严格应答在微生物中的存在以及在细胞形态分化和生理分化中的作用
作者：来彩霞 姚新生 Kozo Ochi
单位：来彩霞(沈阳药科大学制药系，沈阳 110015；); 姚新生(沈阳药科大学制药系，沈阳 110015；); Kozo Ochi(日本国立食品综合研究所，Japan 305-8642)
关键词：严格应答；形态分化；生理分化
沈阳药科大学学报000121 摘 要：严格应答反应在枯草芽孢杆菌以及链霉菌中存在，在真菌中是否存在只进行了初步的考查.造成严格应答反应的信号分子(p)ppGpp是IMP脱氢酶的强竞争性抑制剂，使用德夸菌素进行研究和对松驰型突变株(rel)进行分离、分析研究，结果证明细胞形态分化的启动是由GTP库的降低所造成的，而在生理分化的启动中(p)ppGpp起着关键性的作用.
分类号：R914
, 百拇医药 Occurrence of the Stringent Response in Microorganisms and Significance in the Morphological and Physiological Differentiation
Lai Caixia，Yao Xinsheng,(Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015；)
Kozo Ochi
(National Food Research Institute,Japan)
Abstract：It was clarified that the bacterial stringent response existed in Bacillus subtilis and Streptomyces,whether the stringent response existed in Fungi was also examined.(p)ppGpp is a competitive inhibitor of IMP dehydrogenase in the GTP biosyntheis way.On the basis of the study by using decoyinine and isolating and analyzing relaxed mutans,it was concluded that the initiation of morphological differentiation resulted from the decrease of GTP content,but (p)ppGpp played a pivotal role in initiation of physiological differentiation in Bacillus subtilis and Streptomyces.
, 百拇医药
Key words：stringent respones；morphological differentiation;physiological differentiation▲
目前报道的抗生素绝大多数是从微生物代谢产物中获得的，产生菌有细菌、放线菌和真菌，其中以放线菌中的链霉菌属产生的抗生素品种最多，因而人们对微生物尤其是链霉菌的研究产生了特别的兴趣，抗生素合成过程中细胞形态分化和生理分化偶联，对此现象的详细了解有助于建立促进抗生素产生的理性方法，这对工业生产和经济发展有着重要意义.用一个重要的细菌调节系统即严格应答反应(stringent respones)对此现象进行研究，鸟嘌呤核苷酸ppGpp和pppGpp造成了严格应答反应，并且是形态分化和生理分化的一个重要的信号分子.本文对此理论研究的进展作一简要概述.
1 细菌中枯草芽孢杆菌存在严格应答反应
1.1 枯草芽孢杆菌中严格应答反应存在
, http://www.100md.com
在用营养缺陷型研究时，用低浓度必需氨基酸培养该菌株发现(p)ppGpp含量提高，启动了枯草芽孢杆菌的芽孢形成，进一步实验表明，在氨基酸饥饿时所引起的严格应答反应启动了芽孢的形成〔1〕.一些抑制蛋白质或RNA合成的抗生素能降低(p)ppGpp积累和孢子形成，如氯霉素和梭链孢酸等抗生素对孢子形成抑制，但可以被加入0.2～0.5 mM的德夸菌素完全解除〔2〕.
1.2 严格应答启动了枯草芽孢杆菌中抗生素的合成〔3〕
在合成培养基中补入酪蛋白氨基酸，枯草芽孢杆菌抗生素合成的启动被显著推迟，产量明显降低.严格应答菌61886(rel+)在氨基酸饥饿时产生严格应答反应，抗生素产量提高3～8倍.
另一株rel+菌61884(Asp-)从富含天冬氨酸培养基转移到天冬氨酸限制培养基培养，在转移后培养10分钟时胞内ppGpp的浓度由4 pmol/AM600提高到90 pmol/AM600，GTP含量降至17%，在相同条件下，rel突变株61883(Asp-)的(p)ppGpp和GTP库变化显著降低，孢子形成能力和抗生素合成能力变化情况见表1.
