中国人群凝血因子Ⅶ与心肌梗死的关系*
作者：陶蓉 于金德 陆林 乐玮 尤蓓 龚兰生
单位：陶蓉(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；于金德(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；陆林(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；乐玮(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；尤蓓(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；龚兰生(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)
关键词：心肌梗死；凝血因子Ⅶ；多态性(遗传学)
临床心血管病杂志000106 摘 要：目的：研究凝血因子Ⅶ(FⅦ)与心肌梗死(MI)的关系。方法：运用一期法检测74例MI患者和123例正常对照者的FⅦ活性，并以PCR-DGGE技术筛查研究对象FⅦ基因，分析比较两组的FⅦ活性及其遗传因素与MI之间关系。结果：MI患者FⅦ活性明显高于对照组(P<0.05)，FⅦ基因8号外显子Arg 353 Gln多态性(等位基因M1/M2)与FⅦ活性显著相关(P<0.05)，等位基因M2与低FⅦ活性有关。结论：FⅦ活性增高是冠心病患者发生MI的重要危险指标之一，Arg 353 Gln多态性可能是影响FⅦ活性的重要标志。
, 百拇医药
Analysis of the relationship between FⅦ and myocardial
infarction in a Chinese population
TAO Rong YU Jin-de LU Lin LE Wei YOU Bei GONG Lan-sheng
(Department of Cardiology,Ruijing Hospital,Shanghai Second
Medical University,Shanghai 200025)
Abstract：Objective：To investigate the relationship between coagulation factor Ⅶ(FⅦ) and myocardial infarction (MI).Method：Denaturing gradient gel electrophoresis technique was used to study FⅦ gene variation and plasma FⅦ activity was measured by an one-stage assay in 74 cases with MI as well as 123 normal controls.Result：Compared with the controls,plasma FⅦ activity was significantly higher in the MI (105.02±32.50 versus 95.29±23.73,P<0.05).Arg 353 Gln polymorphism in exon 8 was found,and was documented to be associated with FⅦ activity.Conclusion：Elevated FⅦ activity may be a risk factor for myocardial infarction in Chinese CHD patients,and Arg 353 Gln polymorphism may be a marker for FⅦ activity.
, 百拇医药
Key words：Myocardial infarction Factor Ⅶ Polymorphism(Genetics)▲
凝血因子Ⅶ(FⅦ)是凝血过程中的一个重要辅助因子〔1〕，是参与因子X外源性激活途径中唯一的凝血因子。目前认为血浆FⅦ活性增高(FⅦc)是冠心病(CHD)发生的危险因素〔2，3〕，特别是在致命性心脏病事件中。研究表明FⅦ基因多态性与FⅦ活性存在相关性〔4～6〕，如位于353位氨基酸Arg→Gln多态性(等位基因M1/M2)，等位基因M2与低FⅦc相关。类似研究国内尚未见报道。本研究首次在中国人群中探讨血浆FⅦ、心肌梗死(MI)发生与FⅦ基因多态性的关系，报告如下。
1 对象与方法
1.1 对象
, 百拇医药 MI组：74例，其中男59例，女15例，年龄(64.59±10.33)岁，均为陈旧性MI患者，来自上海市瑞金医院心内科。根据1979年WHO颁布的缺血性心脏病诊断标准，经冠状动脉造影证实。正常对照组：123例，其中男83例，女40例，年龄(45.84±10.38)岁，来自上海地区职工健康体验，经病史、体检、心电图等检查无CHD表现者。所有口服或静脉使用抗凝药物者均排除在本研究之外。
1.2 血浆FⅦ活性测定
采5 ml静脉血，分离血浆，按一期法测定〔7〕。
1.3 人基因组DNA抽提
进行酚-氯仿抽提外周血白细胞DNA，溶于TE中。
1.4 PCR
, http://www.100md.com
应用Bio-Rad公司软件Macmelt设计引物，在一侧引物5′端加一40个GC序列(GC-Clamp)，使PCR产物端形成Tm较高不易解链的“夹子”。
引物序列为：5′(GC-Clamp)TTGGCTTTCTC-TCCACAGG 3′；5′CAAATATCACGGAGTACA-TGT 3′
