骨肉瘤p－糖蛋白表达水平与肺转移
作者：沈靖南 王晋 韩士英 李佛保 廖威明 吴惠茜 丘钜世 郑迎东
单位：沈靖南 王晋 韩士英 李佛保 廖威明(510080 广州，中山医科大学第一附属医院骨科)；吴惠茜 丘钜世 郑迎东(中山医科大学统计教研室)
关键词：骨肉瘤；P-糖蛋白；抗药性，多药；肿瘤转移；肺；免疫组织化学
中华骨科杂志000105
【摘要】目的 研究骨肉瘤多药耐药性的表达与预后，证实p-糖蛋白(p-gp)介导骨肉瘤的MDR现象，明确p-gp表达与一年肺转移的关系。方法 采用免疫组化LSAB法，检测84例骨肉瘤中p-gp表达，半定量化计量p-gp的着色强度及阳性率，通过多因素相关分析和生存分析，探讨骨肉瘤预后的相关因素和高危因素。结果 (1)84例骨肉瘤p-gp表达阳性率55.1%，其中以低表达为主，占65.2%，高表达占34.8%。(2)随访84例骨肉瘤一年肺转移率为28.6%(24/84)，平均无瘤生存期16.4个月，一年生存率82%、二年生存率65%、三年生存率43%。(3)等级相关分析显示p-gp表达的着色强度与细胞阳性率呈正相关，相关系数rs=0.79(P<0.01)，着色强度和细胞阳性率均与一年肺转移率呈等级正相关，相关系数分别为0.28(P<0.05)和0.45(P<0.01)。(4)Logistic回归生存分析显示骨肉瘤p-gp表达的着色强度和细胞阳性率均与一年肺转移率有关，其优势比分别为3.24和2.17，即骨肉瘤p-gp表达的着色强度和细胞阳性率是一年肺转移率的危险因素，着色强度比细胞阳性率相对危险度大。结论 (1)p-gp机制介导骨肉瘤MDR现象。(2)骨肉瘤p-gp表达水平越高，一年内肺转移发生的可能性越大。(3)免疫组化检测骨肉瘤p-gp表达适合作为临床常规筛选检测。
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P- glycoprotein expression and pulmonary metastasis in osteosarcoma
SHEN JingnanWANG Jin HAN Shiying
(Department of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital, Sun Yat- sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)
【Abstract】 Objective The purpose of this study is to prove that the multidrug resistance of osteosarcoma is mediated by p- gp, with an attempt to evaluate the relation between p- gp level and pulmonary metastasis in osteosarcoma. Methods The expression of p- gp were retrospectively examined by immuno- histochemistry (LSAB) in 84 patients with osteosarcoma from 1994 to 1998. The intensity of antibody staining and the positive percentage of p- gp were semiquantitatively assessed. P- gp- positive and p- gp- negative, mcf- 7/ADM and mcf- 7 cell lines were used as standards to validate methods and control for variability. Human osteosarcoma cell line, HOS- 8603 and OS- 732, were selected as control sample. Based on clinical follow up results, statistical analysis was performed with the SPSS (statistical package) in order to estimate the relation between expression of p- gp and one year lung metastasis by rank correlation, the odds ratio for risk factors of lung metastasis by Logistic regression analysis, the mortality rate and the survival rate by life table method. Results 1)One year lung metastasis was 28.6% (24/84). The average diseases free survival time was 16.4 months. Life table showed that one year survival rate was 81.6% , two year 64.6% and three year 42.8% . 2)Osteosarcoma cell line, HOS- 8603, showed low level of p- gp expression, but OS- 732 did not show low level of p- gp expression. P- gp- positive and- negative cell lines showed correct control. 3)The benign bone tumor did not express p- gp. 4)Positive expression of p- gp in osteosarcoma was 55.1% (46/84). Most (30/46, 65.2% ) of positive expression were low level. 5)Rank correlation between the intensity of p- gp expression and one year lung metastasis rate was significant: rs=0.28,P<0.05; Rank correlation between percentage of p- gp staining and one- year lung metastasis rate was significant: rs="0.45," P< 0.01; Rank correlation between percentage of p- gp staining and the intensity of p- gp expression was significant: rs="0.79," P< 0.01. 6)Logistic regression: the intensity and percentage of p- gp staining were risk factors of one year lung metastasis. The odds ratio of intensity of p- gp expression was 3.24, 95% CI was 1.17～ 8.97; the odds ratio of the percentage of p- gp expression was 2.17, 95% CI was 1.35～ 3.51. The former was higher than the later. Patient s age and history were protecting factors. Conclusions 1)MDR of osteosarcoma is mediated by p- gp. 2)Expression of p- gp is a prognostical risk factor of one year lung metastasis. 3)The intensity of p- gp is more correlative with one year lung metastasis of osteosarcoma than the positive percentage of p- gp. 4)Immunohistochemical method is a simple, economic, efficient, repeatable and semiquantitative assay and can directly detect p- gp coded by mdr- 1. It is suitable for clinic detection for expression of p- gp in osteosarcoma.
