胰岛素微粒剂的制备、含量、包裹率与生物活性稳定性
作者：王思玲 苏德森 顾学裘
单位：王思玲(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015); 苏德森(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015); 顾学裘(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)
关键词：胰岛素微粒剂；生物效价；放射免疫分析；包裹率；稳定性
沈阳药科大学学报000107 摘 要：采用生物效价与放射免疫分析两种方法对微粒剂胰岛素含量进行测定.通过胰岛素放射免疫活性分析测定了胰岛素包裹率.以胰岛素生物效价为指标，采用恒温加速实验考察了微粒剂的生物活性稳定性，结果表明：微粒剂胰岛素含量分别为0.51u/mg与0.55IU/mg；包裹率在90%以上；室温放置1年，未见生物活性明显改变；25℃生物活性有效期为12.5月.
分类号：R94
Studies on the Preparation,the Contents,the Encapsulation Efficiencies and the Bioactive Stabilities of Insulin Microparticles(INS-MP)
, 百拇医药
Wang Siling,Su Desen,Gu Xueqiu
(Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract：The contents of INS-MP were measured by the method of the insulin biopotency and radioimmunoassay(RIA).The encapsulation efficiency was determined to be over 90% according to the RIA.By taking the biopotency as an index and using accelerated tests,the bioactive stabilities were determined.The contents were 0.51 u/mg and 0.55 IU/mg and the bioactivity at 25℃ was valid for 12.5 months.
, 百拇医药
Key words：insulin microparticles;biopotency；radioimmunoassay;encapsulation efficiency；stability▲
胰岛素(Insulin)是脊椎动物胰脏β细胞分泌的一种多肽类激素，用于治疗糖尿病有其独特的疗效，在其制剂含量测定中，较普遍采用的方法有高效液相色谱法、紫外分析法及放射免疫分析法等。但这些方法只能反映出其共价键等结构是否被改变，而不能反应出胰岛素表现生物活性的特定空间结构的变化.本文以胰岛素生物效价法对胰岛素微粒剂含量变化进行考察，可从一个角度真实地反映制剂的稳定性，有关口服胰岛素制剂的生物活性稳定性研究未见报道.
1 实验材料
小白鼠(昆明种，18～22 g，雄雌兼用，本校动物室提供)；125Ⅰ-胰岛素放射免疫分析药盒(中国原子能科学研究院)；血糖测定试剂盒(保定长城临床试剂公司)；胰岛素标准品(27 u/mg，中国生物制品检定所)；胰岛素微粒剂(自制)；UV-260可见紫外分光光度计(日本岛津)；TCL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；Kontron-Ⅱ r计数器(瑞士).
, http://www.100md.com
2 方法与结果
2.1 胰岛素微粒剂的制备〔1～3〕
取明胶溶液(0.2 mol/L，pH5.8 PBS)，搅拌下缓慢滴加等体积0.1%胰岛素溶液(0.2 mol/L，pH5.8 PBS)得絮状混悬液，离心，弃去上清液后，沉淀物(胰岛素明胶复合物)中加入0.2 mol/L，pH5.8 PBS使胰岛素明胶复合物浓度为32.0 mg/L，按与空白脂质体质量体积比8∶1加入空白脂质体，高速匀浆，分散，冷冻干燥，过筛得胰岛素微粒剂.
2.2 微粒剂中胰岛素含量测定
取100 mg微粒剂，加Na2HPO4--柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L,pH3.5)2 mL，静置15 min，再加3 mL正己烷，振荡5 min，离心1.0×104/r/m 10 min，弃去有机层，再加3 mL正己烷，同上操作，重复3次.水层溶液微热以除去残留正己烷后，用生理盐水稀释，定容至100.00 mL.以小鼠血糖法〔4〕进行胰岛素生物效价测定，同时进行放射免疫活性分析〔5〕，数据处理采用自编计算机程序，结果见表1.
