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编号:10233827
氯沙坦和硝苯地平对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响
http://www.100md.com 《临床心血管病杂志》 2000年第1期
     作者:方奇志 钟宁 金满文

    单位:方奇志(同济医科大学基础医学院药理教研室 武汉,430030);钟宁(同济医科大学基础医学院药理教研室 武汉,430030);金满文(同济医科大学基础医学院药理教研室 武汉,430030)

    关键词:血管紧张素Ⅱ 血管平滑肌细胞 氯沙坦 硝苯地平

    临床心血管病杂志000115 摘 要:目的:观察血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的作用及AT1受体拮抗剂氯沙坦和钙通道阻滞剂硝苯地平对增殖的影响。方法:幼龄Wistar大鼠(4周龄)12只,分成对照组、AngⅡ组、氯沙坦加AngⅡ组及硝苯地平加AngⅡ组,采用组织块贴壁法培养胸主动脉平滑肌细胞,分别测定3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)的掺入量和细胞周期中各期细胞构成比。结果:Ang Ⅱ(0.1 μmol/L)作用24 h能使VSMC的3H-TdR与3H-Leu的掺入量比对照组(1%胎牛血清)增多,且S期和G2/M期细胞增多,细胞增殖指数增大。与Ang Ⅱ组相比,Ang Ⅱ加氯沙坦(10 μmol/L)组和Ang Ⅱ加硝苯地平(10 μmol/L)组,3H-TdR、3H-Leu的掺入量减少,S期细胞构成比和细胞增殖指数减少。结论:Ang Ⅱ对VSMC有促增殖作用,能被氯沙坦与硝苯地平所拮抗。
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    Effect of losartan and nifedipine on cell proliferation induced by

    angiotensinⅡin cultured rat thoracic vascular smooth muscle cellⅡin cultured rat thoracic vascular smooth muscle cell

    FANG Qi-zhi ZHONG Ning JIN Man-wen

    (Department of Pharmacology,College of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University,Wuhan 430030)

    Abstract:Objective:To investigate the effects of losartan and nifedipine on cell proliferation induced by Ang Ⅱ in cultured rat thoracic vascular smooth muscle cell(VSMC).Method:12 young rat (4-week old) were divided into control group,AngⅡ group,losartan and AngⅡ group,nifedipine and AngⅡ group.VSMC from thoracic aorta were isolated by outgrowth of the explant method.3 H-TdR and 3 H-Leu incorporation and cell cycle distribution were measured.Result:24 h exposure to Ang Ⅱ(0.1 μmol/L) caused an increase in 3 H-TdR and 3 H-Leu incorporation,cell mitogenic activity also increased. The proliferation was inhibited by losartan (10 μmol/L) and nifedipine (10 μmol/L). Pretreatment with losartan and nifedipine reduced percentages of S period cells and cells mitogenic activity induced by Ang Ⅱ. Conclusion:Losartan and nifedipine antagonized the proliferation of VSMC induced by Ang Ⅱ.
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    Key words:Angiotensin Ⅱ Vascular smooth muscle cell Losartan Nifedipine▲

    血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖是高血压血管重构、动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)和血管成形术后再狭窄(restenosis after angioplasty,RAA)病变的基础〔1〕。抑制VSMC增殖成为防治高血压、AS和RAA的重要环节。血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)作用于心脏与血管,使之增生肥大,形成重构而影响心血管功能,AngⅡ受体拮抗剂不仅可产生与血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)相似的临床疗效,而且可以避免由于ACEI特异性不高引起的一些不良反应。本文通过观察AT1受体拮抗剂Losartan(氯沙坦)和钙通道阻滞剂Nifedipine(硝苯地平)对Ang Ⅱ诱导的VSMC增殖的影响,为其临床应用提供理论及实验依据。
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    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 动物:雄性、4周龄Wistar大鼠(n=12)由同济医科大学实验动物学部提供。设对照组、AngⅡ

    组(A组)、氯沙坦加AngⅡ组(B组)及硝苯地平加AngⅡ组(C组)等4组。

    1.1.2 药品和试剂:胎牛血清(FCS)、M199培养基、D-MEM/F-12培养基为Gibco公司产品。胰蛋白酶、AngⅡ、硝苯地平为美国Sigma公司产品。氯沙坦由杜邦公司赠送。3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)由上海中国科学院原子能研究所提供,放射活度370 GBq/mmol。

    1.2 方法
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    1.2.1 VSMC培养:无菌条件下迅速取出大鼠胸主动脉,按组织块贴块法将平滑肌组织块移入培养瓶,加入M199培养液(10%FCS),于37℃培养箱密闭培养,静置5 d左右可见细胞从组织块周围呈梭形生长出来,每2 d换一次液体,细胞逐渐重叠生长达多层,高低起伏呈“峰,谷”状。细胞生长融合时,用0.1%胰蛋白酶消化,传代培养。实验采用第3~5代细胞。