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【Key words】 Osteosarcoma； P- glycoprotein； Drug resistance, multiple; Neoplasm metastasis; Lung; Immunohistochemistry
肿瘤的多药耐药性(multi-drugresistance,MDR)是指肿瘤细胞产生的一种特殊的交叉耐药现象，由细胞膜上的一种糖蛋白(permeabilityglycoprotein,p-gp)直接介导，它起药物泵功能，能将多种抗癌药物排出细胞外，从而耐受化疗。p-gp的表达有转录水平调节和翻译水平调节，后者可不伴有mRNA增加，仅p-gp过度表达，故在MDR现象中占主导地位的是p-gp表达的增加，对MDR细胞p-gp表达的检测比对mdr-1基因扩增的检测更能直接地反映MDR现象[1]。
本研究以免疫组化LSAB法，半定量检测骨肉瘤中mdr/p-gp的表达，明确骨肉瘤细胞中mdr/p-gp表达意义，是否与肺转移等预后指标相关；对骨肉瘤患者进行多因素生存分析，探讨骨肉瘤预后的相关因素和高危因素；建立检测骨肉瘤mdr-1表达的蛋白水平的定量模型，为临床应用和进一步逆转骨肉瘤的MDR现象提供依据。
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材料与方法
一、p-gp阳性及阴性对照的细胞株
骨肉瘤细胞系HOS8603，来源于第二军医大学长海医院，骨肉瘤细胞系OS732。mcf-7/S人乳癌细胞株及mcf-7/ADM耐阿霉素人乳癌细胞株，来源于美国NCI，我校符立梧副教授提供[2]。mcf-7/ADM过度表达p-gp，对ADM耐药约100倍。
二、免疫组化
1.标记链霉亲和素-生物素法，LSABKit，DAKO公司。取骨肉瘤石蜡标本切片，脱蜡水化，正常小牛血清封闭后加一抗,1∶20JSB-1(抗人p-gp内在抗原决定簇单克隆抗体，No1378970，BoehringerMannhein公司)。过夜后继续二抗,生物素交联抗鼠免疫球蛋白。三抗,链霉亲和素。
2.质量控制。每次实验均设立阳性及阴性对照组，只有LSAB阳性对照、p-gp阳性及阴性对照呈现典型的阳性及阴性着色，本组实验结果才可靠并录用。
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3.实验结果的判读。半定量镜下形态学观察计量，玻片按序取10个高倍视野(取三排，每排3、4、3个)，每个高倍视野下记数至少100个细胞，分别计量细胞p-gp的着色强度及阳性率。依着色判断着色强度：细胞浆及细胞膜无淡黄色颗粒沉积为阴性，散在淡黄色颗粒沉积为淡染，浓聚棕黄色块状沉积为浓染。细胞阳性率用阳性细胞比率判断。mdr/p-gp表达阳性标准为平均着色强度淡染以上并且阳性率≥10%。阳性标本中淡染并且细胞阳性率<50%，为p-gp低水平表达；阳性率≥50%为p-gp高水平表达。
三、病例资料
本组收集了本院从1994～1998年84例骨肉瘤病例。中心性骨肉瘤，骨母细胞型32例，软骨母细胞型11例，纤维母细胞型15例，混合型5例，圆形细胞型4例，血管扩张型7例，分类不明2例；表面性骨肉瘤8例。
Enneking外科分期：ⅡA期39例，ⅡB期45例。手术方式：按Enneking外科分期，分别施行广泛性切除术+保肢术或根治性切除术。
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术前化疗：①HD-MTX-CFR+②ADM-DDP，×1个循环，或和③瘤区动脉ADM介入。术后化疗：①HD-MTX-CFR+②ADM-DDP，×6～9个循环，MTX(EBEWE或P＆U)8g/m2,ADM(Elber)40mg/m2，DDP40mg/m2(或卡铂400mg/m2)。
四、随访
骨肉瘤肺转移的诊断：术后每个月定期复查和摄胸部X线片，每3个月CT扫描，若X线片可疑时立即CT扫描。根据我院以往的报告，骨肉瘤术后90%的肺转移在1年内发生，故将一年肺转移率作为随访指标。一年肺转移率：从穿刺活检确诊骨肉瘤时起，12个月内发生肺转移的比率。
五、统计分析
全部统计分析均使用SPSS软件包，如等级相关分析和Logistic回归模型生存分析。在Logistic回归模型生存分析中，若95%可信区间(CI)包含1则无统计学意义，95%CI>1则为危险因素，95%CI<1为保护因素。
