PCR与RFLP相结合对临床标本真菌鉴定的研究
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山东医科大学学报 2000年第1期第38卷 论著
作者：杨艳平 王 磊 刘舒萍 潘广锦
单位：济南市中心医院 1内科 2细菌室 3中心实验室
关键词：真菌；聚合酶链反应；限制性片段长度多态性
山东医科大学000132
摘 要：探讨快速、准确检测临床常用标本真菌分离、鉴定方法。方法：PCR与RFLP相结合，应用9种临床重要真菌的通用引物，对常用临床标本(痰、BALF、胸水、尿、血)224份进行分离、鉴定，并对19例进行痰与非痰标本结果一致性、敏感性比较。 结果：224份标本共检出真菌83株，阳性率37.03%，其中白色念珠菌35株(42.3%)，假热带念珠菌30株(36.1%)，热带念珠菌10株(12%)，光滑念珠菌8株(9.6%)。19例痰与非痰标本47次检测，一致性、敏感性良好。结论：PCR结合RFLP对真菌检测具有敏感、快速的特点，值得临床推广应用。
, http://www.100md.com
分类号：R379 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)01-0094-02
COMBINING PCR AND RFLP IN FUNGAL BIOASSAY FOR CLINICAL SAMPLES
YANG Yan-ping,WANG Lei,LIU Shu-ping
(Dept. of Internal Medicine, Jinan Central Hospital)
Abstract：To develop a rapid and accurate method for isolation and identification of fungi in samples detecting medically important fungi for clinical use. Methods:Clinical samples such as sputum, BALF,blood,urine and pleurorrhea were tested by a combination of polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragments length polymorphism (RFLP)and with universal primers for 9 inportant clinical fungal species. PCRRFLP was also used in detecting fungi in different kinds of samples, sputum and non-sputum, and their sensitivity and correlation were compared. Results:83 strains were detected from 224 samples, the positive rate was 37.03%. Among them were 35 strains (42.3%) of Candida albicans, 30 strains of C. pseudotropicalis (36.1%), 10 strains of C. tropicalis(12%)and 8 strains of T. glabrata(9.6%). The sensitivity and correlation were satisfiying in 47 sputum and non-sputum samples from 19 patients. Conclusions:PCR-RFLP is a rapid and sensitive method in detecting medical fungi, and shows a good prospect in clinical use.
, 百拇医药
Keywords：Fungi;Polymerase chain reaction; Restriction fragment length polymorphisms 近年来，真菌已成为院内感染重要的病原菌之一，深部真菌感染的快速诊断是临床亟待解决的问题。传统的真菌培养菌种鉴定需3～5天，阳性率较低，远不能满足临床需要。为寻找一种快速、敏感的诊断方法，我们将PCR技术与RFLP(限制性片段长度多态性)技术相结合，对临床标本进行真菌鉴定，现将结果报告如下。1资料与方法1.1病例选择住院病人82例次，女35例次，男47例次，年龄21～83岁。慢性支气管炎急性发作期61例次，肺炎8例次，中心型肺癌并阻塞性肺炎5例次，自发性气胸5例次，特发性肺间质纤维化并感染3例。所有病例均由X线影像学、病原学明确诊断。1.2方法1.2.1标本采取痰标本177份，按张素[1]方法用无菌痰盒留取，并做痰涂片置低倍镜下观察，每视野鳞状上皮细胞<10个、白细胞>25个为合格标本。按无菌操作留取尿液22份、胸水18份、血液3份、支气管肺泡灌洗液(BALF)4份。合格标本共224份行DNA提取备检。1.2.2PCR方法20ul反应体系含KCl50mmol/L，TrisHCl10mmol/L，O.1%TritonX-100，2.5mmol/LMgCL2，引物l10pmol，引物210pmol，模板DNA2ul，dNTPs各200umol，Taq酶1.0U，加液体石蜡20ul防止蒸发。