与细胞的生长与分化。许多研究证明，C-erbB-2癌基因表达对多种恶性肿瘤病人预后、术后复发和生存期有重要影响[5]。本研究表明，青年人胃癌C-erbB-2在相同组织分化程度，浸润情况和有无淋巴结转移方面，其表达均明显低于相应老年组，P<0.05。由此提示，青年人胃癌较老年组存在着更为明显的C-erbB-2表达缺少，可能与其恶性程度明显增加有关。
nm23基因是1988年Steeg等首先克隆出来的，其抑制肿瘤转移的机理尚未完全清楚。文献报道nm23可影响细胞膜G蛋白功能，干扰微管、微丝等细胞骨架蛋白的生物活性，阻断肿瘤转移信息传递而起到抑制肿瘤转移的作用[6]。近来，Leone等发现33.3%人乳腺癌、25%非小细胞肺癌和12.5%结肠癌有nm23-H1等位基因的缺失或突变。王盛乾等[7]的研究表明，120例胃癌有淋巴结转移者nm23-H1的阳性表达率为17.9%，而无淋巴结转移者为47.5%，提示胃癌的转移与nm23-H1基因失活有关。本研究表明，青年人胃癌组有淋巴结转移者明显高于老年淋巴结转移组(P<0.01)。而且在25例有淋巴结转移的青年人胃癌仅2例有nm23-H1的阳性表达，明显低于无淋巴结转移的青年人胃癌。提示有淋巴结转移青年人胃癌者存在着显著的nm23-H1蛋白的缺失，并在胃癌淋巴结转移中起着重要作用。
, 百拇医药
本研究表明，胃癌的发生、发展过程中伴有多种癌基因的参与，虽然它们各自的意义不同，但在青年人胃癌中，各癌基因的表达情况均提示有较强的侵袭和淋巴结转移能力，尤其在分化较差、浸润超出浆膜及有淋巴结转移时，恶性度更为增加，这些变化可能与青年人胃癌预后较差有关。但对其实用价值的评价尚有待进一步系统的、前瞻性的随访研究。
参考文献：
[1]秦环龙，何萍青，何德安.胃癌多基因及癌胚抗原同步检测的临床意义.中华普通外科杂志，1999，14(3)∶228-229
[2]Martin HM,Filipe ME,Morris RW,et al.p53 expression and prognosis in gastric carcinoma.Int J Cancer,1992,50∶859-860
[3]王彬，于永祥，张嘉庆，等.结直肠癌预后因素评估.中华外科杂志，1994，32(5)∶289-290
, 百拇医药
[4]张延龄.胃癌预后因素的研究近况.国外医学*外科学分册，1998，25(3)∶139-142
[5]安伟德，胡祥，郭武斌，等.C-erbB-2基因扩增与胃癌预后的关系.中国肿瘤临床，1996，23(12)∶8841-8844
[6]Steeg PS,Cohn KH,Leone A,et al.Tumor metastasis and nm23:current concepts.Cancer Cells,1994,3∶257-258
[7]王盛乾，洪东旭，吴若华.120例胃癌中p16、nm23-H1基因蛋白表达与临床预后的关系.实用肿瘤杂志，1997，12(3)∶108-110
收稿日期：1999-04-08, http://www.100md.com
单位：秦环龙(上海市第六人民医院普外科 200233)；林擎天(上海市第六人民医院普外科 200233)
关键词：胃癌；基因；免疫组化
临床外科杂志000113
摘 要：目的 观察多种癌基因在青、老年胃癌中异常表达特点及临床意义。方法 取94例胃癌手术后石蜡切片，采用免疫组化法检测p53、p21ras、C-erbB-2和nm23-H1的表达情况。结果 p53在分化较差、浸润超出浆膜、有淋巴结转移的青年人胃癌的阳性表达率明显高于老年患者(P<0.01)；p21ras在浸润超出浆膜和有淋巴结转移的青年人胃癌阳性表达率显著高于老年人胃癌(P<0.01)。C-erbB-2在其相同组织学分化程度、浸润深度和淋巴结转移情况，青年人胃癌的阳性表达率均高于老年组(P<0.05)。nm23-H1在相同组织学分化程度和浸润深度，两组无明显差异，而在淋巴结转移方面，青年人胃癌组明显高于老年组(P<0.01)。结论 多种肿瘤标记物联合检测，均提示青年人胃癌有较强的浸润、转移能力，预后差。
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分类法：R573 文献标识码：A
文章编号：1005-6483(2000)01-0025-03
Comparation studies on the multi-tumor-oncogene expression in gastric cancer between young and aged patients
QIN Huanlong,LIN Qingtian.