DNA扩增在Pelkin-Elam 9600 PCR仪上进行，50 μl反应体系中基因组DNA 500 ng，引物0.2 μmol/L，KCl 50 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 μmol/L，Taq DNA多聚酶1.5 u。PCR反应条件：94℃变性5 min，94℃变性45 s、50℃退火1 min、72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。
1.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
, 百拇医药
根据Macmelt软件模拟解链曲线的解链温度，选择7.5%聚丙烯凝胶，变性剂浓度梯度为60%～90%，电泳温度53℃，电压70V，电泳时间15 h。
1.6 DNA测序
DGGE电泳中割下异常条带，溶于三蒸水，重复PCR反应，反应产物经QIAquick试剂盒纯化，在ABI 377测序仪上直接测序。
1.7 统计学处理
两组均数间比较运用t检验，组间频数比较运用χ2检验。
2 结果
2.1 两组的临床及实验室检查结果比较
, 百拇医药
两组的临床及实验室检查结果比较见表1。
表1 两组的临床及实验室检查结果比较
±s
MI组
对照组
TG/(mmol.L-1)
1.48±0.84
1.25±0.86
TC/(mmol.L-1)
, 百拇医药
4.57±1.00
4.48±0.68
BMI/(kg.m-2)
24.61±3.01
23.68±3.36
血糖/(mmol.L-1)
5.39±1.12
5.42±0.56
收缩压/mmHg
132.30±22.232)
, 百拇医药
118.06±15.45
舒张压/mmHg
83.43±13.052)
77.41±11.41
FⅦ活性/%
105.02±32.501)
95.29±23.73
与对照组相比1)P<0.05，2)P<0.01
1 mmHg=0.133kPa
2.2 对照组和MI组FⅦ基因Arg 353 Gln多态性的基因型频数比较
, 百拇医药
通过PCR-DGGE技术，发现FⅦ基因8号外显子存在多态性(见图1)，经测序证实：10976位核苷酸发生G→A置换，导致353位氨基酸Arg→Gln(G→A)(等位基因M1/M2)。对照组中Arg 353 Gln多态性的M1/M2和M1/M1基因型各有13例和110例，等位基因频率为0.05和0.95；MI组各有4例和70例，等位基因频率为0.03和0.97，组间等位基因频率无显著性差异。
图1 8号外显子DGGE电泳图
↑为8号外显子M1M2基因型，其余条带均为M1M1基因型。
3 讨论
在1986年，NPHS〔2〕研究发现凝血因子Ⅶ活性是CHD的危险因素，特别是与致命性心血管事件明显相关。PRCOM研究〔3〕也得出类似结论：随访8年发现CHD患者FⅦc水平明显高于健康者。本研究探讨了FⅦ与MI发病的关系，比较了中国人群上海地区MI患者与健康对照者的血浆FⅦc，并对FⅦ基因进行筛查，以寻找与FⅦc相关的FⅦ遗传标志。结果显示MI患者中FⅦ活性明显高于对照组(表1)，提示FⅦ活性增高对CHD患者发生MI有促进作用。
, 百拇医药
研究发现正常对照组FⅦ Arg 353 Gln多态性与FⅦ活性存在相关性，等位基因M2与低FⅦ活性相关。MI组中虽该多态性与FⅦ活性的关系无统计学差异，但M1M2基因型的FⅦc比该组平均活性降低20%〔FⅦ活性分别是(105.02±32.50)%和(78.73±18.59)%〕，也提示M2与低FⅦc有关。由于多态性的频率过低，我们拟扩大样本进一步研究，同时也进一步分析对照组和MI组间等位基因频率的差异。一般理论推测Arg 353 Gln多态性位于FⅦ分子表面，可能影响FⅦ与组织因子或大分子底物的结合，Gln353改变了结合部位的长度，影响FⅦa活化。另外，Arg→Gln的置换可能使FⅦ蛋白质构象发生改变，Gln353分子通过反馈调节FⅦ代谢，导致肝脏合成减少或更易从血浆中清除。FⅦArg 353 Gln多态性是由英国的Green等〔4〕首次报道的，他应用限制性内切酶的方法发现该多态性决定FⅦ活性，Arg/Gln杂合子FⅦ活性比平均值降低22%。以后许多研究证实了这一发现〔4～6〕，该多态性已被作为影响FⅦ活性的重要标志。本研究无论是MI组还是对照组8号外显子Arg/Gln多态性频率仅0.05，与ECTIM研究〔5〕所示的0.10存在差异。这可能由于不同人种和不同群体间的差异，也可能是取样因素的影响。
, http://www.100md.com
综上所述，FⅦ活性增高是CHD患者发生MI的危险因素之一，Arg 353 Gln多态性也可能为影响FⅦ活性的重要标志。■
*上海市科委重大项目基金资助
参考文献:
[1]Hagen F S,Gray C L,O′ Hara P,et al.Characterization of a cDNA coding for human factor Ⅶ.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:2412～2416
[2]Mead T W,Mellows S,Brozovic M,et al.Haemostatic function and ischaemic heart disease:Principal result of the Northwick Park Heart Study.Lancet,1986,2:533
, http://www.100md.com