, 百拇医药
Tab.1 Effects of aspartate limitation on antibiotic production and sporulation in stringent and relaxed strains Strain
Aspartate
concen/
mM
No of heat-resistant/
spores mL-1
Antibiotic
activity/
units.mL-1
, 百拇医药
Antibiotic activity
per cell/units.mL-1.OD600-1
61884(rl+)
2
2.5×107
113
57
20
6.8×101
24
, http://www.100md.com
4.1
61883(rel)
2
5.6×101
<1
<0.5
20
5.5×101
4
0.8
2 放线菌中严格应答 在放线菌中仅对链霉菌进行了考查，主要通过2种方法.a.用专一性抑制GMP合成酶的德夸菌素；b.通过分离和分析松驰型突变株的方法.
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2.1 链霉菌中严格应答的存在
链霉菌中严格应答的存在主要在灰色链霉菌〔5〕、抗生素链霉菌〔6〕、天篮色链霉菌〔7〕、唐德链霉菌〔8〕和淡紫灰链霉菌MA406-A-1〔9〕中进行了研究，以淡紫灰链霉菌MA406-A-1为例加以阐述.淡紫灰链霉菌MA406-A-1在合成培养基中培养产生间型霉素和细胞生长同步.但当补入1%(W/V)酪蛋白氨基酸，间型霉素产生的启动被推迟到对数生长结束之后，胞内的(p)ppGpp库逐步提高，当开始产生间型霉素时最大.当把细胞从补入酪蛋白氨基酸的合成培养基转入合成培养基中(称为shift down)，(p)ppGpp立刻上升，GTP库下降，这时间型霉素产量比在合成培养基中培养时提高8倍.它的rel突变株在shift down时产生(p)ppGpp为亲株的15%，GTP库变化减小，不能产生间型霉素，气生菌丝形成被显著推迟，由此可见链霉菌呈现典型的严格应答(见图1).
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Fig.1 Changes in the intracellular concentrations of (p)ppGpp
(a)—during growth in synthetic medium supplemented with 1%(W/V) Casamino acids；(b)—after shift down from synthetic medium containing 1%(W/V) Casamino acids to synthetic medium lacking Casamino acids a；b1—parent strain;b2—rel mutant;1—ppGpp;2—pppGpp
2.2 加入德夸菌素对链霉菌细胞分化研究
在淡紫灰链霉菌MA406〔9，10〕、变铅青链霉菌〔10〕、小小链霉菌〔10〕和灰色链霉菌13189、〔11，5〕中，通过加入德夸菌素对链霉菌细胞分化进行研究，表明链霉菌中GTP库的降低启动了形态分化.
, 百拇医药
加入德夸菌素解除了丰富的营养对链霉菌形态分化的抑制.链霉菌在孢子培养基或合成培养基中产生气生菌丝(固体培养)或孢子(液体培养)，但补充酪蛋白氨基酸或蛋白胨时细胞分化被抑制，当向此培养物中加入GMP合成酶专一性抑制剂德夸菌素时胞内GTP库显著降低，启动了形态分化，但(p)ppGpp库没有变化，抗生素产生能力没有提高，反而下降.以液体培养灰色链霉菌13189为例，在含蛋白胨2%的培养基中培养时，培养60 h孢子浓度为2×106～4×106，如果在培养8 h后添加德夸菌素(2 mM)，则在添加后10～15 h孢子形成速度快速上升，20 h孢子浓度为109以上，GTP库下降2～4倍，但(p)ppGpp没有变化，抗生素生产能力没有提高.
加入德夸菌素解除了rel突变对链霉菌形态分化的抑制.rel突变株降低了细胞形态分化和生理分化的能力.当把德夸菌素加入到rel突变株中时，形态分化能力恢复与亲株水平接近，而(p)ppGpp和抗生素的产生能力没有恢复.因此GTP库的降低，启动了链霉菌的形态分化，而(p)ppGpp合成与生理分化有密切关系.