(Department of Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital，Shanghai 200233，China)
Abstract：Objective To compare the difference of the expression of p53、p21ras、C-erbB-2 and nm23-H1 between young and aged gastric cancer.Methods The expressions of p53、p21ras、c-erbB-2 and nm23-H1 were detected immunohistochemically in 94 surgical specimens.Results The positive rate of p53 in young patient was higher than that of aged patient in less differentiation、invasion over stomach and lymph node metastasis(LNM),P<0.01.The positive rate of p21ras in young patient was higher than that of aged patient in invasion over stomach and LNM,P<0.01.The positive rate of c-erbB-2 with the same depth of invasion and LNM in young patient was higher than that of aged patient，P<0.05.The positive rate of nm23-H1 in the same LNM in the young patients was higher than that of aged patients,P<0.01.Conclusion Determination of p53、p21ras、c-erbB-2 and nm23-H1 multi-tumor-marker immunohistochemically suggested the ability of invasion and metastasis in the young patient were higher,and that predicted prognosis of young gastric cancer was poorer.
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Key words：Gastric cancer；Gene；Immunohistochemistry
胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其病死率居各种恶性肿瘤之首位。近年来，青年人胃癌的发病率逐年增高。青年人胃癌以低分化腺癌居多，具有侵袭力强、局部淋巴结转移高以及预后较差等特点。我们应用同一组织连续切片免疫组化同步检测青、老年人胃癌组织p53、p21ras、C-erbB-2和nm23-H1的蛋白产物，分析它们在青年人胃癌中异常表达的特点和临床意义。材料和方法
1.材料：收集1982年1月～1998年5月手术后胃癌存档蜡块。选择其中青年组(年龄≤35岁)34例，老年组(年龄≥65岁)60例。标本均经常规10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，分别进行免疫组化和HE染色。按肿瘤分化程度、浸润深度和有无淋巴结转移来观察下列癌基因的表达变化情况。
2.主要试剂：鼠抗人p53单克隆抗体(Novocastra)、鼠抗人pan-ras单克隆抗体(Oncogene Science,Inc)、兔抗人C-erbB-2多克隆抗体(DAKO)、nm23-H1单克隆抗体(DAKO)、LSAB试剂盒(DAKO)和ABC试剂盒(Vector)购于上海华美公司。
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3.方法：p53和p21ras表达的检测用LSAB法，Ⅰ抗浓度分别为1∶50和1∶25，CEA和C-erbB-2表达的检测用标准ABC法，Ⅰ抗浓度均为1∶50。nm23-H1和p21ras单克隆抗体及链霉素亲生物素-过氧化物酶(LSAB)试剂盒均由丹麦Dako公司生产。采用免疫组化LSAB法检测。Ⅰ抗浓度为1∶150和1∶100。用DAB显色，苏木素复染。细胞浆或细胞核呈明显棕色反应即为阳性。上述检测均做阳性和阴性对照。
