甲硝唑对头孢噻肟钠蛋白结合影响的研究*
作者：王大为 郑莹 李发美
单位：王大为 郑莹 李发美(沈阳药科大学分析化学教研室 110015)
关键词：头孢噻肟钠；甲硝唑；超滤法；高效液相色谱法；蛋白结合率
药物分析杂志000103 摘 要：目的：测定甲硝唑对头孢噻肟钠蛋白结合率的影响。方法：采用超滤法结合高效液相色谱法测出游离药物浓度，比较未加和加入甲硝唑后头孢噻肟钠的蛋白结合率。结果：头孢噻肟钠的超滤回收率为99.1%，未加及加入甲硝唑后头孢噻肟钠的蛋白结合率分别为32.2%和30.8%。结论：甲硝唑对头孢噻肟钠的蛋白结合率基本无影响。
Study on the Effect of Metronidazole on Protein-Binding of Cefotaxime
Wang Dawei Zheng Ying Li Famei
, 百拇医药
(Department of Analytical Chemistry,Shenyang Pharmaceutical University，110015)
Abstract：Objective：The effect of metronidazole on the protein-binding rate of cefotaxime to human serum albumin(HSA) was determined.Method:Ultrafiltration and HPLC were employed to measure the conc. of free drug.The difference in protein-binding between cefotaxime alone and together with metronidazole was examined.Results:The ultrafiltration recovery of cefotaxime was 99.1%.The protein-binding of cefotaxime to HSA was 32.2% and 30.8% when incubated without and with metronidazole respectively.Conclusion:The protein binding of cefotaxime to HSA was not disturbed by metronidazole.
, 百拇医药
Key words：cefotaxime,metronidazole,ultrafiltration,HPLC,protein-binding▲
头孢噻肟钠是第三代头孢菌素，临床上有时需要与甲硝唑联合用药。头孢噻肟钠与甲硝唑注射液配伍的稳定性已有人考察过[1]，但头孢噻肟钠与甲硝唑配伍后，甲硝唑对头孢噻肟钠的血浆蛋白结合率的影响却没见有人报道。目前测定药物血浆蛋白结合率的方法有平衡透析、超滤、微透析、高效迎头分析、毛细管电泳等方法，其中超滤法因其快速、简便而在临床实验室中得到广泛应用。国外许多文章报道了用超滤法测定不同药物的血浆蛋白结合率[2～6]，国内的研究[7，8]也表明：超滤法可作为监测游离药物浓度的一种实用可靠的方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Hitachi 655型高效液相色谱仪，Hitachi 638型可变波长检测器，江申色谱工作站，微量取样器，截留分子量10 kD的超滤管(Gelman Science公司)，TGL-16G型台式高速离心机，H-1型微型混合器，pHs-3C型酸度计。
, http://www.100md.com
1.2 试药 头孢噻肟钠标准品(中国药品生物制品检定所)，甲硝唑原料药(辽宁省药品检验所提供)，人血清白蛋白(HSA，Sigma公司)，甲醇(色谱纯)，其他试剂均为分析纯。
1.3 试液配制
1.3.1 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的配制 将0.067 mol.L-1磷酸氢二钠溶液与0.067 mol.L-1磷酸二氢钾溶液按4∶1体积比混匀，必要时用磷酸调pH至7.4。
1.3.2 头孢噻肟钠标准液的配制 精密称取头孢噻肟钠标准品6 mg，用上述磷酸盐缓冲液定容至25 mL，即得到浓度为240 μg.mL-1的头孢噻肟钠标准液。
1.3.3 甲硝唑标准液的配制 精密称取甲硝唑原料药6 mg，用磷酸盐缓冲液定容至50 mL，即得到浓度为120 μg.mL-1的甲硝唑标准液。
, 百拇医药
1.3.4 HSA 溶液的配制 称取HSA 600 mg，用磷酸盐缓冲液定容至10 mL，得到浓度为6%的HSA溶液。
2 色谱条件