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结果
一、一般资料
84例骨肉瘤平均随访21.3个月，平均无瘤生存期16.4个月，平均生存时间为27.3个月。继续随访21例(25%)，死亡34例(40.5%)，失访29例(34.5%)。随访结果：84例骨肉瘤1年肺转移率28.6%(24/84)，一年生存率82%,二年生存率65%,三年生存率43%。
二、免疫组化检测mdr/p-gp的表达
1.骨肉瘤细胞株mdr/p-gp的表达：骨肉瘤细胞株HOS8603低水平表达p-gp，骨肉瘤细胞系OS732不表达p-gp。敏感癌细胞株mcf-7不表达p-gp，耐药癌细胞株mcf-7/ADM高水平表达p-gp。均作为每次实验的对照组。
2.骨肉瘤组织切片mdr/p-gp的表达：本组骨肉瘤p-gp表达的阳性率为55.1%。阳性表达p-gp的骨肉瘤中，低水平表达占65.2%(图1)，高水平表达占34.8%(图2)。
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图1 骨肉瘤p-gp低水平表达(箭头所示为阳性颗粒)LSAB×400
图2 骨肉瘤p-gp高水平表达(箭头所示为阳性颗粒)LSAB×400
三、本组骨肉瘤p-gp表达与临床资料间的等级相关分析
等级相关(表1)分析显示骨肉瘤p-gp表达的着色强度和阳性率呈等级相关，骨肉瘤p-gp表达的着色强度和阳性率与1年肺转移率成等级正相关。年龄和病程呈正相关，年龄越大，病程越长。
表1 骨肉瘤p-gp表达与临床资料间的等级相关分析 临床资料
着色强度
阳性率
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年龄
病程
术前化疗
术后化疗
1年内肺转移率
着色强度
1.0
0.79**(69)
-
-
-
-
0.28*(61)
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阳性率
0.79**(69)
1.0
-
-
-
-
0.446**(61)
年龄
-
-
1.0
0.24*(74)
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-
-
-
病程
-
-
0.24*(74)
1.0
-
-
-
术前化疗
-
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-
-
-
1.0
0.36**(84)
-
术后化疗
-
-
-
-
0.36**(84)
1.0
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-
1年内肺转移率
0.28*(61)
0.446**(61)
-
-
-
-
1.0
注：*P<0.05，**P<0.01，表内数值为相关系数，括号内数值为样本量
四、Logistic回归分析骨肉瘤p-gp表达的着色强度和阳性率与一年内肺转移率的关系
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骨肉瘤p-gp表达的着色强度和阳性率与1年内肺转移率有关(表2)，而且是其危险因素，p-gp着色强度较阳性率优势比大。
表2 Logistic回归分析结果 检测指标
OR
95%CI
着色强度
3.24
1.17～8.97
阳性率
2.17
1.35～3.51
注：OR代表优势比，CI代表可信区间。若95%CI>1则为危险因素，95%CI<1为保护因素，95%CI包含1则无统计学意义
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讨论
一、骨肉瘤mdr/p-gp的表达和一年内肺转移率的关系
本组调查84例患者的年龄、病程、术前术后化疗、复发、一年肺转移率和肿瘤组织p-gp的表达。骨肉瘤p-gp表达的阳性率为55.1%，p-gp阳性表达中的65.2%为低表达。在等级相关分析中我们发现p-gp表达与1年肺转移率呈等级相关，提示p-gp机制参与骨肉瘤患者肺转移的发生，可以推测：骨肉瘤耐药细胞群逃逸了化疗药物的细胞毒作用，以致发生肺转移。Serra等[3]用半定量免疫荧光法检测105例骨肉瘤，其中38例经随访两年发现：p-gp过度表达与高转移率、预后不良有关。另外，在等级相关分析中，我们发现年龄的大小和病程呈正相关，这提示年龄的大小与肿瘤恶性生物学行为有关，从而影响病程的长短，这与Baldini等[4]的报告一致。另外Baldini等报道年龄≤14岁的患者p-gp表达水平高于年龄大的患者。我们对年龄没有做分层分析。