4.统计：用χ2检验和四格表确切概率法分析。
结 果
1.各基因表达的一般特征：p53阳性反应均位于细胞核内，C-erbB-2和p21ras主要位于细胞膜，少部分位于细胞浆。nm23-H1为细胞浆着色。癌周组织、正常组织为阴性，背景清晰。
2.多基因表达与青、老年人胃癌的临床病理特征关系见表1、表2。
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表1 p53、p21ras表达与临床病理特征关系(%) 临床因素
阳性表达
p53
p21ras
青年组
老年组
青年组
老年组
分化程度
分化较好
35.7
40.7
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28.6
25.4
分化较差
60.0**
42.4
30.0
33.3
浸润深度
浆膜以内
36.4
24.0
27.3
20.0
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超出浆膜
52.2*#
25.7
60.9*#
25.7
淋巴结转移
无
33.3
21.1
22.2
26.3
有
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31.7
56.0*＄
34.1
注：*与老年组相比P<0.01；**与分化较好相比P<0.01
#与浆膜以内相比P<0.01；＄与无淋巴结转移相比P<0.01表2 C-erbB-2、nm23-H1与临床病理特征关系(%) 临床因素
阳性表达
C-erbB-2
nm23-H1
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青年组
老年组
青年组
老年组
分化程度
分化较好
21.4*
37.0
42.8
33.3
分化较差
25.0*
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35.0
36.4
浸润深度
浆膜以内
18.2*
28.0
27.3
28.0
超出浆膜
21.7*
31.4
26.1
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28.6
淋巴结转移
无
27.2*
36.8
33.3
42.1
有
24.0*
36.6
8.0#
34.1
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注：与老年组相比*P<0.05；＃P<0.01 分化较好：分化1级+2级，分化较差：分化3级+4级。p53在分化较差，浸润超出浆膜，有淋巴结转移的青年人胃癌的阳性表达率明显高于老年患者，P<0.01，并且明显高于分化较好、浸润未超出浆膜及无淋巴结转移的青年人胃癌，P<0.05。p21ras在浸润超出浆膜和有淋巴结转移的青年人胃癌阳性表达率明显高于老年人胃癌，P<0.01。且明显高于浸润深度在浆膜内和无淋巴结转移的青年人胃癌。C-erbB-2在其相同组织学分化程度、浸润深度和淋巴结转移情况，青年人胃癌的阳性表达率均高于老年组，P<0.05。nm23-H1在相同组织学分化程度和浸润深度的情况下，两组无明显差异(P>0.05)，而在淋巴结转移方面，青年人胃癌明显高于老年组，P<0.01。
讨 论
胃癌的发生发展是一个涉及多基因、多分子水平的多阶段过程[1]。目前，文献报道癌基因产物的检测，多数针对某单一癌基因的变化，其结果可比性较差，结论常常不一致。青年人胃癌有其发病特点，其癌基因的表达可能不同于其它年龄段的肿瘤，因此，同时多种癌基因表达情况的深入研究，对预测青年人胃癌的淋巴结转移趋势及侵袭能力，制定整套的治疗方案，使病人获得较好的预后具有重要的临床意义。
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野生型p53基因是一种抑癌基因，通过对细胞生长的调控和促进程序性细胞死亡的发生而起抑癌作用。当其发生突变后，即变成突变型p53基因，从而失去抑癌功能，反而具有促进恶性转化的活性，促使静止期的细胞分裂增殖[2]。本研究发现，在分化程度较差、浸润超出浆膜及有淋巴结转移的患者中，青年人胃癌有较高的p53蛋白过度表达，明显高于老年组(P<0.01)，并明显高于分化较好、浸润未超出浆膜及无淋巴结转移的青年人胃癌(P<0.05)。初步结果提示p53基因的高表达，使胃癌细胞具有更大的侵袭力，可能是青年人胃癌较老年人胃癌恶性程度高、预后差、进展快的原因之一。