    1.2.2 3H-TdR 、3H-Leu掺入量测定〔2〕:消化收集细胞,加入无血清D-MEM/F-12培养液调整细胞密度至5×105/ml,以每孔200 μl接种于96孔培养板:贴壁孵育24 h,细胞同步于静止期。实验按以下方案给药,对照组:1%FCS;A组:AngⅡ 0.1 μmol/L;B组:氯沙坦 10 μmol/L加AngⅡ 0.1 μmol/L;C组:硝苯地平 10 μmol/L加AngⅡ 0.1 μmol/L。氯沙坦和硝苯地平于加AngⅡ前1 h加入。给药培养12 h后每孔分别加入3H-TdR、3H-Leu,终浓度为37 kBq/ml,继续培养12 h。收样时弃去培养液,洗涤后加NaOH溶解细胞。溶解液收于闪烁瓶中,暗适应4 h后,在液体闪烁计数器(美国FJ 2107型)上进行放射强度检测。
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    1.2.3 细胞周期分析:以1×106/ml细胞密度接种在培养瓶中,培养24 h后换无血清D-MEM/F-12培养液作用24 h,按前述分组方案处理后继续培养24 h,分组收集的细胞用70%冷乙醇固定,碘化丙锭(PI 10 μg/ml、RNA酶50 mg/ml)37℃孵育30 min后,经流式细胞仪(Becton Dickinson,USA)进行细胞周期分析,微机处理分析细胞增殖动力周期中各期细胞数所占总细胞的百分比。并按分裂增殖指数=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%计算细胞分裂增殖指数。

    1.3 统计学处理

    结果以±s表示,采用t检验。

    2 结果
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    2.1 4组的3H-TdR、3H-Leu掺入量比较

    结果如表1所示。

    2.2 氯沙坦、硝苯地平对Ang Ⅱ诱导的培养大鼠VSMC增殖指数的影响

    氯沙坦、硝苯地平对AngⅡ诱导的培养大鼠VSMC增殖周期的影响见表2。

    B、C组的细胞增殖指数〔(22.7±1.51)、(23.0±2.06)〕亦减少,与A组(30.6±2.32)比较,均P<0.01。

    表1 4组的3H-TdR、3H-Leu掺入量测定结果比较 次/min,±s 组别
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    3 H-TdR

    3 H-Leu

    A组

    1 636.75±151.99

    490.33±68.70

    B组

    1 125.63±175.042)

    318.25±46.141)

    C组

    976.25±118.712)
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    289.80±62.721)

    对照组

    1 086.25±175.362)

    286.75±59.471)

    与A组比较,1)P<0.05,2)P<0.01表2 氯沙坦、硝苯地平对Ang Ⅱ诱导的培养大鼠VSMC增殖周期的影响%,±s 组别

    细胞增殖周期各期构成比

    G0/G1
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    S期

    G2/M期

    A组

    69.4±2.32

    21.6±4.65

    9.0±3.20

    B组

    77.3±1.512)

    14.2±3.471)

    8.5±3.63

    C组

    77.0±2.062)
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    15.2±0.521)

    7.8±1.97

    对照组

    84.7±0.562)

    13.2±1.212)

    2.1±1.351)