参照测定头孢噻肟钠血清浓度的HPLC方法[9]，采用如下色谱条件分离甲硝唑和头孢噻肟钠。色谱柱：Apex ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Jones Chromatography,UK)；柱温：室温；流动相：0.01 mol.L-1醋酸钠及醋酸缓冲液(pH 4.3)-甲醇(82∶18)；流速：0.7 mL.min-1；检测波长：254 nm。在此色谱条件下，测得超滤液中头孢噻肟钠与甲硝唑的HPLC色谱图见图1。
图1 头孢噻肟钠和甲硝唑的HPLC色谱图
, 百拇医药
1.甲硝唑 2.头孢噻肟钠
3 标准曲线
用磷酸盐缓冲液将头孢噻肟钠标准液分别稀释成浓度为10，20，40，80，160 μg.mL-1的溶液，每个浓度进样3次，每次20 μL，测得峰面积A的平均值与浓度C进行回归分析，得回归方程为：
A=-1.377×105+2.228×105C r=0.999 9
4 回收率试验
分别吸取头孢噻肟钠和甲硝唑标准液50 μL，与磷酸盐缓冲液250 μL混匀后，3000 r.min-1离心15 min超滤，取超滤液进样20 μL，测得峰面积A1；上述溶液不经超滤，直接进样测得峰面积A2。A1与A2的比值为超滤回收率，头孢噻肟钠与甲硝唑的平均回收率分别为99.1%和97.9%，RSD分别为0.99%和0.27%(n=3)。
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5 培育时间对头孢噻肟钠蛋白结合率的影响
精密吸取头孢噻肟钠标准液50 μL，磷酸盐缓冲液250 μL，混匀后进样20 μL，得峰面积A0。另取头孢噻肟钠标准液50 μL，磷酸盐缓冲液50 μL，HSA溶液(浓度为0.2%)200 μL，混匀放入37 ℃水浴中培育10，20，30 min，超滤后进样，得峰面积A1,A2，A3。蛋白结合率分别为(
0-i)/0(i=1,2,3)。
6 甲硝唑对头孢噻肟钠蛋白结合率的影响
, http://www.100md.com
精密吸取头孢噻肟钠标准液50 μL，甲硝唑标准液50 μL，磷酸盐缓冲液200 μL，混匀进样测得头孢噻肟钠的峰面积A0。另取头孢噻肟钠标准液50 μL，缓冲液50 μL，HSA溶液200 μL，混匀，37 ℃培育10 min，超滤后进样，得头孢噻肟钠的峰面积A1。再取头孢噻肟钠标准液50 μL，甲硝唑标准液50 μL，HSA溶液200 μL，混匀，37 ℃培育10 min，超滤后进样，得头孢噻肟钠的峰面积A2。比较未加及加入甲硝唑后头孢噻肟钠与HSA的结合率(以峰面积计算)。
7 结果
见表1，由峰面积计算在未加及加入甲硝唑后头孢噻肟钠的蛋白结合率分别为32.2%和30.8%，t检验2者无显著性差异(P>0.05)，表明甲硝唑对头孢噻肟钠的蛋白结合率基本上没有影响。
表1 甲硝唑对头孢噻肟钠蛋白结合率的影响 峰面积
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A0
A1
A2
1
8996028
6157041
6038397
2
8928921
6100820
6295196
3
, http://www.100md.com
9005564
6082601
6366209
均值
9010171
6113487
6233267
头孢噻肟钠的蛋白结合率
32.2%
30.8%
8 讨论
8.1 培育时间的选择 当HSA浓度为0.2%时，头孢噻肟钠在10，20，30 min 3个时间点的蛋白结合率分别为13.7%，14.8%，12.9%，3者无显著性差异(t检验：P>0.05)，说明头孢噻肟钠在10 min内几乎与蛋白结合达到平衡。又因37 ℃恒温水浴培育较长时间后会出现明显的杂质峰，故本实验选择37 ℃培育10 min。
, 百拇医药
8.2 检测波长的选择 头孢噻肟钠水溶液在(235±2) nm处有最大吸收，甲硝唑在277 nm处有最大吸收，在241 nm处有最小吸收，根据肖华等在考察头孢噻肟钠与甲硝唑配伍稳定性实验中波长的选择[1]，本实验选择波长在254 nm检测头孢噻肟钠与甲硝唑，2者灵敏度较好。
8.3 超滤管截留分子量的选择 考虑白蛋白的分子量为69 000 D，实验开始时选择截留分子量为30 kD的超滤管，杂质峰较大。后改用截留分子量为10 kD的超滤管，3 000 r.min-1下超滤15 min即可。■
*辽宁省自然科学基金资助项目(962234)
参考文献：
[1]肖华，汤韧，王志朝.头孢噻肟钠与甲硝唑注射液的配伍稳定性实验.药物实践杂志，1996，14(3)：159
, 百拇医药
[2]Oravcovii J,Bhs B,Lindner W.Drug-protein binding studies.New trends in analytical and experimental methodology.J Chromatogr B,1996,677(1):1
[3]Wright JD,Boudinot FD,Ujhelyi MR.Measurement and analysis of unbound drug concentration.Clin Pharmacokinet,1996,30(6):455