有研究表明，p21ras基因高表达提示胃癌细胞的增生和浸润能力增强，是胃癌恶性程度高的表现。王杉等[3]报道有淋巴结转移的结直肠癌p21ras过度表达率明显高于无淋巴结转移者。众多学者认为，p21ras基因表达与肿瘤浸润、转移密切相关[4]，这为研究p21ras的表达与青年人胃癌淋巴结转移的关系提供了重要参考依据。我们的研究表明，青年人胃癌p21ras蛋白表达阳性率在组织分化程度方面与老年组并无差异，而与肿瘤浸润深度、细胞增殖和转移显著相关，显著高于老年人胃癌组，且明显高于浸润深度在浆膜内和无淋巴结移的青年人胃癌。提示p21ras基因异常表达在青年人胃癌细胞增殖、发展和转移中起重要作用。
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癌基因C-erbB-2(又称HER-2/neu)编码一组生长因子受体，其序列与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)相似，其蛋白产物激活苏氨酸蛋白激酶活性，参与细胞的生长与分化。许多研究证明，C-erbB-2癌基因表达对多种恶性肿瘤病人预后、术后复发和生存期有重要影响[5]。本研究表明，青年人胃癌C-erbB-2在相同组织分化程度，浸润情况和有无淋巴结转移方面，其表达均明显低于相应老年组，P<0.05。由此提示，青年人胃癌较老年组存在着更为明显的C-erbB-2表达缺少，可能与其恶性程度明显增加有关。
nm23基因是1988年Steeg等首先克隆出来的，其抑制肿瘤转移的机理尚未完全清楚。文献报道nm23可影响细胞膜G蛋白功能，干扰微管、微丝等细胞骨架蛋白的生物活性，阻断肿瘤转移信息传递而起到抑制肿瘤转移的作用[6]。近来，Leone等发现33.3%人乳腺癌、25%非小细胞肺癌和12.5%结肠癌有nm23-H1等位基因的缺失或突变。王盛乾等[7]的研究表明，120例胃癌有淋巴结转移者nm23-H1的阳性表达率为17.9%，而无淋巴结转移者为47.5%，提示胃癌的转移与nm23-H1基因失活有关。本研究表明，青年人胃癌组有淋巴结转移者明显高于老年淋巴结转移组(P<0.01)。而且在25例有淋巴结转移的青年人胃癌仅2例有nm23-H1的阳性表达，明显低于无淋巴结转移的青年人胃癌。提示有淋巴结转移青年人胃癌者存在着显著的nm23-H1蛋白的缺失，并在胃癌淋巴结转移中起着重要作用。
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本研究表明，胃癌的发生、发展过程中伴有多种癌基因的参与，虽然它们各自的意义不同，但在青年人胃癌中，各癌基因的表达情况均提示有较强的侵袭和淋巴结转移能力，尤其在分化较差、浸润超出浆膜及有淋巴结转移时，恶性度更为增加，这些变化可能与青年人胃癌预后较差有关。但对其实用价值的评价尚有待进一步系统的、前瞻性的随访研究。
参考文献：
[1]秦环龙，何萍青，何德安.胃癌多基因及癌胚抗原同步检测的临床意义.中华普通外科杂志，1999，14(3)∶228-229
[2]Martin HM,Filipe ME,Morris RW,et al.p53 expression and prognosis in gastric carcinoma.Int J Cancer,1992,50∶859-860
[3]王彬，于永祥，张嘉庆，等.结直肠癌预后因素评估.中华外科杂志，1994，32(5)∶289-290
, 百拇医药
[4]张延龄.胃癌预后因素的研究近况.国外医学*外科学分册，1998，25(3)∶139-142
[5]安伟德，胡祥，郭武斌，等.C-erbB-2基因扩增与胃癌预后的关系.中国肿瘤临床，1996，23(12)∶8841-8844
[6]Steeg PS,Cohn KH,Leone A,et al.Tumor metastasis and nm23:current concepts.Cancer Cells,1994,3∶257-258
[7]王盛乾，洪东旭，吴若华.120例胃癌中p16、nm23-H1基因蛋白表达与临床预后的关系.实用肿瘤杂志，1997，12(3)∶108-110
收稿日期：1999-04-08, http://www.100md.com