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本组病例统计学分析1年肺转移率的风险因素中，Logistic回归生存分析提示骨肉瘤中p-gp表达是一年肺转移率的危险因素，而且p-gp着色强度的优势比大于p-gp阳性率的优势比，即骨肉瘤中p-gp表达的着色强度越大，患者1年内发生肺转移的可能性越大。同时发现mdr/p-gp表达是无瘤生存期的危险因素，而且p-gp着色强度的相对危险度大于p-gp阳性率的相对危险度。
关于着色强度和阳性率哪个更有意义？Beck等[5]国际MDR合作组认为目前难分高低。本组病例数据统计处理过程中发现：在部分骨肉瘤病例随访未到12个月时，p-gp着色强度是唯一的与预后呈负相关的指标，但随访期超过1年后，p-gp着色强度和阳性率都显示有统计学意义。我们认为骨肉瘤组织分主流细胞群和稀有细胞群，它们表达p-gp有不同的预后价值：主流细胞群表达p-gp，体现于p-gp的表达量和范围，早期发生肺转移，预后不良；稀有细胞群表达p-gp的临床意义取决于着色强度。高水平表达，肺转移早，预后不良，而低水平表达，肺转移迟，预后好于前者。
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二、检测和评价p-gp表达的影响因素
免疫组化能直接检测MDR发挥作用的介导者——p-gp，具有简单、经济、省时和重复性好的优点。另外，等级相关分析证实p-gp的着色强度和p-gp阳性率呈等级正相关，故免疫组化检测p-gp表达适合作为临床病理常规筛选法。免疫组化缺点是主观半定量及敏感性有限。Chan等[6]推荐一种多层次免疫放大诊断系统能改善敏感性以及客观定量的方法[3]，但相应会增加假阳性。
检测mdr/p-gp表达可能与以下因素有关：(1)人体内mdr基因表达有低水平、不均匀、个体变异和广泛性的特点；(2)不同检测方法的敏感性和特异性；(3)标本的制备；(4)使用具有不同特异性、亲和力或识别不同抗原决定簇的p-gp免疫试剂，不同的间接诊断试剂和色原；(5)实验分组、标准细胞株参照体系、阳性标准及临床随访时间的不同；(6)mRNA的稳定性及翻译的比例不同。故在同质的条件下评价肿瘤标记和治疗靶点mdr-1基因显得尤其重要[1,5,6]。
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实验表明MDR表型是可逆的。如果将MDR细胞置于无选择化的培养液中，抗药性即可逐代降低或消失；体外几种非细胞毒药物竞争抑制p-gp，使MDR细胞敏感化；体内动物模型实验中，联合应用MDR相关细胞毒药物及逆转剂，能使肿瘤明显缩小，延长生命[7]。骨肉瘤耐药细胞株和动物模型的建立，mdr-1转基因小鼠的建立，都使逆转mdr-1成为可能[8]，可以见到临床逆转成功的报道[9]。为了指导临床合理用药，目前只是根据已建立的多种实验结果，部分的指导化疗：(1)使用非交叉耐药的化疗药物；(2)大剂量化疗联合骨髓移植；(3)应用逆转mdr-1的药物(如PSC833)、蛋白质或基因指导治疗(如抗mdr-1反义寡核苷酸片段、抗mdr-1单克隆抗体及抗mdr-1核糖核酸)。
综上所述，进一步完善实体肿瘤检测p-gp表达的方法，筛选新的高效、低毒、价廉的新一代骨肉瘤化疗药物，筛选体内效果确切、无明显毒副作用的骨肉瘤MDR逆转药物，是我们今后努力的方向[10]。
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基金项目：国家教委霍英东高等院校青年教师基金；卫生部优秀人才基金(96Q-018)
参考文献
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6，Chan HS, DeBoer G, Haddad G, et al. Multidrug drug resistance in pediatric sarcomas. Hematol Oncol Clin North Am, 1995, 9: 889- 908.