[4]Mueller HW,Eitel J.Quality control in the determination of cortisol in plasma/serum by using,on every sample,two different three-step separation methods including ultrafiltration,restricted-access high-performance liquid chromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography,and contrasting results to immunoassays.J Chromatogr B,1996,678(2):137
, 百拇医药
[5]Malhotra BK,Lemaire M,Brouillard JF,et al.High-performance liquid chromatographic analysis of (S)-α-amino-5-phosphonomethyl[1,1'-biphenyl]-3-propanoic acid(EAB515)in brain and blood microdialysate (on-line) and in plasma ultrafiltrate of freely moving rats.J Chromatogr B,1996,679(1-2):167
[6]Rosell-Rovira ML,Pou-Clavé L,Lopez-Galera R,et al.Determination of free serum diolanosine by ultrafiltration and high-performance liquid chromatography.J Chromatogr B,1996,675(1):89
[7]汪逸平，蒋永培，李敏等.癫痫患者血清、血清超滤液、唾液、脑脊液中苯妥英浓度的相关性和动力学研究.中国医院药学杂志，1993，13(1)：5
[8]曹国颖，孙春华，傅得兴等.苯妥英钠、卡马西平在血清、血清超滤液、唾液中浓度的监测与相关性探讨.中国药房，1995，6(5)：27
[9]李发美，郭礼新.高效液相色谱法测定血清中头孢噻肟浓度.色谱，1997，15(6)：512
收稿日期：1998-12-21, 百拇医药
单位：王大为 郑莹 李发美(沈阳药科大学分析化学教研室 110015)
关键词：头孢噻肟钠；甲硝唑；超滤法；高效液相色谱法；蛋白结合率
药物分析杂志000103 摘 要：目的：测定甲硝唑对头孢噻肟钠蛋白结合率的影响。方法：采用超滤法结合高效液相色谱法测出游离药物浓度，比较未加和加入甲硝唑后头孢噻肟钠的蛋白结合率。结果：头孢噻肟钠的超滤回收率为99.1%，未加及加入甲硝唑后头孢噻肟钠的蛋白结合率分别为32.2%和30.8%。结论：甲硝唑对头孢噻肟钠的蛋白结合率基本无影响。
Study on the Effect of Metronidazole on Protein-Binding of Cefotaxime
Wang Dawei Zheng Ying Li Famei
, 百拇医药
(Department of Analytical Chemistry,Shenyang Pharmaceutical University，110015)
Abstract：Objective：The effect of metronidazole on the protein-binding rate of cefotaxime to human serum albumin(HSA) was determined.Method:Ultrafiltration and HPLC were employed to measure the conc. of free drug.The difference in protein-binding between cefotaxime alone and together with metronidazole was examined.Results:The ultrafiltration recovery of cefotaxime was 99.1%.The protein-binding of cefotaxime to HSA was 32.2% and 30.8% when incubated without and with metronidazole respectively.Conclusion:The protein binding of cefotaxime to HSA was not disturbed by metronidazole.