扩增参数预变性温度94℃、时间20min，94℃30s、55℃30s、72℃100s。延伸温度72℃，时间10min，共35个循环。l.2.3RFLP方法用HaeⅢ限制性内切酶消化PCR扩增产物。将10ul的PCR产物加入灭菌的微量离心管中并与8.0ul的灭菌蒸馏水混匀，加入2.0ul的10×限制酶消化缓冲液混匀。加入20U、2ul的内切酶,总反应体积22ul，混匀后置于37℃温育4h，加入EDTA(pH8.0)使终浓度达到10mmol/L，终止反应。加入6.0ul凝胶电泳载样液，将消化后的NDA直接加样进行凝胶电泳。BglⅠ和NheⅠ的酶切方法同HaeⅢ。1.2.4真菌菌种鉴定本方法所用引物是9种常见医学真菌的通用引物(购自中国军事医学科学院细菌室)，包含的菌种及酶切片段见表I。表1HaeⅢ酶切片段经HaeⅢ酶切可将假热带念珠菌、光滑念珠菌、解脂念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉菌、黄曲酶菌区分开来。白色念珠菌无NheⅠ酶切位点，可用NheⅠ酶切区分白色念球菌和热带念珠菌、近平滑念珠菌。BglⅠ可将近平滑念珠菌的DNA扩增产物水解为383bp和274bp两个片段，而热带念珠菌无BglⅠ的酶切位点，由此将二者区分开来。这样，在分子水平将9种重要医学真菌进行鉴定。2结果2.1菌种构成和阳性率共检测224份标本，真菌76例83抹，阳性率37.05%。83株中白色念珠菌35株占42.3%，假热带念株菌30株占36.1%，热带念珠菌10株占12%，光滑念株菌8株占9.6%。2.2PCR与RPLP用于痰标本和非痰标本检测的一致性和敏感性PCR-RFLP法对19例同时做痰和其中一种非痰标本(血、尿、胸水、BALF)的真菌检测共47次，痰标本18例阳性,阳性率38.8%。非痰标本17例阳性，阳性率36.1%。两组标本结果的一致性分析和敏感性检验表明一致性和敏感性良好(见表2、表3)。表2两组结果的一致性分析一致性：X2=11.75，v=1，PO.993讨论真菌感染的种类增加发病率上升，尤以近20年来变化明显[2]。本研究所用的9种真菌的通用引物能基本复盖临床常见重要真菌,这对混合感染的病原菌鉴定有其优越性。传统的真菌培养、鉴定需3～5天。进入90年代，国外将PCR技术引入真菌检测，但使用的多为单菌种引物。为适应感染菌种日益增多的现状，1994年后建立了广谱(通用)真菌引物进行PCR，辅以分子杂交、酶免疫分析、DNA指纹图等技术进行菌种鉴定，可先于培养阳性结果前l周检出真菌，可检出的景低菌量为l～4cfu/ml，敏感性100%，特异性98%[3,4]，而用于临床标本直接检测的报道较少。本研究所用引物可复盖9种重要医学真菌，辅以RFLP技术，不仅能检出真菌的存在，而且能进行菌种鉴定，与传统方法相比具有广谱(可检出、鉴定9种真菌)、快速(检测、鉴定需7小时)、敏感(先于培养早期检出)的优点。痰、BALF、血、胸水是目前临床检验最常使用的标本，后两种标本虽可达到无污染，但用于下呼吸道真菌感染的诊断其特异性高而敏感性差。BALF的定量细菌培养认为有较高的敏感性和特异性，分别为80%、66%，而真菌培养的敏感性仅有59%[5]。痰培养的敏感性、特异性各家报道不一，分别为15%～100%、11%～100%[6]，如此大的差别与标本的采集、处理有关。有学者对肺部感染患者分别采用正确方法留取痰标本和经气管镜用防污染标本毛刷采取支气管分泌物检测，两组培养结果无显著性差异，证明正确方法采集痰标本可以提高痰培养的阳性率和可信度。本研究痰标本和非痰标本的阳性率非常接近，两组的一致性良好，敏感性无差异。因此，严格按正确方法操作，痰标本可以替代非痰标本用于下呼吸道真菌感染的一般性诊断，对于一般情况差、病情重的患者尤为适宜。
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参考文献：
[1]张素，等.痰培养标本采集方法的探讨[J].中华护理杂志，1993,28(6):323
[2]高明阳，等.下呼吸道感染中的真菌带菌状况[J].中华皮肤科杂志，1996,293(5):370
[3]Makimura K，et al. Detection of a wide range of medical important fungi by the polymerase chain reaction[J].J Med Microbiol，1994,40(5):358
[4]Van BJA，et al. Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens[J].J Clin Microbiol、1998,36(5):1169
[5]Von Eiff M，et al.Pulmonary fungal infections in patients with hematological malignancies-diagnostic approaches [J].Ann Henmatol，1995,70(3):135
[6]Reed W，et al.Sputum gram’s stain in community acquired pneumococcal pneumonia. A Meta-analysis[J].West J Med，1996,165(4):197