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10，Brach Del Prever A, Massara FM, Besenzon L, et al. Treatment of metastatic osteosarcoma with verapamil, cyclosporine and chemotherapy:a case report. Minerva Pediatr, 1995, 47: 147- 151.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药
单位：沈靖南 王晋 韩士英 李佛保 廖威明(510080 广州，中山医科大学第一附属医院骨科)；吴惠茜 丘钜世 郑迎东(中山医科大学统计教研室)
关键词：骨肉瘤；P-糖蛋白；抗药性，多药；肿瘤转移；肺；免疫组织化学
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【摘要】目的 研究骨肉瘤多药耐药性的表达与预后，证实p-糖蛋白(p-gp)介导骨肉瘤的MDR现象，明确p-gp表达与一年肺转移的关系。方法 采用免疫组化LSAB法，检测84例骨肉瘤中p-gp表达，半定量化计量p-gp的着色强度及阳性率，通过多因素相关分析和生存分析，探讨骨肉瘤预后的相关因素和高危因素。结果 (1)84例骨肉瘤p-gp表达阳性率55.1%，其中以低表达为主，占65.2%，高表达占34.8%。(2)随访84例骨肉瘤一年肺转移率为28.6%(24/84)，平均无瘤生存期16.4个月，一年生存率82%、二年生存率65%、三年生存率43%。(3)等级相关分析显示p-gp表达的着色强度与细胞阳性率呈正相关，相关系数rs=0.79(P<0.01)，着色强度和细胞阳性率均与一年肺转移率呈等级正相关，相关系数分别为0.28(P<0.05)和0.45(P<0.01)。(4)Logistic回归生存分析显示骨肉瘤p-gp表达的着色强度和细胞阳性率均与一年肺转移率有关，其优势比分别为3.24和2.17，即骨肉瘤p-gp表达的着色强度和细胞阳性率是一年肺转移率的危险因素，着色强度比细胞阳性率相对危险度大。结论 (1)p-gp机制介导骨肉瘤MDR现象。(2)骨肉瘤p-gp表达水平越高，一年内肺转移发生的可能性越大。(3)免疫组化检测骨肉瘤p-gp表达适合作为临床常规筛选检测。
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SHEN JingnanWANG Jin HAN Shiying
(Department of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital, Sun Yat- sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)
【Abstract】 Objective The purpose of this study is to prove that the multidrug resistance of osteosarcoma is mediated by p- gp, with an attempt to evaluate the relation between p- gp level and pulmonary metastasis in osteosarcoma. Methods The expression of p- gp were retrospectively examined by immuno- histochemistry (LSAB) in 84 patients with osteosarcoma from 1994 to 1998. The intensity of antibody staining and the positive percentage of p- gp were semiquantitatively assessed. P- gp- positive and p- gp- negative, mcf- 7/ADM and mcf- 7 cell lines were used as standards to validate methods and control for variability. Human osteosarcoma cell line, HOS- 8603 and OS- 732, were selected as control sample. Based on clinical follow up results, statistical analysis was performed with the SPSS (statistical package) in order to estimate the relation between expression of p- gp and one year lung metastasis by rank correlation, the odds ratio for risk factors of lung metastasis by Logistic regression analysis, the mortality rate and the survival rate by life table method. Results 1)One year lung metastasis was 28.6% (24/84). The average diseases free survival time was 16.4 months. Life table showed that one year survival rate was 81.6% , two year 64.6% and three year 42.8% . 2)Osteosarcoma cell line, HOS- 8603, showed low level of p- gp expression, but OS- 732 did not show low level of p- gp expression. P- gp- positive and- negative cell lines showed correct control. 3)The benign bone tumor did not express p- gp. 4)Positive expression of p- gp in osteosarcoma was 55.1% (46/84). Most (30/46, 65.2% ) of positive expression were low level. 5)Rank correlation between the intensity of p- gp expression and one year lung metastasis rate was significant: rs=0.28,P<0.05; Rank correlation between percentage of p- gp staining and one- year lung metastasis rate was significant: rs="0.45," P< 0.01; Rank correlation between percentage of p- gp staining and the intensity of p- gp expression was significant: rs="0.79," P< 0.01. 6)Logistic regression: the intensity and percentage of p- gp staining were risk factors of one year lung metastasis. The odds ratio of intensity of p- gp expression was 3.24, 95% CI was 1.17～ 8.97; the odds ratio of the percentage of p- gp expression was 2.17, 95% CI was 1.35～ 3.51. The former was higher than the later. Patient s age and history were protecting factors. Conclusions 1)MDR of osteosarcoma is mediated by p- gp. 2)Expression of p- gp is a prognostical risk factor of one year lung metastasis. 3)The intensity of p- gp is more correlative with one year lung metastasis of osteosarcoma than the positive percentage of p- gp. 4)Immunohistochemical method is a simple, economic, efficient, repeatable and semiquantitative assay and can directly detect p- gp coded by mdr- 1. It is suitable for clinic detection for expression of p- gp in osteosarcoma.