, 百拇医药
Tab.1 The contents of insulin in microparticles(INS-MP)
Batch No
Potent/u.mg-1
Radioimmunoassay/IU/mg
970128
0.56
0.61
970218
0.49
0.53
, 百拇医药
971123
0.47
0.50
2.3 包裹率测定
精密称取100 mg微粒剂，加3 mL PBS(0.2 mol/L，pH5.8)，振荡1 min(1.0×103 r/m)，离心5 min(1.0×104 r/m)，收集上清液.沉淀用3 mL PBS(0.2 mol/L，pH5.8)同上操作重复3次，合并上清液定容至25.00 mL.沉淀物按“2.1”方法提取胰岛素.对上清液与沉淀提取液分别进行胰岛素放射免疫活性测定.由公式计算包裹率，结果见表2. Tab.2 Determination of the encapsulation efficiency
Batch No/IU.mg-1
, 百拇医药
INS0/IU
INS1/IU
INS2/IU
Encapsulation efficiency
E1/%
E2/%
961101(0.55)
55.01
3.020
50.21
94.6
, 百拇医药
91.3
970107(0.57)
57.00
3.601
51.60
93.7
90.5
980410(0.53)
53.01
3.711
48.80
93.0
, 百拇医药 92.1
包裹率计算公式：E1=(INS0-INS1)/INS0×100%；
E2=INS2/INS0×100%.
式中INS0：微粒剂中胰岛素总量(IU)；INS1：微粒剂中游离胰岛素量(IU)；INS2：微粒剂中被包裹的胰岛素量(IU).
2种方法测得平均包裹率分别为(93.8±0.66)%与(91.3±0.65)%，结果相近，说明本文所采用的方法是可行的.前一种方法结果稍高，分析原因一是胰岛素提取还不够彻底，二是离心过程中，可能有少量胰岛素被吸附沉淀下来.
, 百拇医药
2.4 微粒剂的生物活性稳定性测定
2.4.1 留样观察
将微粒密封于安瓿内，于室温15～25℃放置，一定时间后进行外观形态、颜色等观察，同时进行胰岛素生物效价测定，结果见表3.
Tab.3 Results of the stability observation of INS-MP
Storage time/month
Appearence
Potent/mu.mg-1
3
Particles evenly,uncohesive,colour unchanged
, http://www.100md.com
451±30
6
Particles evenly,uncohesive,colour unchanged
459±71
9
Particles evenly,uncohesive,colour unchanged
450±21
12
Particles evenly,uncohesive,colour slightly deep
449±41
, 百拇医药
18
Particles evenly,uncohesive,colour deeply
424±24
2.4.2 有效期预测〔6〕
定量称取微粒剂数份分别封入安瓿，分别置于40、50、60、70℃的恒温水浴中，于不同温度不同时间间隔取样.测其微粒剂中胰岛素初始效价(C0)及不同时间下的胰岛素效价(C)，按式Cr(%)=C/C0×100求出各温度下不同时间的相对活性(Cr)，结果见表4. Tab.4 The relative activities of INS-MP at different temperatures and different time
40℃
, 百拇医药
50℃
60℃
70℃
t/h
Cr/%
t/h
Cr/%
t/h
Cr/%
t/h
Cr/%
0.00
100.00
, 百拇医药
0.00
100.00
0.00
100.00
0.00
100.00
6.00
99.4
0.75
99.4
0.33
95.4
0.08
, 百拇医药
71.2
12.00
98.3
1.50
98.7
0.67
93.7
0.16
65.3
24.00
96.7
2.25
97.4
, 百拇医药
1.00
91.4
0.24
51.9
48.00
94.1
3.00
95.2
1.33
89.1
0.46
33.4
72.00
, http://www.100md.com
93.9
3.75
94.0
1.67
88.0
—
—
以各实验温度下胰岛素的不同相对活性(lnCr)对时间(t)回归，可得其回归方程如下：
40℃∶lnCr=4.600 6-8.802 3×10-4t r=-0.977 6
50℃∶lnCr=4.611 4-1.723 4×10-2t r=-0.976 0
, http://www.100md.com
60℃∶lnCr=4.592 9-7.440×10-2t r=-0.983 4
70℃∶lnCr=4.530 5-2.280 1 t r=-0.989 0.