[3]Junker R,Heinrich J,Schulter H,et al.Coagulation factor Ⅶ and the risk of coronary heart disease in healthy men.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17:1539～1543
[4]Green F,Kelleher C,Wilkes H,et al.A common genetic polymorphism associated with lower coagulation factor Ⅶ levels in healthy individuals.Arterioscler Thromb,1991,11:540～546
[5]Lane A,Green F,Scarabin P Y,et al.Factor Ⅶ Arg/Gln353 polymorphism determines factor Ⅶ coagulant activity in paitents with myocardial infarction (M2) and contral subjects in belfast and in France but is not a strong indicator of M1 risk in the ECTIM study.Atheriosclerosis,1996,119:119～127
[6]Hunanlt M,Arbini A A,Lopacink S,et al.The Arg 353 Gln polymorphism reduced the level of coagulation factor Ⅶ.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17:2825～2829
收稿日期：1999-06-09, 百拇医药
单位：陶蓉(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；于金德(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；陆林(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；乐玮(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；尤蓓(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)；龚兰生(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 上海，200025)
关键词：心肌梗死；凝血因子Ⅶ；多态性(遗传学)
临床心血管病杂志000106 摘 要：目的：研究凝血因子Ⅶ(FⅦ)与心肌梗死(MI)的关系。方法：运用一期法检测74例MI患者和123例正常对照者的FⅦ活性，并以PCR-DGGE技术筛查研究对象FⅦ基因，分析比较两组的FⅦ活性及其遗传因素与MI之间关系。结果：MI患者FⅦ活性明显高于对照组(P<0.05)，FⅦ基因8号外显子Arg 353 Gln多态性(等位基因M1/M2)与FⅦ活性显著相关(P<0.05)，等位基因M2与低FⅦ活性有关。结论：FⅦ活性增高是冠心病患者发生MI的重要危险指标之一，Arg 353 Gln多态性可能是影响FⅦ活性的重要标志。
, 百拇医药
Analysis of the relationship between FⅦ and myocardial
infarction in a Chinese population
TAO Rong YU Jin-de LU Lin LE Wei YOU Bei GONG Lan-sheng
(Department of Cardiology,Ruijing Hospital,Shanghai Second
Medical University,Shanghai 200025)
Abstract：Objective：To investigate the relationship between coagulation factor Ⅶ(FⅦ) and myocardial infarction (MI).Method：Denaturing gradient gel electrophoresis technique was used to study FⅦ gene variation and plasma FⅦ activity was measured by an one-stage assay in 74 cases with MI as well as 123 normal controls.Result：Compared with the controls,plasma FⅦ activity was significantly higher in the MI (105.02±32.50 versus 95.29±23.73,P<0.05).Arg 353 Gln polymorphism in exon 8 was found,and was documented to be associated with FⅦ activity.Conclusion：Elevated FⅦ activity may be a risk factor for myocardial infarction in Chinese CHD patients,and Arg 353 Gln polymorphism may be a marker for FⅦ activity.