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实验结果证明，在shift down时，细胞内GTP库的降低是(p)ppGpp的上升造成的.液体培养链霉菌在shift down时产生大量孢子，(p)ppGpp库上升，同时GTP库下降，菌体内许多核苷酸发生变化.考查灰色链霉菌13189〔11〕shift down时多种核苷酸的变化以及在体外这些核苷酸对IMP脱氢酶的抑制作用，抑制效果如下：(p)ppGpp(85%)，ATP(60%)，XMP(51%)，ADP(36%)，GMP(31%)，GTP(10%)，AMP(6%)，UTP(0%)，CTP(0%)，在体内则只有ppGpp是强抑制剂，而其它的核苷酸抑制效果较小或没有.在shift down时，在细胞体内ppGpp库的上升足以抑制IMP脱氢酶活性，造成GTP库的下降，从而导致了细胞的形态分化.
Fig 2 Induction of submerged spore formation of S.griseus 13189 and strain 3-3 after nutritional shift-down.
, 百拇医药
1—strain 13189;2—strain3-3(rel);(3)—strain 3-3 plus 2 mM-decoyinine
2.3 用rel突变株对链霉菌的细胞分化进行研究
2.3.1 rel突变株的特性
在枯草芽孢杆菌中rel突变株是从自发产生的硫链丝菌素抗性突变株中筛选获得〔17，18〕.在链霉菌中从自发产生的硫肽菌素(一个硫链丝菌素的类似物)抗性突变株中筛选获得.淡紫灰链霉菌MA-406中，从硫肽菌素抗性突变株中筛选rel突变株机率达1/10〔9〕，灰色链霉菌1/25〔5〕，天兰色链霉菌A3(2)中为1/70〔7〕.
rel突变株严重缺乏(p)ppGpp和抗生素合成能力，但气生菌丝或孢子的形成能力仍保留，然而启动时间却明显滞后.添加德夸菌素使rel突变株恢复形态分化能力〔5〕，但(p)ppGpp以及抗生素合成能力不能恢复.灰黄链霉菌1805〔12〕的rel突变株6的回复突变株6-R 1的气生菌丝形成能力、抗生素和(p)ppGpp合成能力以及核糖体凝胶图谱恢复与亲株相同.灰色链霉菌rel突变株的回复突变株3-3-C虽然恢复了气生菌丝形成能力，抗生素和(p)ppGpp合成能力没有恢复，核糖体凝胶图谱也没有恢复，几个rel突变株的特性介绍如表2〔12〕.
, 百拇医药
Tab.2 Summary of strain characteristics Organism(antibotic.produced)
and strain
Source of strain
Amt (μg.m-1) of
thiopeptin needced
for selection
rel
genotypea
ppGpp
, http://www.100md.com accumulated
(pmol/mg dry wt)
Antibiotic
produced
(μg.mL-1)
Aerial
mycelia
S.antibioticus(actinomycin)
3720
rel+
82
, 百拇医药
110
+++
49
3720
3
rel
12
<1
+
S.lavendulae(formycin)
MA406-A-1
rel+
275
, 百拇医药
60
+++
32
MA406-A-
1
3
rel
44
2
+
123
MA406-A-
1
, 百拇医药 3
rel
53
2
+
S.griseofltavus(bicozamycin)
1850
rel+
337
72
+++
6
1805
, 百拇医药
40
rel
47
0.5
+
6-R 1
6
NA
rle+
348
69
+++
S.griseus(streptomycin)
, http://www.100md.com
13189
rel+
815
120
+++
3-3
13189
8
rel
96
3
+
3-3-C
, 百拇医药
3-3
NA
rel
88
110-230
+++
a Determined by measuring RNA synthesis during Casamino Acid deprivation;b Maximal ppGpp accumulated during Casamino Acid deprivation;c +++ Abundant,+ sparse;d NA,Not applicable2.3.2 对rel突变株分析
, 百拇医药
用双向聚丙酰胺凝胶电泳(PAGE)分析rel突变株.从硫肽菌素抗性突变株中筛到的rel突变株与rel+亲株的核糖体蛋白用PAGE分析比较(所使用的菌均列于表2)，结果发现rel突变株核糖体蛋白凝胶图谱改变，对这些菌株的relC基因开放阅读框进行核酸序列分析比较，发现突变株的rplK基因(即relC)均有不同程度碱基对丢失，造成L 11蛋白氨基酸的缺失，并且缺失均发生在特定的区域.
