兔血清中琥乙红霉素的HPLC测定及药代动力学研究
作者：王家蕊 陈立清 董伟林 洪燕敏
单位：王家蕊 陈立清(天津医科大学第三医院 300203)；董伟林 洪燕敏(天津医科大学 300070)
关键词：琥乙红霉素；血药浓度；HPLC；药代动力学
药物分析杂志000117 摘 要：目的：用高效液相色谱法测定兔血清中琥乙红霉素的浓度。方法：采用YWG-C18色谱分析柱(4.6 mm×150 mm，10 μm)，岛津SPD-6AV紫外检测器，甲醇-0.02 mol.L-1-醋酸铵水溶液(70∶30，用氨水调pH 7.3)为流动相，红霉素作内标。血液样品在碱性条件下用二氯甲烷提取纯化后进样，在210 nm波长处检测。结果：琥乙红霉素线性范围为0.25～12 mg.L-1(r=0.998 9)，最低检测量0.02 μg，最低检出浓度0.05 mg.L-1，平均方法回收率96.26%。精密度考察琥乙红霉素日内、日间相对标准偏差均小于6%。结论：本方法快速、准确、重复性好。
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HPLC Determination of Erythromycin Ethylsuccinate
and Pharmacokinetic Studies in Rabbit Serum
Wang Jiarui Chen Liqing
(Tianjin Medical University Third Hospital，Tianjin 300203)
Dong Weilin Hong Yanmin
(Tianjin Medical University,Tianjin 300070)
Abstract：Objective：A HPLC method is described for the analysis of erythromycin ethylsuccinate in rabbit serum.Methods:The YWG-C18 column(4.6 mm×150 mm,10 μm)was used.The mobile phase consisted of methanol -0.02 mol.L-1 ammonium acetate (70∶30,pH 7.3).Detection was at 210 nm.Results:Erythr omycin was used as achieved by internal standard.The ranges of calibration curves were 0.25～12 mg.L-1(r=0.998 9).Detection limits were 0.02 μg and the lowest detectable concentration of roxithromycin was 0.05 mg.L-1,while the average recovery of the method was 96.26%.The RSD of intra-day and inter-day assays all less than 6%.Conclusion:The method is quick,precise and good repeat.
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Key words：erythromycin ethylsuccinate,drug concentration in serum,HPLC,pharmacokinetic▲
琥乙红霉素(Erythromycin Ethylsuccinate)商品名利君沙是大环内酯类抗生素。其化学结构与红霉素相似，是红霉素的衍生物。本文结合临床用药情况，参考有关文献[1，2]，建立了高效液相色谱法测定血液中琥乙红霉素浓度的方法，并对琥乙红霉素在家兔体内的生物利用度进行了分析研究。
1 仪器与试剂
日本岛津LC-6A高效液相色谱仪(包括：SPD-6AV可调波长紫外检测器、C-R4A色谱数据处理机、LC-6A输液泵、SCL-6B色谱系统控制器)。
琥乙红霉素标准品(天津药品检验所提供，纯度为98.5%)。内标物红霉素标准品(中国药品生物制品检定所)，甲醇为色谱纯，重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
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2 实验方法
2.1 色谱条件 紫外检测波长：210 nm；色谱柱：YWG-C18 10 μm 4.6 mm×150 mm；流动相：甲醇-0.02 mol.L-1醋酸铵水溶液(70∶30，用氨水调pH 7.3)；流速：1.0 mL.min-1；灵敏度：0.01(AUFS)；纸速：5 mm.min-1；柱温：45 ℃；进样量：20 μL。
2.2 溶液配制 精密称取琥乙红霉素和红霉素标准品各10 mg，分别置于50 mL容量瓶内，各加入甲醇1 mL后加重蒸馏水溶解并定容成0.2 mg.mL-1的琥乙红霉素贮备液和红霉素内标工作液，置于冰箱中保存备用。临用时将琥乙红霉素贮备液用重蒸馏水稀释至所需浓度，即得琥乙红霉素工作液。