各温度下的失活速率常数、活化能及25℃生物活性有效期见表5.
Tab.5 Chemical kinetic parameters and equation for the degradation of insulin in INS-MP
T/K
1/T×103
k/h-1
lnk
, 百拇医药
lnk-
Ea/kJ.mol-1
T0.9/month
313
3.194 9
8.802 3×10-4
-7.035 3
Lnk=78.69-2.684×104
, 百拇医药
r=-0.988 4
223
12.5
323
3.096 0
1.723 4×10-2
-4.060 8
333
3.003 0
7.440 0×10-2
-2.598 4
343
, 百拇医药
2.915 4
2.280 1
0.824 2
3 讨论
在探讨微粒剂有效期预测中，采用了胰岛素生物效价方法，而不是放射免疫法、高效液相色谱法或紫外法等.这主要是力求反映出制剂中有效成分的生物活性.另外，作者也曾利用差示热分析法(DTA)探讨微粒剂的热稳定性，以胰岛素原料为对照测得的活化能为313 kJ/moL，明显高于生物效价方法测得的活化能(Ea=223 kJ/moL)，即说明胰岛素共价键的改变要比维持胰岛素生物活性的空间结构所需能量更高；同时，从测定的有效期数据与室温留样结果相比较也看出，本文对胰岛素制剂稳定性的研究所设计的方法是可行的，以胰岛素效价是否稳定为指标，可真实地反映制剂的稳定性.■
参考文献：
, http://www.100md.com
[1]廖工铁，张志荣，陆彬，等.靶向给药制剂.成都：四川科学技术出版社，1997.81～87
[2]王剑红，陆彬，胥佩菱，等.肺靶向米托蒽醌明胶微球的研究.药学学报，1995，30(7)：549～555
[3]Leah A,Gray B,Sung W,et al.A self-regedating insulin delivery system.I.Characterization of a synthetic glycosylated insulin derivative.Int J Pharm,1989,54(3):241～249
[4]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：二部.北京：人民卫生出版社，1995.附录107～134
[5]125I-胰岛素放射免疫分析药盒说明书.中国原子能科学研究院(北京).1997
[6]王凤山，凌沛学.生化药物研究.北京：人民卫生出版社，1997.249～252
收稿日期：1999-05-17, 百拇医药
单位：王思玲(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015); 苏德森(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015); 顾学裘(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)
关键词：胰岛素微粒剂；生物效价；放射免疫分析；包裹率；稳定性
沈阳药科大学学报000107 摘 要：采用生物效价与放射免疫分析两种方法对微粒剂胰岛素含量进行测定.通过胰岛素放射免疫活性分析测定了胰岛素包裹率.以胰岛素生物效价为指标，采用恒温加速实验考察了微粒剂的生物活性稳定性，结果表明：微粒剂胰岛素含量分别为0.51u/mg与0.55IU/mg；包裹率在90%以上；室温放置1年，未见生物活性明显改变；25℃生物活性有效期为12.5月.
分类号：R94
Studies on the Preparation,the Contents,the Encapsulation Efficiencies and the Bioactive Stabilities of Insulin Microparticles(INS-MP)
, 百拇医药
Wang Siling,Su Desen,Gu Xueqiu
(Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract：The contents of INS-MP were measured by the method of the insulin biopotency and radioimmunoassay(RIA).The encapsulation efficiency was determined to be over 90% according to the RIA.By taking the biopotency as an index and using accelerated tests,the bioactive stabilities were determined.The contents were 0.51 u/mg and 0.55 IU/mg and the bioactivity at 25℃ was valid for 12.5 months.
, 百拇医药
Key words：insulin microparticles;biopotency；radioimmunoassay;encapsulation efficiency；stability▲
胰岛素(Insulin)是脊椎动物胰脏β细胞分泌的一种多肽类激素，用于治疗糖尿病有其独特的疗效，在其制剂含量测定中，较普遍采用的方法有高效液相色谱法、紫外分析法及放射免疫分析法等。但这些方法只能反映出其共价键等结构是否被改变，而不能反应出胰岛素表现生物活性的特定空间结构的变化.本文以胰岛素生物效价法对胰岛素微粒剂含量变化进行考察，可从一个角度真实地反映制剂的稳定性，有关口服胰岛素制剂的生物活性稳定性研究未见报道.