突变株的次级代谢分析 灰色链霉菌〔5〕的一个relC突变株3-3不能诱导链霉素合成途径中所必需的脒基转移酶和链霉素激酶合成.在抗生素链霉菌3720〔6〕的rel C突变株49菌丝所含的放线菌素生物合成中一个关键酶酚嗪酮合成酶水平降低，并且阻碍了放线菌素生物合成中3-羟基-2-氨基苯甲酸-4-甲基转移酶活性的提高，第三个酶放线菌素合成酶Ⅰ在菌丝中则完全不存在.酚嗪酮合成酶的mRNA水平，比亲株明显降低.在天蓝色链霉菌〔13，14〕中观察到(p)ppGpp的积累和十一烷基灵菌素以及放线菌紫素的途径专一性激活剂基因的转录呈平行关系.
, 百拇医药
2.3.3 灰色链霉菌中sup突变和天蓝色链霉菌中str突变阻碍了rel突变对抗生素产生的抑制
rel突变株缺乏合成(p)ppGpp和抗生素的能力，但灰色链霉菌〔12〕的rel C突变株的回复突变株(suppress mutant)恢复了链霉素产生能力，但(p)ppGpp的能力并没恢复，遗传分析表明sup突变与rel C突变位点在染色体上的不同部位.在天蓝色链霉菌M600〔15〕的rel A突变株不能合成ppGpp和放线菌紫素，rel A突变株通过获得链霉素抗性突变(str)而恢复了放线菌紫素的产生，但(p)ppGpp的能力并没被恢复.
3 真菌中的严格应答
仅对固体培养金色青霉菌〔16〕在分生孢子形成期间核苷酸库的变化进行了初步的考查.■
参考文献：
, 百拇医药
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收稿日期：1999-05-17, 百拇医药
单位：来彩霞(沈阳药科大学制药系，沈阳 110015；); 姚新生(沈阳药科大学制药系，沈阳 110015；); Kozo Ochi(日本国立食品综合研究所，Japan 305-8642)
关键词：严格应答；形态分化；生理分化
沈阳药科大学学报000121 摘 要：严格应答反应在枯草芽孢杆菌以及链霉菌中存在，在真菌中是否存在只进行了初步的考查.造成严格应答反应的信号分子(p)ppGpp是IMP脱氢酶的强竞争性抑制剂，使用德夸菌素进行研究和对松驰型突变株(rel)进行分离、分析研究，结果证明细胞形态分化的启动是由GTP库的降低所造成的，而在生理分化的启动中(p)ppGpp起着关键性的作用.
分类号：R914
, 百拇医药 Occurrence of the Stringent Response in Microorganisms and Significance in the Morphological and Physiological Differentiation
Lai Caixia，Yao Xinsheng,(Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015；)
Kozo Ochi
(National Food Research Institute,Japan)
Abstract：It was clarified that the bacterial stringent response existed in Bacillus subtilis and Streptomyces,whether the stringent response existed in Fungi was also examined.(p)ppGpp is a competitive inhibitor of IMP dehydrogenase in the GTP biosyntheis way.On the basis of the study by using decoyinine and isolating and analyzing relaxed mutans,it was concluded that the initiation of morphological differentiation resulted from the decrease of GTP content,but (p)ppGpp played a pivotal role in initiation of physiological differentiation in Bacillus subtilis and Streptomyces.