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2.3 标准曲线的绘制 取家兔空白血清1 mL共7份，分别置于试管中，精密加入不同浓度的琥乙红霉素工作液50 μL，使血清中琥乙红霉素浓度分别为0.25，0.5，1，2，4，8，12 mg.L-1。再加入内标工作液50 μL(含红霉素10 μg)，加入0.5 mol.L-1的氢氧化钠溶液50 μL混匀后，加入二氯甲烷3 mL置旋涡混合器上提取3 min，离心后吸弃上清液，将二氯甲烷液分置于离心试管中，于60 ℃水浴上用氮气流吹干，残留物溶于100 μL溶解剂[用氨水调pH 7.3的0.02 mol.L-1醋酸铵-甲醇(1∶1)]，再用0.5 mL正己烷洗2次，吸弃正己烷层，取下层液20 μL，注入色谱柱。以琥乙红霉素与内标的峰面积比值为纵坐标，以琥乙红霉素的浓度为横坐标，进行回归计算得回归方程为：
Y=0.218 8X-0.001 486 r=0.998 9 n=3
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2.4 药代动力学研究 血液样品的制备：家兔5只，体重(2.5±0.5) kg，隔日禁食，次日按成人剂量10倍灌胃给药后于0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0，24.0，48.0 h取血3～4 mL离心，取血清1 mL按标准曲线项下操作，测得样品与内标峰面积之比，由标准曲线方程计算血液中琥乙红霉素的浓度。
3 实验结果
3.1 色谱行为 选用波长UV-210 nm，用二氯甲烷在碱性条件下提取，按标准曲线项下所述方法再次纯化后进样，提取回收率较高，在210 nm波长处检测无杂质干扰，血液中内标和琥乙红霉素的保留时间分别为6.93 min和8.47 min(见图1)。
图1 色谱图
1.红霉素(内标) 2.琥乙红霉素
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3.2 线性范围和灵敏度 血液中琥乙红霉素的浓度在0.25～12 mg.L-1范围内，具有良好的线性关系，在本文条件下血液中琥乙红霉素最低检测浓度0.05 mg.L-1。
3.3 回收率与精密度试验
提取回收率：用家兔空白血清配成含琥乙红霉素分别为0.5，2，8 mg.L-1的溶液，按标准曲线项下操作，另配制相应浓度的琥乙红霉素标准溶液在相同条件下直接进样。连续测定5次，平均提取回收率X±RSD分别为(70.52±3.8)%，(69.32±2.6)%，(72.69±3.4)%。
方法回收率：用家兔空白血清配成含琥乙红霉素分别为0.5，2，8 mg.L-1的溶液，按标准曲线项下操作，连续测定5次，计算平均方法回收率X±RSD分别为(99.08±2.4)%，(100.6±2.6)%，(99.61±3.1)%。
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精密度：用家兔空白血清配成含琥乙红霉素分别为0.5，2，8 mg.L-1的溶液，于同一天内，按标准曲线项下操作，连续测定3次，计算浓度求得日内误差(RSD)分别为：4.8%，3.2%，2.6%。另取上述不同浓度的标准血样，同法处理，周内重复测定3次，计算浓度求得日间误差(RSD)分别为：5.1%，3.8%，3.2%。
3.4 药代动力学测定 5只家兔单次给药后，不同时间血液药物浓度测定结果见图2。
图2 兔血液中琥乙红霉素的药-时曲线(n=5)
3.5 药动学参数及相对生物利用度 每只受试家兔的血药浓度-时间数据，用3P87药代动力学程序经自动拟合，均符合二室开放模型，得出的有关药动学参数见表1。
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表1 给药家兔药动学参数 参数
琥乙红霉素
T1/2α/h
1.2±0.3
T1/2β/h
6.5±1.4
AUC/μg.L-1.h
25.8±4.8
Cl/mL.kg-1.h-1
1.8±0.4
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Tmax/h
2.0±0.7
Cmax/μg.L-1
10.4±1.5
4 讨论
4.1 柱温对色谱峰的影响 根据文献[3]，红霉素在柱温升高时柱效提高，考虑到琥乙红霉素与红霉素属同类药物，因此考察了不同柱温对琥乙红霉素和红霉素的保留时间和峰高的影响。本文选用柱温45 ℃时，检测峰及保留时间较好，同时这个温度对色谱柱的稳定性无影响。
4.2 流动相的选择 文献[4]以乙腈-甲醇-0.05 mol.L-1磷酸为流动相，并且乙腈的配比量较大，成本较高，本文经多次筛选，选用甲醇-0.02 mol.L-1醋酸铵(70∶30)为流动相，即降低了成本，同时也获得了较好的分离条件。■
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参考文献：
[1]Birkett D J,Robson R A,Grgurinovich N，et al.Single oral dose pharmacokinetics of erythromycin and roxithromycin and the effects of chronic dosing.Ther Drug Monit，1990,12(1):65
[2]Delatour F,Le Guludec D,Caron F，et al.Effect of a single oral dose of two erythromycin ethylsuccinate formulations on gastric emptying in healthy Volunteers:a scintigraphic study.Fundam Clin Pharmacol，1998,12(3):292
[3]唐秋瑾.红霉素的高效液相色谱法测定.药物分析杂志，1985，5(4)：223
[4]秦永平，黄英，梁茂植等.血清中罗红霉素的高效液相色谱法测定.药物分析杂志，1997，17(4)：249