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Key words：cefotaxime,metronidazole,ultrafiltration,HPLC,protein-binding▲
头孢噻肟钠是第三代头孢菌素，临床上有时需要与甲硝唑联合用药。头孢噻肟钠与甲硝唑注射液配伍的稳定性已有人考察过[1]，但头孢噻肟钠与甲硝唑配伍后，甲硝唑对头孢噻肟钠的血浆蛋白结合率的影响却没见有人报道。目前测定药物血浆蛋白结合率的方法有平衡透析、超滤、微透析、高效迎头分析、毛细管电泳等方法，其中超滤法因其快速、简便而在临床实验室中得到广泛应用。国外许多文章报道了用超滤法测定不同药物的血浆蛋白结合率[2～6]，国内的研究[7，8]也表明：超滤法可作为监测游离药物浓度的一种实用可靠的方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Hitachi 655型高效液相色谱仪，Hitachi 638型可变波长检测器，江申色谱工作站，微量取样器，截留分子量10 kD的超滤管(Gelman Science公司)，TGL-16G型台式高速离心机，H-1型微型混合器，pHs-3C型酸度计。
, http://www.100md.com
1.2 试药 头孢噻肟钠标准品(中国药品生物制品检定所)，甲硝唑原料药(辽宁省药品检验所提供)，人血清白蛋白(HSA，Sigma公司)，甲醇(色谱纯)，其他试剂均为分析纯。
1.3 试液配制
1.3.1 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的配制 将0.067 mol.L-1磷酸氢二钠溶液与0.067 mol.L-1磷酸二氢钾溶液按4∶1体积比混匀，必要时用磷酸调pH至7.4。
1.3.2 头孢噻肟钠标准液的配制 精密称取头孢噻肟钠标准品6 mg，用上述磷酸盐缓冲液定容至25 mL，即得到浓度为240 μg.mL-1的头孢噻肟钠标准液。
1.3.3 甲硝唑标准液的配制 精密称取甲硝唑原料药6 mg，用磷酸盐缓冲液定容至50 mL，即得到浓度为120 μg.mL-1的甲硝唑标准液。
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1.3.4 HSA 溶液的配制 称取HSA 600 mg，用磷酸盐缓冲液定容至10 mL，得到浓度为6%的HSA溶液。
2 色谱条件
参照测定头孢噻肟钠血清浓度的HPLC方法[9]，采用如下色谱条件分离甲硝唑和头孢噻肟钠。色谱柱：Apex ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Jones Chromatography,UK)；柱温：室温；流动相：0.01 mol.L-1醋酸钠及醋酸缓冲液(pH 4.3)-甲醇(82∶18)；流速：0.7 mL.min-1；检测波长：254 nm。在此色谱条件下，测得超滤液中头孢噻肟钠与甲硝唑的HPLC色谱图见图1。
图1 头孢噻肟钠和甲硝唑的HPLC色谱图
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1.甲硝唑 2.头孢噻肟钠
3 标准曲线
用磷酸盐缓冲液将头孢噻肟钠标准液分别稀释成浓度为10，20，40，80，160 μg.mL-1的溶液，每个浓度进样3次，每次20 μL，测得峰面积A的平均值与浓度C进行回归分析，得回归方程为：
A=-1.377×105+2.228×105C r=0.999 9
4 回收率试验
分别吸取头孢噻肟钠和甲硝唑标准液50 μL，与磷酸盐缓冲液250 μL混匀后，3000 r.min-1离心15 min超滤，取超滤液进样20 μL，测得峰面积A1；上述溶液不经超滤，直接进样测得峰面积A2。A1与A2的比值为超滤回收率，头孢噻肟钠与甲硝唑的平均回收率分别为99.1%和97.9%，RSD分别为0.99%和0.27%(n=3)。
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5 培育时间对头孢噻肟钠蛋白结合率的影响
精密吸取头孢噻肟钠标准液50 μL，磷酸盐缓冲液250 μL，混匀后进样20 μL，得峰面积A0。另取头孢噻肟钠标准液50 μL，磷酸盐缓冲液50 μL，HSA溶液(浓度为0.2%)200 μL，混匀放入37 ℃水浴中培育10，20，30 min，超滤后进样，得峰面积A1,A2，A3。蛋白结合率分别为(
0-i)/0(i=1,2,3)。6 甲硝唑对头孢噻肟钠蛋白结合率的影响
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精密吸取头孢噻肟钠标准液50 μL，甲硝唑标准液50 μL，磷酸盐缓冲液200 μL，混匀进样测得头孢噻肟钠的峰面积A0。另取头孢噻肟钠标准液50 μL，缓冲液50 μL，HSA溶液200 μL，混匀，37 ℃培育10 min，超滤后进样，得头孢噻肟钠的峰面积A1。再取头孢噻肟钠标准液50 μL，甲硝唑标准液50 μL，HSA溶液200 μL，混匀，37 ℃培育10 min，超滤后进样，得头孢噻肟钠的峰面积A2。比较未加及加入甲硝唑后头孢噻肟钠与HSA的结合率(以峰面积计算)。