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肿瘤的多药耐药性(multi-drugresistance,MDR)是指肿瘤细胞产生的一种特殊的交叉耐药现象，由细胞膜上的一种糖蛋白(permeabilityglycoprotein,p-gp)直接介导，它起药物泵功能，能将多种抗癌药物排出细胞外，从而耐受化疗。p-gp的表达有转录水平调节和翻译水平调节，后者可不伴有mRNA增加，仅p-gp过度表达，故在MDR现象中占主导地位的是p-gp表达的增加，对MDR细胞p-gp表达的检测比对mdr-1基因扩增的检测更能直接地反映MDR现象[1]。
本研究以免疫组化LSAB法，半定量检测骨肉瘤中mdr/p-gp的表达，明确骨肉瘤细胞中mdr/p-gp表达意义，是否与肺转移等预后指标相关；对骨肉瘤患者进行多因素生存分析，探讨骨肉瘤预后的相关因素和高危因素；建立检测骨肉瘤mdr-1表达的蛋白水平的定量模型，为临床应用和进一步逆转骨肉瘤的MDR现象提供依据。
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材料与方法
一、p-gp阳性及阴性对照的细胞株
骨肉瘤细胞系HOS8603，来源于第二军医大学长海医院，骨肉瘤细胞系OS732。mcf-7/S人乳癌细胞株及mcf-7/ADM耐阿霉素人乳癌细胞株，来源于美国NCI，我校符立梧副教授提供[2]。mcf-7/ADM过度表达p-gp，对ADM耐药约100倍。
二、免疫组化
1.标记链霉亲和素-生物素法，LSABKit，DAKO公司。取骨肉瘤石蜡标本切片，脱蜡水化，正常小牛血清封闭后加一抗,1∶20JSB-1(抗人p-gp内在抗原决定簇单克隆抗体，No1378970，BoehringerMannhein公司)。过夜后继续二抗,生物素交联抗鼠免疫球蛋白。三抗,链霉亲和素。
2.质量控制。每次实验均设立阳性及阴性对照组，只有LSAB阳性对照、p-gp阳性及阴性对照呈现典型的阳性及阴性着色，本组实验结果才可靠并录用。
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3.实验结果的判读。半定量镜下形态学观察计量，玻片按序取10个高倍视野(取三排，每排3、4、3个)，每个高倍视野下记数至少100个细胞，分别计量细胞p-gp的着色强度及阳性率。依着色判断着色强度：细胞浆及细胞膜无淡黄色颗粒沉积为阴性，散在淡黄色颗粒沉积为淡染，浓聚棕黄色块状沉积为浓染。细胞阳性率用阳性细胞比率判断。mdr/p-gp表达阳性标准为平均着色强度淡染以上并且阳性率≥10%。阳性标本中淡染并且细胞阳性率<50%，为p-gp低水平表达；阳性率≥50%为p-gp高水平表达。
三、病例资料
本组收集了本院从1994～1998年84例骨肉瘤病例。中心性骨肉瘤，骨母细胞型32例，软骨母细胞型11例，纤维母细胞型15例，混合型5例，圆形细胞型4例，血管扩张型7例，分类不明2例；表面性骨肉瘤8例。
Enneking外科分期：ⅡA期39例，ⅡB期45例。手术方式：按Enneking外科分期，分别施行广泛性切除术+保肢术或根治性切除术。
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术前化疗：①HD-MTX-CFR+②ADM-DDP，×1个循环，或和③瘤区动脉ADM介入。术后化疗：①HD-MTX-CFR+②ADM-DDP，×6～9个循环，MTX(EBEWE或P＆U)8g/m2,ADM(Elber)40mg/m2，DDP40mg/m2(或卡铂400mg/m2)。
四、随访
骨肉瘤肺转移的诊断：术后每个月定期复查和摄胸部X线片，每3个月CT扫描，若X线片可疑时立即CT扫描。根据我院以往的报告，骨肉瘤术后90%的肺转移在1年内发生，故将一年肺转移率作为随访指标。一年肺转移率：从穿刺活检确诊骨肉瘤时起，12个月内发生肺转移的比率。
五、统计分析
全部统计分析均使用SPSS软件包，如等级相关分析和Logistic回归模型生存分析。在Logistic回归模型生存分析中，若95%可信区间(CI)包含1则无统计学意义，95%CI>1则为危险因素，95%CI<1为保护因素。
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结果
一、一般资料
84例骨肉瘤平均随访21.3个月，平均无瘤生存期16.4个月，平均生存时间为27.3个月。继续随访21例(25%)，死亡34例(40.5%)，失访29例(34.5%)。随访结果：84例骨肉瘤1年肺转移率28.6%(24/84)，一年生存率82%,二年生存率65%,三年生存率43%。
二、免疫组化检测mdr/p-gp的表达
1.骨肉瘤细胞株mdr/p-gp的表达：骨肉瘤细胞株HOS8603低水平表达p-gp，骨肉瘤细胞系OS732不表达p-gp。敏感癌细胞株mcf-7不表达p-gp，耐药癌细胞株mcf-7/ADM高水平表达p-gp。均作为每次实验的对照组。
2.骨肉瘤组织切片mdr/p-gp的表达：本组骨肉瘤p-gp表达的阳性率为55.1%。阳性表达p-gp的骨肉瘤中，低水平表达占65.2%(图1)，高水平表达占34.8%(图2)。
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图1 骨肉瘤p-gp低水平表达(箭头所示为阳性颗粒)LSAB×400
图2 骨肉瘤p-gp高水平表达(箭头所示为阳性颗粒)LSAB×400
三、本组骨肉瘤p-gp表达与临床资料间的等级相关分析