收稿日期：1999-01-25, 百拇医药
单位：王家蕊 陈立清(天津医科大学第三医院 300203)；董伟林 洪燕敏(天津医科大学 300070)
关键词：琥乙红霉素；血药浓度；HPLC；药代动力学
药物分析杂志000117 摘 要：目的：用高效液相色谱法测定兔血清中琥乙红霉素的浓度。方法：采用YWG-C18色谱分析柱(4.6 mm×150 mm，10 μm)，岛津SPD-6AV紫外检测器，甲醇-0.02 mol.L-1-醋酸铵水溶液(70∶30，用氨水调pH 7.3)为流动相，红霉素作内标。血液样品在碱性条件下用二氯甲烷提取纯化后进样，在210 nm波长处检测。结果：琥乙红霉素线性范围为0.25～12 mg.L-1(r=0.998 9)，最低检测量0.02 μg，最低检出浓度0.05 mg.L-1，平均方法回收率96.26%。精密度考察琥乙红霉素日内、日间相对标准偏差均小于6%。结论：本方法快速、准确、重复性好。
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HPLC Determination of Erythromycin Ethylsuccinate
and Pharmacokinetic Studies in Rabbit Serum
Wang Jiarui Chen Liqing
(Tianjin Medical University Third Hospital，Tianjin 300203)
Dong Weilin Hong Yanmin
(Tianjin Medical University,Tianjin 300070)
Abstract：Objective：A HPLC method is described for the analysis of erythromycin ethylsuccinate in rabbit serum.Methods:The YWG-C18 column(4.6 mm×150 mm,10 μm)was used.The mobile phase consisted of methanol -0.02 mol.L-1 ammonium acetate (70∶30,pH 7.3).Detection was at 210 nm.Results:Erythr omycin was used as achieved by internal standard.The ranges of calibration curves were 0.25～12 mg.L-1(r=0.998 9).Detection limits were 0.02 μg and the lowest detectable concentration of roxithromycin was 0.05 mg.L-1,while the average recovery of the method was 96.26%.The RSD of intra-day and inter-day assays all less than 6%.Conclusion:The method is quick,precise and good repeat.
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Key words：erythromycin ethylsuccinate,drug concentration in serum,HPLC,pharmacokinetic▲
琥乙红霉素(Erythromycin Ethylsuccinate)商品名利君沙是大环内酯类抗生素。其化学结构与红霉素相似，是红霉素的衍生物。本文结合临床用药情况，参考有关文献[1，2]，建立了高效液相色谱法测定血液中琥乙红霉素浓度的方法，并对琥乙红霉素在家兔体内的生物利用度进行了分析研究。
1 仪器与试剂
日本岛津LC-6A高效液相色谱仪(包括：SPD-6AV可调波长紫外检测器、C-R4A色谱数据处理机、LC-6A输液泵、SCL-6B色谱系统控制器)。
琥乙红霉素标准品(天津药品检验所提供，纯度为98.5%)。内标物红霉素标准品(中国药品生物制品检定所)，甲醇为色谱纯，重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
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2 实验方法
2.1 色谱条件 紫外检测波长：210 nm；色谱柱：YWG-C18 10 μm 4.6 mm×150 mm；流动相：甲醇-0.02 mol.L-1醋酸铵水溶液(70∶30，用氨水调pH 7.3)；流速：1.0 mL.min-1；灵敏度：0.01(AUFS)；纸速：5 mm.min-1；柱温：45 ℃；进样量：20 μL。
2.2 溶液配制 精密称取琥乙红霉素和红霉素标准品各10 mg，分别置于50 mL容量瓶内，各加入甲醇1 mL后加重蒸馏水溶解并定容成0.2 mg.mL-1的琥乙红霉素贮备液和红霉素内标工作液，置于冰箱中保存备用。临用时将琥乙红霉素贮备液用重蒸馏水稀释至所需浓度，即得琥乙红霉素工作液。
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2.3 标准曲线的绘制 取家兔空白血清1 mL共7份，分别置于试管中，精密加入不同浓度的琥乙红霉素工作液50 μL，使血清中琥乙红霉素浓度分别为0.25，0.5，1，2，4，8，12 mg.L-1。再加入内标工作液50 μL(含红霉素10 μg)，加入0.5 mol.L-1的氢氧化钠溶液50 μL混匀后，加入二氯甲烷3 mL置旋涡混合器上提取3 min，离心后吸弃上清液，将二氯甲烷液分置于离心试管中，于60 ℃水浴上用氮气流吹干，残留物溶于100 μL溶解剂[用氨水调pH 7.3的0.02 mol.L-1醋酸铵-甲醇(1∶1)]，再用0.5 mL正己烷洗2次，吸弃正己烷层，取下层液20 μL，注入色谱柱。以琥乙红霉素与内标的峰面积比值为纵坐标，以琥乙红霉素的浓度为横坐标，进行回归计算得回归方程为：