1 实验材料
小白鼠(昆明种，18～22 g，雄雌兼用，本校动物室提供)；125Ⅰ-胰岛素放射免疫分析药盒(中国原子能科学研究院)；血糖测定试剂盒(保定长城临床试剂公司)；胰岛素标准品(27 u/mg，中国生物制品检定所)；胰岛素微粒剂(自制)；UV-260可见紫外分光光度计(日本岛津)；TCL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；Kontron-Ⅱ r计数器(瑞士).
, http://www.100md.com
2 方法与结果
2.1 胰岛素微粒剂的制备〔1～3〕
取明胶溶液(0.2 mol/L，pH5.8 PBS)，搅拌下缓慢滴加等体积0.1%胰岛素溶液(0.2 mol/L，pH5.8 PBS)得絮状混悬液，离心，弃去上清液后，沉淀物(胰岛素明胶复合物)中加入0.2 mol/L，pH5.8 PBS使胰岛素明胶复合物浓度为32.0 mg/L，按与空白脂质体质量体积比8∶1加入空白脂质体，高速匀浆，分散，冷冻干燥，过筛得胰岛素微粒剂.
2.2 微粒剂中胰岛素含量测定
取100 mg微粒剂，加Na2HPO4--柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L,pH3.5)2 mL，静置15 min，再加3 mL正己烷，振荡5 min，离心1.0×104/r/m 10 min，弃去有机层，再加3 mL正己烷，同上操作，重复3次.水层溶液微热以除去残留正己烷后，用生理盐水稀释，定容至100.00 mL.以小鼠血糖法〔4〕进行胰岛素生物效价测定，同时进行放射免疫活性分析〔5〕，数据处理采用自编计算机程序，结果见表1.
, 百拇医药
Tab.1 The contents of insulin in microparticles(INS-MP)
Batch No
Potent/u.mg-1
Radioimmunoassay/IU/mg
970128
0.56
0.61
970218
0.49
0.53
, 百拇医药
971123
0.47
0.50
2.3 包裹率测定
精密称取100 mg微粒剂，加3 mL PBS(0.2 mol/L，pH5.8)，振荡1 min(1.0×103 r/m)，离心5 min(1.0×104 r/m)，收集上清液.沉淀用3 mL PBS(0.2 mol/L，pH5.8)同上操作重复3次，合并上清液定容至25.00 mL.沉淀物按“2.1”方法提取胰岛素.对上清液与沉淀提取液分别进行胰岛素放射免疫活性测定.由公式计算包裹率，结果见表2. Tab.2 Determination of the encapsulation efficiency
Batch No/IU.mg-1
, 百拇医药
INS0/IU
INS1/IU
INS2/IU
Encapsulation efficiency
E1/%
E2/%
961101(0.55)
55.01
3.020
50.21
94.6
, 百拇医药
91.3
970107(0.57)
57.00
3.601
51.60
93.7
90.5
980410(0.53)
53.01
3.711
48.80
93.0
, 百拇医药 92.1
包裹率计算公式：E1=(INS0-INS1)/INS0×100%；
E2=INS2/INS0×100%.
式中INS0：微粒剂中胰岛素总量(IU)；INS1：微粒剂中游离胰岛素量(IU)；INS2：微粒剂中被包裹的胰岛素量(IU).
2种方法测得平均包裹率分别为(93.8±0.66)%与(91.3±0.65)%，结果相近，说明本文所采用的方法是可行的.前一种方法结果稍高，分析原因一是胰岛素提取还不够彻底，二是离心过程中，可能有少量胰岛素被吸附沉淀下来.
, 百拇医药
2.4 微粒剂的生物活性稳定性测定
2.4.1 留样观察
将微粒密封于安瓿内，于室温15～25℃放置，一定时间后进行外观形态、颜色等观察，同时进行胰岛素生物效价测定，结果见表3.