7 结果
见表1，由峰面积计算在未加及加入甲硝唑后头孢噻肟钠的蛋白结合率分别为32.2%和30.8%，t检验2者无显著性差异(P>0.05)，表明甲硝唑对头孢噻肟钠的蛋白结合率基本上没有影响。
表1 甲硝唑对头孢噻肟钠蛋白结合率的影响 峰面积
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A0
A1
A2
1
8996028
6157041
6038397
2
8928921
6100820
6295196
3
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9005564
6082601
6366209
均值
9010171
6113487
6233267
头孢噻肟钠的蛋白结合率
32.2%
30.8%
8 讨论
8.1 培育时间的选择 当HSA浓度为0.2%时，头孢噻肟钠在10，20，30 min 3个时间点的蛋白结合率分别为13.7%，14.8%，12.9%，3者无显著性差异(t检验：P>0.05)，说明头孢噻肟钠在10 min内几乎与蛋白结合达到平衡。又因37 ℃恒温水浴培育较长时间后会出现明显的杂质峰，故本实验选择37 ℃培育10 min。
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8.2 检测波长的选择 头孢噻肟钠水溶液在(235±2) nm处有最大吸收，甲硝唑在277 nm处有最大吸收，在241 nm处有最小吸收，根据肖华等在考察头孢噻肟钠与甲硝唑配伍稳定性实验中波长的选择[1]，本实验选择波长在254 nm检测头孢噻肟钠与甲硝唑，2者灵敏度较好。
8.3 超滤管截留分子量的选择 考虑白蛋白的分子量为69 000 D，实验开始时选择截留分子量为30 kD的超滤管，杂质峰较大。后改用截留分子量为10 kD的超滤管，3 000 r.min-1下超滤15 min即可。■
*辽宁省自然科学基金资助项目(962234)
参考文献：
[1]肖华，汤韧，王志朝.头孢噻肟钠与甲硝唑注射液的配伍稳定性实验.药物实践杂志，1996，14(3)：159
, 百拇医药
[2]Oravcovii J,Bhs B,Lindner W.Drug-protein binding studies.New trends in analytical and experimental methodology.J Chromatogr B,1996,677(1):1
[3]Wright JD,Boudinot FD,Ujhelyi MR.Measurement and analysis of unbound drug concentration.Clin Pharmacokinet,1996,30(6):455
[4]Mueller HW,Eitel J.Quality control in the determination of cortisol in plasma/serum by using,on every sample,two different three-step separation methods including ultrafiltration,restricted-access high-performance liquid chromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography,and contrasting results to immunoassays.J Chromatogr B,1996,678(2):137
, 百拇医药
[5]Malhotra BK,Lemaire M,Brouillard JF,et al.High-performance liquid chromatographic analysis of (S)-α-amino-5-phosphonomethyl[1,1'-biphenyl]-3-propanoic acid(EAB515)in brain and blood microdialysate (on-line) and in plasma ultrafiltrate of freely moving rats.J Chromatogr B,1996,679(1-2):167
[6]Rosell-Rovira ML,Pou-Clavé L,Lopez-Galera R,et al.Determination of free serum diolanosine by ultrafiltration and high-performance liquid chromatography.J Chromatogr B,1996,675(1):89
[7]汪逸平，蒋永培，李敏等.癫痫患者血清、血清超滤液、唾液、脑脊液中苯妥英浓度的相关性和动力学研究.中国医院药学杂志，1993，13(1)：5
[8]曹国颖，孙春华，傅得兴等.苯妥英钠、卡马西平在血清、血清超滤液、唾液中浓度的监测与相关性探讨.中国药房，1995，6(5)：27
[9]李发美，郭礼新.高效液相色谱法测定血清中头孢噻肟浓度.色谱，1997，15(6)：512
收稿日期：1998-12-21, 百拇医药