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Key words：stringent respones；morphological differentiation;physiological differentiation▲
目前报道的抗生素绝大多数是从微生物代谢产物中获得的，产生菌有细菌、放线菌和真菌，其中以放线菌中的链霉菌属产生的抗生素品种最多，因而人们对微生物尤其是链霉菌的研究产生了特别的兴趣，抗生素合成过程中细胞形态分化和生理分化偶联，对此现象的详细了解有助于建立促进抗生素产生的理性方法，这对工业生产和经济发展有着重要意义.用一个重要的细菌调节系统即严格应答反应(stringent respones)对此现象进行研究，鸟嘌呤核苷酸ppGpp和pppGpp造成了严格应答反应，并且是形态分化和生理分化的一个重要的信号分子.本文对此理论研究的进展作一简要概述.
1 细菌中枯草芽孢杆菌存在严格应答反应
1.1 枯草芽孢杆菌中严格应答反应存在
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在用营养缺陷型研究时，用低浓度必需氨基酸培养该菌株发现(p)ppGpp含量提高，启动了枯草芽孢杆菌的芽孢形成，进一步实验表明，在氨基酸饥饿时所引起的严格应答反应启动了芽孢的形成〔1〕.一些抑制蛋白质或RNA合成的抗生素能降低(p)ppGpp积累和孢子形成，如氯霉素和梭链孢酸等抗生素对孢子形成抑制，但可以被加入0.2～0.5 mM的德夸菌素完全解除〔2〕.
1.2 严格应答启动了枯草芽孢杆菌中抗生素的合成〔3〕
在合成培养基中补入酪蛋白氨基酸，枯草芽孢杆菌抗生素合成的启动被显著推迟，产量明显降低.严格应答菌61886(rel+)在氨基酸饥饿时产生严格应答反应，抗生素产量提高3～8倍.
另一株rel+菌61884(Asp-)从富含天冬氨酸培养基转移到天冬氨酸限制培养基培养，在转移后培养10分钟时胞内ppGpp的浓度由4 pmol/AM600提高到90 pmol/AM600，GTP含量降至17%，在相同条件下，rel突变株61883(Asp-)的(p)ppGpp和GTP库变化显著降低，孢子形成能力和抗生素合成能力变化情况见表1.
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Tab.1 Effects of aspartate limitation on antibiotic production and sporulation in stringent and relaxed strains Strain
Aspartate
concen/
mM
No of heat-resistant/
spores mL-1
Antibiotic
activity/
units.mL-1
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Antibiotic activity
per cell/units.mL-1.OD600-1
61884(rl+)
2
2.5×107
113
57
20
6.8×101
24
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4.1
61883(rel)
2
5.6×101
<1
<0.5
20
5.5×101
4
0.8
2 放线菌中严格应答 在放线菌中仅对链霉菌进行了考查，主要通过2种方法.a.用专一性抑制GMP合成酶的德夸菌素；b.通过分离和分析松驰型突变株的方法.
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2.1 链霉菌中严格应答的存在
链霉菌中严格应答的存在主要在灰色链霉菌〔5〕、抗生素链霉菌〔6〕、天篮色链霉菌〔7〕、唐德链霉菌〔8〕和淡紫灰链霉菌MA406-A-1〔9〕中进行了研究，以淡紫灰链霉菌MA406-A-1为例加以阐述.淡紫灰链霉菌MA406-A-1在合成培养基中培养产生间型霉素和细胞生长同步.但当补入1%(W/V)酪蛋白氨基酸，间型霉素产生的启动被推迟到对数生长结束之后，胞内的(p)ppGpp库逐步提高，当开始产生间型霉素时最大.当把细胞从补入酪蛋白氨基酸的合成培养基转入合成培养基中(称为shift down)，(p)ppGpp立刻上升，GTP库下降，这时间型霉素产量比在合成培养基中培养时提高8倍.它的rel突变株在shift down时产生(p)ppGpp为亲株的15%，GTP库变化减小，不能产生间型霉素，气生菌丝形成被显著推迟，由此可见链霉菌呈现典型的严格应答(见图1).