    与A组比较,1)P<0.05,2)P<0.013 讨论

    VSMC增殖、迁移可使血管腔增厚变窄、阻力增加引起血压升高;AS及RAA也以内皮损伤、血小板聚集、生长因子释放致VSMC增殖为基本病变,因而抑制VSMC增殖成为防治原发性高血压、冠心病的研究热点。
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    对于细胞增殖的研究方法较为常用的是3H-TdR掺入法。其原理是当细胞进入增殖期,细胞DNA开始复制,这时对底物胸腺嘧啶的需要增多;3H-TdR随之掺入到复制的DNA中,掺入3H-TdR越多,说明进入DNA复制期的细胞越多。3H-Leu掺入反映氨基酸摄取、蛋白质合成状态。流式细胞仪技术是根据细胞所处的不同时期DNA含量不同的原理,区分出处于不同时相的细胞。细胞周期由G0/G1期、S期、G2/M期组成,S期是DNA合成期,S期细胞构成比增多,反映细胞增殖活跃。细胞增殖指数是指处于S期和G2/M期细胞之和占总细胞数的比例,它反映该群细胞的增殖速度。本实验结果说明Ang Ⅱ作为一种生长因子在体外有促培养的VSMC增殖作用,AngⅡ使DNA和蛋白质合成明显增加,这与Briand等〔3〕和Bagby等〔4〕的结果一致。用流式细胞仪技术进行细胞增殖动力学分析,同样证实了AngⅡ能促进VSMC增殖,与对照组比S期和G2/M期细胞增多(P<0.05),细胞增殖指数增大(P<0.01),氯沙坦和硝苯地平处理后能减弱AngⅡ的促增殖作用,两者均能抑制AngⅡ诱导的VSMC的增殖。
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    肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)有重要和广泛的生理和病理生理作用,心血管局部RAS在血管壁肥厚中起着重要的作用〔5〕。RAS主要通过AngⅡ促生长作用,使VSMC和细胞外间质增生,从而在血管重构中发挥作用〔6〕。Bauyiedel等〔7〕证实在培养的人冠状动脉VSMC,AngⅡ能明显增加〔Ca2+〕i,并同步刺激VSMC增生。AngⅡ是VSMC强大的丝裂原,通过自分泌、旁分泌作用可刺激VSMC的DNA和蛋白质合成增加,导致细胞肥大与细胞数目增多。AngⅡ可诱导细胞内c-fos,c-myc,c-jun等原癌基因的表达〔8〕,c-fos和c-myc表达的产物,通过亮氨酸拉链形成异源二聚体,与DNA结合,促进细胞复制和转录。而且Ang Ⅱ还介导其他神经多肽或生长因子释放,如促进血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生存因子β(TGF-β1)、bFGF的合成和释放,当存在其他生长因子,如PDGF、bFGF、AngⅡ促VSMC分裂、增殖作用加强〔9〕。AngⅡ促生长作用是由AT1受体介导,通过G蛋白-磷脂酶C(PLC)-磷脂酰肌醇系统及酪氨酸蛋白激酶系统,导致胞内Ca2+浓度增高,激活蛋白激酶C(PKC)。一方面PKC可使核内基因转录增加,DNA和蛋白质合成增多;另一方面,升高的〔Ca2+i又可诱导原癌基因转录,促进细胞的DNA合成和增殖,即〔Ca2+i参与并中介这些生长因子作用。此外,AngⅡ和AT1受体结合激活酪氨酸蛋白激酶,使胞内40,45,70,77,82,115和117 ku蛋白增多,40,45 ku蛋白为有丝分裂激活蛋白(MAP)激酶,在细胞从G0期进入G1期中起重要作用,70~80 ku蛋白是一种局部粘附激酶,调节细胞的粘附、运动、增生〔10〕。因此,影响以上环节的药物可抑制AngⅡ的促生长作用。特异性AT1受体拮抗剂氯沙坦通过与受体结合,从受体水平阻断AngⅡ对VSMC的促增殖作用,从另一角度亦说明AT1受体介导AngⅡ促VSMC增殖作用。钙通道阻滞剂硝苯地平影响Ca2+进入细胞内并改变Ca2+的作用,从而抑制VSMC的异常增殖。■
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    参考文献:

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    [2]David V, Hochstenbach F, Rajagopalan S, et al. Mitogenic effects of ATP on vascular smooth muscle cells vs other growth factors and sympathetic cotransmitters. Am Physiol Soc,1993,12:137~141
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    [3]Briand V, Riva L, Galzin A M. Characterization of the angiotensin Ⅱ AT1 receptor subtype involved in DNA synthesis in cultured vascular smooth muscle cells. Br J Pharmacol,1994,112:1195~1201

    [4]Bagby S P, Kirk E A, Mitchell L H, et al. Proliferative synergy of ANG Ⅱ and EGF in porcine aortic vascular smooth muscle cells. Am J Physiol,1993,265:F239~F249

    [5]Dzau V J. Vascular renin-angiotensin system and vascular protection. J Cardiovasc Pharmacol,1993,22(Suppl 5):1~26
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    [6]陈修,陈维洲,曾贵云,等.心血管药理学.第2版,北京:人民卫生出版社,1997.247~248

    [7]Bauyiedel G, Windsteetter U, Ddmao S J. Migratory activity of human smooth muscle cells cultured from coronary and peripheral primary and restenotic lesions removed by percutaneous atherectomy. Circulation,1992,85:554~564

    [8]Naftilan A J. The role of angiotensin Ⅱ in vascular smooth muscle cell growth. J Cardiovasc Pharmacol,1992,20:37~41

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    [10]Okuda M, Kawahara Y, Nakayama I,et al. Angiotensin Ⅱ transudes its signal to focal adhesions via angiotensin Ⅱ type 1 receptors in vascular smooth muscle cells. FEBS Lett,1995,365:343~347

    收稿日期:1999-09-03, 百拇医药