Tab.3 Results of the stability observation of INS-MP
Storage time/month
Appearence
Potent/mu.mg-1
3
Particles evenly,uncohesive,colour unchanged
, http://www.100md.com
451±30
6
Particles evenly,uncohesive,colour unchanged
459±71
9
Particles evenly,uncohesive,colour unchanged
450±21
12
Particles evenly,uncohesive,colour slightly deep
449±41
, 百拇医药
18
Particles evenly,uncohesive,colour deeply
424±24
2.4.2 有效期预测〔6〕
定量称取微粒剂数份分别封入安瓿，分别置于40、50、60、70℃的恒温水浴中，于不同温度不同时间间隔取样.测其微粒剂中胰岛素初始效价(C0)及不同时间下的胰岛素效价(C)，按式Cr(%)=C/C0×100求出各温度下不同时间的相对活性(Cr)，结果见表4. Tab.4 The relative activities of INS-MP at different temperatures and different time
40℃
, 百拇医药
50℃
60℃
70℃
t/h
Cr/%
t/h
Cr/%
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Cr/%
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Cr/%
0.00
100.00
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0.00
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71.2
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98.3
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98.7
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24.00
96.7
2.25
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1.00
91.4
0.24
51.9
48.00
94.1
3.00
95.2
1.33
89.1
0.46
33.4
72.00
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93.9
3.75
94.0
1.67
88.0
—
—
以各实验温度下胰岛素的不同相对活性(lnCr)对时间(t)回归，可得其回归方程如下：
40℃∶lnCr=4.600 6-8.802 3×10-4t r=-0.977 6
50℃∶lnCr=4.611 4-1.723 4×10-2t r=-0.976 0
, http://www.100md.com
60℃∶lnCr=4.592 9-7.440×10-2t r=-0.983 4
70℃∶lnCr=4.530 5-2.280 1 t r=-0.989 0.
各温度下的失活速率常数、活化能及25℃生物活性有效期见表5.
Tab.5 Chemical kinetic parameters and equation for the degradation of insulin in INS-MP
T/K
1/T×103
k/h-1
lnk
, 百拇医药
lnk-
Ea/kJ.mol-1
T0.9/month
313
3.194 9
8.802 3×10-4
-7.035 3
Lnk=78.69-2.684×104
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r=-0.988 4
223
12.5
323
3.096 0
1.723 4×10-2
-4.060 8
333
3.003 0
7.440 0×10-2
-2.598 4
343
, 百拇医药
2.915 4
2.280 1
0.824 2
3 讨论
在探讨微粒剂有效期预测中，采用了胰岛素生物效价方法，而不是放射免疫法、高效液相色谱法或紫外法等.这主要是力求反映出制剂中有效成分的生物活性.另外，作者也曾利用差示热分析法(DTA)探讨微粒剂的热稳定性，以胰岛素原料为对照测得的活化能为313 kJ/moL，明显高于生物效价方法测得的活化能(Ea=223 kJ/moL)，即说明胰岛素共价键的改变要比维持胰岛素生物活性的空间结构所需能量更高；同时，从测定的有效期数据与室温留样结果相比较也看出，本文对胰岛素制剂稳定性的研究所设计的方法是可行的，以胰岛素效价是否稳定为指标，可真实地反映制剂的稳定性.■
参考文献：
, http://www.100md.com
[1]廖工铁，张志荣，陆彬，等.靶向给药制剂.成都：四川科学技术出版社，1997.81～87
[2]王剑红，陆彬，胥佩菱，等.肺靶向米托蒽醌明胶微球的研究.药学学报，1995，30(7)：549～555
[3]Leah A,Gray B,Sung W,et al.A self-regedating insulin delivery system.I.Characterization of a synthetic glycosylated insulin derivative.Int J Pharm,1989,54(3):241～249
[4]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：二部.北京：人民卫生出版社，1995.附录107～134
[5]125I-胰岛素放射免疫分析药盒说明书.中国原子能科学研究院(北京).1997
[6]王凤山，凌沛学.生化药物研究.北京：人民卫生出版社，1997.249～252
收稿日期：1999-05-17, 百拇医药