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Fig.1 Changes in the intracellular concentrations of (p)ppGpp
(a)—during growth in synthetic medium supplemented with 1%(W/V) Casamino acids；(b)—after shift down from synthetic medium containing 1%(W/V) Casamino acids to synthetic medium lacking Casamino acids a；b1—parent strain;b2—rel mutant;1—ppGpp;2—pppGpp
2.2 加入德夸菌素对链霉菌细胞分化研究
在淡紫灰链霉菌MA406〔9，10〕、变铅青链霉菌〔10〕、小小链霉菌〔10〕和灰色链霉菌13189、〔11，5〕中，通过加入德夸菌素对链霉菌细胞分化进行研究，表明链霉菌中GTP库的降低启动了形态分化.
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加入德夸菌素解除了丰富的营养对链霉菌形态分化的抑制.链霉菌在孢子培养基或合成培养基中产生气生菌丝(固体培养)或孢子(液体培养)，但补充酪蛋白氨基酸或蛋白胨时细胞分化被抑制，当向此培养物中加入GMP合成酶专一性抑制剂德夸菌素时胞内GTP库显著降低，启动了形态分化，但(p)ppGpp库没有变化，抗生素产生能力没有提高，反而下降.以液体培养灰色链霉菌13189为例，在含蛋白胨2%的培养基中培养时，培养60 h孢子浓度为2×106～4×106，如果在培养8 h后添加德夸菌素(2 mM)，则在添加后10～15 h孢子形成速度快速上升，20 h孢子浓度为109以上，GTP库下降2～4倍，但(p)ppGpp没有变化，抗生素生产能力没有提高.
加入德夸菌素解除了rel突变对链霉菌形态分化的抑制.rel突变株降低了细胞形态分化和生理分化的能力.当把德夸菌素加入到rel突变株中时，形态分化能力恢复与亲株水平接近，而(p)ppGpp和抗生素的产生能力没有恢复.因此GTP库的降低，启动了链霉菌的形态分化，而(p)ppGpp合成与生理分化有密切关系.
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实验结果证明，在shift down时，细胞内GTP库的降低是(p)ppGpp的上升造成的.液体培养链霉菌在shift down时产生大量孢子，(p)ppGpp库上升，同时GTP库下降，菌体内许多核苷酸发生变化.考查灰色链霉菌13189〔11〕shift down时多种核苷酸的变化以及在体外这些核苷酸对IMP脱氢酶的抑制作用，抑制效果如下：(p)ppGpp(85%)，ATP(60%)，XMP(51%)，ADP(36%)，GMP(31%)，GTP(10%)，AMP(6%)，UTP(0%)，CTP(0%)，在体内则只有ppGpp是强抑制剂，而其它的核苷酸抑制效果较小或没有.在shift down时，在细胞体内ppGpp库的上升足以抑制IMP脱氢酶活性，造成GTP库的下降，从而导致了细胞的形态分化.
Fig 2 Induction of submerged spore formation of S.griseus 13189 and strain 3-3 after nutritional shift-down.
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1—strain 13189;2—strain3-3(rel);(3)—strain 3-3 plus 2 mM-decoyinine
2.3 用rel突变株对链霉菌的细胞分化进行研究
2.3.1 rel突变株的特性
在枯草芽孢杆菌中rel突变株是从自发产生的硫链丝菌素抗性突变株中筛选获得〔17，18〕.在链霉菌中从自发产生的硫肽菌素(一个硫链丝菌素的类似物)抗性突变株中筛选获得.淡紫灰链霉菌MA-406中，从硫肽菌素抗性突变株中筛选rel突变株机率达1/10〔9〕，灰色链霉菌1/25〔5〕，天兰色链霉菌A3(2)中为1/70〔7〕.
rel突变株严重缺乏(p)ppGpp和抗生素合成能力，但气生菌丝或孢子的形成能力仍保留，然而启动时间却明显滞后.添加德夸菌素使rel突变株恢复形态分化能力〔5〕，但(p)ppGpp以及抗生素合成能力不能恢复.灰黄链霉菌1805〔12〕的rel突变株6的回复突变株6-R 1的气生菌丝形成能力、抗生素和(p)ppGpp合成能力以及核糖体凝胶图谱恢复与亲株相同.灰色链霉菌rel突变株的回复突变株3-3-C虽然恢复了气生菌丝形成能力，抗生素和(p)ppGpp合成能力没有恢复，核糖体凝胶图谱也没有恢复，几个rel突变株的特性介绍如表2〔12〕.