, 百拇医药
Key words：Myocardial infarction Factor Ⅶ Polymorphism(Genetics)▲
凝血因子Ⅶ(FⅦ)是凝血过程中的一个重要辅助因子〔1〕，是参与因子X外源性激活途径中唯一的凝血因子。目前认为血浆FⅦ活性增高(FⅦc)是冠心病(CHD)发生的危险因素〔2，3〕，特别是在致命性心脏病事件中。研究表明FⅦ基因多态性与FⅦ活性存在相关性〔4～6〕，如位于353位氨基酸Arg→Gln多态性(等位基因M1/M2)，等位基因M2与低FⅦc相关。类似研究国内尚未见报道。本研究首次在中国人群中探讨血浆FⅦ、心肌梗死(MI)发生与FⅦ基因多态性的关系，报告如下。
1 对象与方法
1.1 对象
, 百拇医药 MI组：74例，其中男59例，女15例，年龄(64.59±10.33)岁，均为陈旧性MI患者，来自上海市瑞金医院心内科。根据1979年WHO颁布的缺血性心脏病诊断标准，经冠状动脉造影证实。正常对照组：123例，其中男83例，女40例，年龄(45.84±10.38)岁，来自上海地区职工健康体验，经病史、体检、心电图等检查无CHD表现者。所有口服或静脉使用抗凝药物者均排除在本研究之外。
1.2 血浆FⅦ活性测定
采5 ml静脉血，分离血浆，按一期法测定〔7〕。
1.3 人基因组DNA抽提
进行酚-氯仿抽提外周血白细胞DNA，溶于TE中。
1.4 PCR
, http://www.100md.com
应用Bio-Rad公司软件Macmelt设计引物，在一侧引物5′端加一40个GC序列(GC-Clamp)，使PCR产物端形成Tm较高不易解链的“夹子”。
引物序列为：5′(GC-Clamp)TTGGCTTTCTC-TCCACAGG 3′；5′CAAATATCACGGAGTACA-TGT 3′
DNA扩增在Pelkin-Elam 9600 PCR仪上进行，50 μl反应体系中基因组DNA 500 ng，引物0.2 μmol/L，KCl 50 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 μmol/L，Taq DNA多聚酶1.5 u。PCR反应条件：94℃变性5 min，94℃变性45 s、50℃退火1 min、72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。
1.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
, 百拇医药
根据Macmelt软件模拟解链曲线的解链温度，选择7.5%聚丙烯凝胶，变性剂浓度梯度为60%～90%，电泳温度53℃，电压70V，电泳时间15 h。
1.6 DNA测序
DGGE电泳中割下异常条带，溶于三蒸水，重复PCR反应，反应产物经QIAquick试剂盒纯化，在ABI 377测序仪上直接测序。
1.7 统计学处理
两组均数间比较运用t检验，组间频数比较运用χ2检验。
2 结果
2.1 两组的临床及实验室检查结果比较
, 百拇医药
两组的临床及实验室检查结果比较见表1。
表1 两组的临床及实验室检查结果比较
±sMI组
对照组
TG/(mmol.L-1)
1.48±0.84
1.25±0.86
TC/(mmol.L-1)
, 百拇医药
4.57±1.00
4.48±0.68
BMI/(kg.m-2)
24.61±3.01
23.68±3.36
血糖/(mmol.L-1)
5.39±1.12
5.42±0.56
收缩压/mmHg
132.30±22.232)
, 百拇医药
118.06±15.45
舒张压/mmHg
83.43±13.052)
77.41±11.41
FⅦ活性/%
105.02±32.501)
95.29±23.73
与对照组相比1)P<0.05，2)P<0.01
1 mmHg=0.133kPa
2.2 对照组和MI组FⅦ基因Arg 353 Gln多态性的基因型频数比较
, 百拇医药
通过PCR-DGGE技术，发现FⅦ基因8号外显子存在多态性(见图1)，经测序证实：10976位核苷酸发生G→A置换，导致353位氨基酸Arg→Gln(G→A)(等位基因M1/M2)。对照组中Arg 353 Gln多态性的M1/M2和M1/M1基因型各有13例和110例，等位基因频率为0.05和0.95；MI组各有4例和70例，等位基因频率为0.03和0.97，组间等位基因频率无显著性差异。
图1 8号外显子DGGE电泳图
↑为8号外显子M1M2基因型，其余条带均为M1M1基因型。
3 讨论