等级相关(表1)分析显示骨肉瘤p-gp表达的着色强度和阳性率呈等级相关，骨肉瘤p-gp表达的着色强度和阳性率与1年肺转移率成等级正相关。年龄和病程呈正相关，年龄越大，病程越长。
表1 骨肉瘤p-gp表达与临床资料间的等级相关分析 临床资料
着色强度
阳性率
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年龄
病程
术前化疗
术后化疗
1年内肺转移率
着色强度
1.0
0.79**(69)
-
-
-
-
0.28*(61)
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阳性率
0.79**(69)
1.0
-
-
-
-
0.446**(61)
年龄
-
-
1.0
0.24*(74)
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-
-
-
病程
-
-
0.24*(74)
1.0
-
-
-
术前化疗
-
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-
-
-
1.0
0.36**(84)
-
术后化疗
-
-
-
-
0.36**(84)
1.0
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-
1年内肺转移率
0.28*(61)
0.446**(61)
-
-
-
-
1.0
注：*P<0.05，**P<0.01，表内数值为相关系数，括号内数值为样本量
四、Logistic回归分析骨肉瘤p-gp表达的着色强度和阳性率与一年内肺转移率的关系
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骨肉瘤p-gp表达的着色强度和阳性率与1年内肺转移率有关(表2)，而且是其危险因素，p-gp着色强度较阳性率优势比大。
表2 Logistic回归分析结果 检测指标
OR
95%CI
着色强度
3.24
1.17～8.97
阳性率
2.17
1.35～3.51
注：OR代表优势比，CI代表可信区间。若95%CI>1则为危险因素，95%CI<1为保护因素，95%CI包含1则无统计学意义
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讨论
一、骨肉瘤mdr/p-gp的表达和一年内肺转移率的关系
本组调查84例患者的年龄、病程、术前术后化疗、复发、一年肺转移率和肿瘤组织p-gp的表达。骨肉瘤p-gp表达的阳性率为55.1%，p-gp阳性表达中的65.2%为低表达。在等级相关分析中我们发现p-gp表达与1年肺转移率呈等级相关，提示p-gp机制参与骨肉瘤患者肺转移的发生，可以推测：骨肉瘤耐药细胞群逃逸了化疗药物的细胞毒作用，以致发生肺转移。Serra等[3]用半定量免疫荧光法检测105例骨肉瘤，其中38例经随访两年发现：p-gp过度表达与高转移率、预后不良有关。另外，在等级相关分析中，我们发现年龄的大小和病程呈正相关，这提示年龄的大小与肿瘤恶性生物学行为有关，从而影响病程的长短，这与Baldini等[4]的报告一致。另外Baldini等报道年龄≤14岁的患者p-gp表达水平高于年龄大的患者。我们对年龄没有做分层分析。
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本组病例统计学分析1年肺转移率的风险因素中，Logistic回归生存分析提示骨肉瘤中p-gp表达是一年肺转移率的危险因素，而且p-gp着色强度的优势比大于p-gp阳性率的优势比，即骨肉瘤中p-gp表达的着色强度越大，患者1年内发生肺转移的可能性越大。同时发现mdr/p-gp表达是无瘤生存期的危险因素，而且p-gp着色强度的相对危险度大于p-gp阳性率的相对危险度。
关于着色强度和阳性率哪个更有意义？Beck等[5]国际MDR合作组认为目前难分高低。本组病例数据统计处理过程中发现：在部分骨肉瘤病例随访未到12个月时，p-gp着色强度是唯一的与预后呈负相关的指标，但随访期超过1年后，p-gp着色强度和阳性率都显示有统计学意义。我们认为骨肉瘤组织分主流细胞群和稀有细胞群，它们表达p-gp有不同的预后价值：主流细胞群表达p-gp，体现于p-gp的表达量和范围，早期发生肺转移，预后不良；稀有细胞群表达p-gp的临床意义取决于着色强度。高水平表达，肺转移早，预后不良，而低水平表达，肺转移迟，预后好于前者。
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二、检测和评价p-gp表达的影响因素
免疫组化能直接检测MDR发挥作用的介导者——p-gp，具有简单、经济、省时和重复性好的优点。另外，等级相关分析证实p-gp的着色强度和p-gp阳性率呈等级正相关，故免疫组化检测p-gp表达适合作为临床病理常规筛选法。免疫组化缺点是主观半定量及敏感性有限。Chan等[6]推荐一种多层次免疫放大诊断系统能改善敏感性以及客观定量的方法[3]，但相应会增加假阳性。
检测mdr/p-gp表达可能与以下因素有关：(1)人体内mdr基因表达有低水平、不均匀、个体变异和广泛性的特点；(2)不同检测方法的敏感性和特异性；(3)标本的制备；(4)使用具有不同特异性、亲和力或识别不同抗原决定簇的p-gp免疫试剂，不同的间接诊断试剂和色原；(5)实验分组、标准细胞株参照体系、阳性标准及临床随访时间的不同；(6)mRNA的稳定性及翻译的比例不同。故在同质的条件下评价肿瘤标记和治疗靶点mdr-1基因显得尤其重要[1,5,6]。