Y=0.218 8X-0.001 486 r=0.998 9 n=3
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2.4 药代动力学研究 血液样品的制备：家兔5只，体重(2.5±0.5) kg，隔日禁食，次日按成人剂量10倍灌胃给药后于0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0，24.0，48.0 h取血3～4 mL离心，取血清1 mL按标准曲线项下操作，测得样品与内标峰面积之比，由标准曲线方程计算血液中琥乙红霉素的浓度。
3 实验结果
3.1 色谱行为 选用波长UV-210 nm，用二氯甲烷在碱性条件下提取，按标准曲线项下所述方法再次纯化后进样，提取回收率较高，在210 nm波长处检测无杂质干扰，血液中内标和琥乙红霉素的保留时间分别为6.93 min和8.47 min(见图1)。
图1 色谱图
1.红霉素(内标) 2.琥乙红霉素
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3.2 线性范围和灵敏度 血液中琥乙红霉素的浓度在0.25～12 mg.L-1范围内，具有良好的线性关系，在本文条件下血液中琥乙红霉素最低检测浓度0.05 mg.L-1。
3.3 回收率与精密度试验
提取回收率：用家兔空白血清配成含琥乙红霉素分别为0.5，2，8 mg.L-1的溶液，按标准曲线项下操作，另配制相应浓度的琥乙红霉素标准溶液在相同条件下直接进样。连续测定5次，平均提取回收率X±RSD分别为(70.52±3.8)%，(69.32±2.6)%，(72.69±3.4)%。
方法回收率：用家兔空白血清配成含琥乙红霉素分别为0.5，2，8 mg.L-1的溶液，按标准曲线项下操作，连续测定5次，计算平均方法回收率X±RSD分别为(99.08±2.4)%，(100.6±2.6)%，(99.61±3.1)%。
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精密度：用家兔空白血清配成含琥乙红霉素分别为0.5，2，8 mg.L-1的溶液，于同一天内，按标准曲线项下操作，连续测定3次，计算浓度求得日内误差(RSD)分别为：4.8%，3.2%，2.6%。另取上述不同浓度的标准血样，同法处理，周内重复测定3次，计算浓度求得日间误差(RSD)分别为：5.1%，3.8%，3.2%。
3.4 药代动力学测定 5只家兔单次给药后，不同时间血液药物浓度测定结果见图2。
图2 兔血液中琥乙红霉素的药-时曲线(n=5)
3.5 药动学参数及相对生物利用度 每只受试家兔的血药浓度-时间数据，用3P87药代动力学程序经自动拟合，均符合二室开放模型，得出的有关药动学参数见表1。
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表1 给药家兔药动学参数 参数
琥乙红霉素
T1/2α/h
1.2±0.3
T1/2β/h
6.5±1.4
AUC/μg.L-1.h
25.8±4.8
Cl/mL.kg-1.h-1
1.8±0.4
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Tmax/h
2.0±0.7
Cmax/μg.L-1
10.4±1.5
4 讨论
4.1 柱温对色谱峰的影响 根据文献[3]，红霉素在柱温升高时柱效提高，考虑到琥乙红霉素与红霉素属同类药物，因此考察了不同柱温对琥乙红霉素和红霉素的保留时间和峰高的影响。本文选用柱温45 ℃时，检测峰及保留时间较好，同时这个温度对色谱柱的稳定性无影响。
4.2 流动相的选择 文献[4]以乙腈-甲醇-0.05 mol.L-1磷酸为流动相，并且乙腈的配比量较大，成本较高，本文经多次筛选，选用甲醇-0.02 mol.L-1醋酸铵(70∶30)为流动相，即降低了成本，同时也获得了较好的分离条件。■
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参考文献：
[1]Birkett D J,Robson R A,Grgurinovich N，et al.Single oral dose pharmacokinetics of erythromycin and roxithromycin and the effects of chronic dosing.Ther Drug Monit，1990,12(1):65
[2]Delatour F,Le Guludec D,Caron F，et al.Effect of a single oral dose of two erythromycin ethylsuccinate formulations on gastric emptying in healthy Volunteers:a scintigraphic study.Fundam Clin Pharmacol，1998,12(3):292
[3]唐秋瑾.红霉素的高效液相色谱法测定.药物分析杂志，1985，5(4)：223
[4]秦永平，黄英，梁茂植等.血清中罗红霉素的高效液相色谱法测定.药物分析杂志，1997，17(4)：249
收稿日期：1999-01-25, 百拇医药