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Tab.2 Summary of strain characteristics Organism(antibotic.produced)
and strain
Source of strain
Amt (μg.m-1) of
thiopeptin needced
for selection
rel
genotypea
ppGpp
, http://www.100md.com accumulated
(pmol/mg dry wt)
Antibiotic
produced
(μg.mL-1)
Aerial
mycelia
S.antibioticus(actinomycin)
3720
rel+
82
, 百拇医药
110
+++
49
3720
3
rel
12
<1
+
S.lavendulae(formycin)
MA406-A-1
rel+
275
, 百拇医药
60
+++
32
MA406-A-
1
3
rel
44
2
+
123
MA406-A-
1
, 百拇医药 3
rel
53
2
+
S.griseofltavus(bicozamycin)
1850
rel+
337
72
+++
6
1805
, 百拇医药
40
rel
47
0.5
+
6-R 1
6
NA
rle+
348
69
+++
S.griseus(streptomycin)
, http://www.100md.com
13189
rel+
815
120
+++
3-3
13189
8
rel
96
3
+
3-3-C
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3-3
NA
rel
88
110-230
+++
a Determined by measuring RNA synthesis during Casamino Acid deprivation;b Maximal ppGpp accumulated during Casamino Acid deprivation;c +++ Abundant,+ sparse;d NA,Not applicable2.3.2 对rel突变株分析
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用双向聚丙酰胺凝胶电泳(PAGE)分析rel突变株.从硫肽菌素抗性突变株中筛到的rel突变株与rel+亲株的核糖体蛋白用PAGE分析比较(所使用的菌均列于表2)，结果发现rel突变株核糖体蛋白凝胶图谱改变，对这些菌株的relC基因开放阅读框进行核酸序列分析比较，发现突变株的rplK基因(即relC)均有不同程度碱基对丢失，造成L 11蛋白氨基酸的缺失，并且缺失均发生在特定的区域.
突变株的次级代谢分析 灰色链霉菌〔5〕的一个relC突变株3-3不能诱导链霉素合成途径中所必需的脒基转移酶和链霉素激酶合成.在抗生素链霉菌3720〔6〕的rel C突变株49菌丝所含的放线菌素生物合成中一个关键酶酚嗪酮合成酶水平降低，并且阻碍了放线菌素生物合成中3-羟基-2-氨基苯甲酸-4-甲基转移酶活性的提高，第三个酶放线菌素合成酶Ⅰ在菌丝中则完全不存在.酚嗪酮合成酶的mRNA水平，比亲株明显降低.在天蓝色链霉菌〔13，14〕中观察到(p)ppGpp的积累和十一烷基灵菌素以及放线菌紫素的途径专一性激活剂基因的转录呈平行关系.
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2.3.3 灰色链霉菌中sup突变和天蓝色链霉菌中str突变阻碍了rel突变对抗生素产生的抑制
rel突变株缺乏合成(p)ppGpp和抗生素的能力，但灰色链霉菌〔12〕的rel C突变株的回复突变株(suppress mutant)恢复了链霉素产生能力，但(p)ppGpp的能力并没恢复，遗传分析表明sup突变与rel C突变位点在染色体上的不同部位.在天蓝色链霉菌M600〔15〕的rel A突变株不能合成ppGpp和放线菌紫素，rel A突变株通过获得链霉素抗性突变(str)而恢复了放线菌紫素的产生，但(p)ppGpp的能力并没被恢复.
3 真菌中的严格应答
仅对固体培养金色青霉菌〔16〕在分生孢子形成期间核苷酸库的变化进行了初步的考查.■
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收稿日期：1999-05-17, 百拇医药