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实验表明MDR表型是可逆的。如果将MDR细胞置于无选择化的培养液中，抗药性即可逐代降低或消失；体外几种非细胞毒药物竞争抑制p-gp，使MDR细胞敏感化；体内动物模型实验中，联合应用MDR相关细胞毒药物及逆转剂，能使肿瘤明显缩小，延长生命[7]。骨肉瘤耐药细胞株和动物模型的建立，mdr-1转基因小鼠的建立，都使逆转mdr-1成为可能[8]，可以见到临床逆转成功的报道[9]。为了指导临床合理用药，目前只是根据已建立的多种实验结果，部分的指导化疗：(1)使用非交叉耐药的化疗药物；(2)大剂量化疗联合骨髓移植；(3)应用逆转mdr-1的药物(如PSC833)、蛋白质或基因指导治疗(如抗mdr-1反义寡核苷酸片段、抗mdr-1单克隆抗体及抗mdr-1核糖核酸)。
综上所述，进一步完善实体肿瘤检测p-gp表达的方法，筛选新的高效、低毒、价廉的新一代骨肉瘤化疗药物，筛选体内效果确切、无明显毒副作用的骨肉瘤MDR逆转药物，是我们今后努力的方向[10]。
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基金项目：国家教委霍英东高等院校青年教师基金；卫生部优秀人才基金(96Q-018)
参考文献
1，Hegewisch- Becker S, Hossfeld DK. The MDR phenotype in hematologic malignancies: prognostic relevance and future perspectives. Ann Hematol, 1996， 72: 105- 117.
2，Fairchild CR, Ivy SP, Kao- Shan CS, et al. Isolation of amplified and overexpressed DNA sequences from adriamycin- resistant human breast cancer cells. Cancer Res, 1987,47: 5141- 5148.
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3，Serra M, Scotlandi K, Manara MC, et al. Analysis of P- glycoprotein expression in osteosarcoma. Eur J Cancer (Am),1995, 31: 1998- 2002.
4，Baldini N, Scotlandi K, Barbanti- Brodano G, et al. Expression of P- glycoprotein in high- grade osteosarcomas in relation to clinical outcome. N Engl J Med, 1995, 333: 1380- 1385.
5，Beck WT, Grogan TM, Willman CL, et al. Methods to detect P- glycoprotein- associated multidrug resistance in patients tumors: consensus recommendations. Cancer Res, 1996, 56: 3010- 3020.
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6，Chan HS, DeBoer G, Haddad G, et al. Multidrug drug resistance in pediatric sarcomas. Hematol Oncol Clin North Am, 1995, 9: 889- 908.
7，Roessner A, Ueda Y, Bockhorn- Dworniczak B, et al. Prognostic implication of immunodetection of P glycoprotein in Ewing s sarcoma. J Cancer Res Clin Oncol, 1993, 119: 185- 189.
8，Sikic BI. Modulation of multidrug resistance: at the threshold. J Clin Oncol, 1993, 11: 1629- 1635.
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9 ，Takeshita H, Gebhardt MC, Springfield DS, et al. Experimental models for the study of drug resistance in osteosarcoma: P- glycoprotein- positive, murine osteosarcoma cell lines. J Bone Joint Surg (Am), 1996, 78: 366- 375.
10，Brach Del Prever A, Massara FM, Besenzon L, et al. Treatment of metastatic osteosarcoma with verapamil, cyclosporine and chemotherapy:a case report. Minerva Pediatr, 1995, 47: 147- 151.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药