在1986年，NPHS〔2〕研究发现凝血因子Ⅶ活性是CHD的危险因素，特别是与致命性心血管事件明显相关。PRCOM研究〔3〕也得出类似结论：随访8年发现CHD患者FⅦc水平明显高于健康者。本研究探讨了FⅦ与MI发病的关系，比较了中国人群上海地区MI患者与健康对照者的血浆FⅦc，并对FⅦ基因进行筛查，以寻找与FⅦc相关的FⅦ遗传标志。结果显示MI患者中FⅦ活性明显高于对照组(表1)，提示FⅦ活性增高对CHD患者发生MI有促进作用。
, 百拇医药
研究发现正常对照组FⅦ Arg 353 Gln多态性与FⅦ活性存在相关性，等位基因M2与低FⅦ活性相关。MI组中虽该多态性与FⅦ活性的关系无统计学差异，但M1M2基因型的FⅦc比该组平均活性降低20%〔FⅦ活性分别是(105.02±32.50)%和(78.73±18.59)%〕，也提示M2与低FⅦc有关。由于多态性的频率过低，我们拟扩大样本进一步研究，同时也进一步分析对照组和MI组间等位基因频率的差异。一般理论推测Arg 353 Gln多态性位于FⅦ分子表面，可能影响FⅦ与组织因子或大分子底物的结合，Gln353改变了结合部位的长度，影响FⅦa活化。另外，Arg→Gln的置换可能使FⅦ蛋白质构象发生改变，Gln353分子通过反馈调节FⅦ代谢，导致肝脏合成减少或更易从血浆中清除。FⅦArg 353 Gln多态性是由英国的Green等〔4〕首次报道的，他应用限制性内切酶的方法发现该多态性决定FⅦ活性，Arg/Gln杂合子FⅦ活性比平均值降低22%。以后许多研究证实了这一发现〔4～6〕，该多态性已被作为影响FⅦ活性的重要标志。本研究无论是MI组还是对照组8号外显子Arg/Gln多态性频率仅0.05，与ECTIM研究〔5〕所示的0.10存在差异。这可能由于不同人种和不同群体间的差异，也可能是取样因素的影响。
, http://www.100md.com
综上所述，FⅦ活性增高是CHD患者发生MI的危险因素之一，Arg 353 Gln多态性也可能为影响FⅦ活性的重要标志。■
*上海市科委重大项目基金资助
参考文献:
[1]Hagen F S,Gray C L,O′ Hara P,et al.Characterization of a cDNA coding for human factor Ⅶ.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:2412～2416
[2]Mead T W,Mellows S,Brozovic M,et al.Haemostatic function and ischaemic heart disease:Principal result of the Northwick Park Heart Study.Lancet,1986,2:533
, http://www.100md.com
[3]Junker R,Heinrich J,Schulter H,et al.Coagulation factor Ⅶ and the risk of coronary heart disease in healthy men.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17:1539～1543
[4]Green F,Kelleher C,Wilkes H,et al.A common genetic polymorphism associated with lower coagulation factor Ⅶ levels in healthy individuals.Arterioscler Thromb,1991,11:540～546
[5]Lane A,Green F,Scarabin P Y,et al.Factor Ⅶ Arg/Gln353 polymorphism determines factor Ⅶ coagulant activity in paitents with myocardial infarction (M2) and contral subjects in belfast and in France but is not a strong indicator of M1 risk in the ECTIM study.Atheriosclerosis,1996,119:119～127
[6]Hunanlt M,Arbini A A,Lopacink S,et al.The Arg 353 Gln polymorphism reduced the level of coagulation factor Ⅶ.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17:2825～2829
收稿日期：1999-06-09, 百拇医药