收稿日期：1999-12-30, 百拇医药
单位：济南市中心医院 1内科 2细菌室 3中心实验室
关键词：真菌；聚合酶链反应；限制性片段长度多态性
山东医科大学000132
摘 要：探讨快速、准确检测临床常用标本真菌分离、鉴定方法。方法：PCR与RFLP相结合，应用9种临床重要真菌的通用引物，对常用临床标本(痰、BALF、胸水、尿、血)224份进行分离、鉴定，并对19例进行痰与非痰标本结果一致性、敏感性比较。 结果：224份标本共检出真菌83株，阳性率37.03%，其中白色念珠菌35株(42.3%)，假热带念珠菌30株(36.1%)，热带念珠菌10株(12%)，光滑念珠菌8株(9.6%)。19例痰与非痰标本47次检测，一致性、敏感性良好。结论：PCR结合RFLP对真菌检测具有敏感、快速的特点，值得临床推广应用。
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分类号：R379 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)01-0094-02
COMBINING PCR AND RFLP IN FUNGAL BIOASSAY FOR CLINICAL SAMPLES
YANG Yan-ping,WANG Lei,LIU Shu-ping
(Dept. of Internal Medicine, Jinan Central Hospital)
Abstract：To develop a rapid and accurate method for isolation and identification of fungi in samples detecting medically important fungi for clinical use. Methods:Clinical samples such as sputum, BALF,blood,urine and pleurorrhea were tested by a combination of polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragments length polymorphism (RFLP)and with universal primers for 9 inportant clinical fungal species. PCRRFLP was also used in detecting fungi in different kinds of samples, sputum and non-sputum, and their sensitivity and correlation were compared. Results:83 strains were detected from 224 samples, the positive rate was 37.03%. Among them were 35 strains (42.3%) of Candida albicans, 30 strains of C. pseudotropicalis (36.1%), 10 strains of C. tropicalis(12%)and 8 strains of T. glabrata(9.6%). The sensitivity and correlation were satisfiying in 47 sputum and non-sputum samples from 19 patients. Conclusions:PCR-RFLP is a rapid and sensitive method in detecting medical fungi, and shows a good prospect in clinical use.
, 百拇医药
Keywords：Fungi;Polymerase chain reaction; Restriction fragment length polymorphisms 近年来，真菌已成为院内感染重要的病原菌之一，深部真菌感染的快速诊断是临床亟待解决的问题。传统的真菌培养菌种鉴定需3～5天，阳性率较低，远不能满足临床需要。为寻找一种快速、敏感的诊断方法，我们将PCR技术与RFLP(限制性片段长度多态性)技术相结合，对临床标本进行真菌鉴定，现将结果报告如下。1资料与方法1.1病例选择住院病人82例次，女35例次，男47例次，年龄21～83岁。慢性支气管炎急性发作期61例次，肺炎8例次，中心型肺癌并阻塞性肺炎5例次，自发性气胸5例次，特发性肺间质纤维化并感染3例。所有病例均由X线影像学、病原学明确诊断。1.2方法1.2.1标本采取痰标本177份，按张素[1]方法用无菌痰盒留取，并做痰涂片置低倍镜下观察，每视野鳞状上皮细胞<10个、白细胞>25个为合格标本。按无菌操作留取尿液22份、胸水18份、血液3份、支气管肺泡灌洗液(BALF)4份。合格标本共224份行DNA提取备检。1.2.2PCR方法20ul反应体系含KCl50mmol/L，TrisHCl10mmol/L，O.1%TritonX-100，2.5mmol/LMgCL2，引物l10pmol，引物210pmol，模板DNA2ul，dNTPs各200umol，Taq酶1.0U，加液体石蜡20ul防止蒸发。扩增参数预变性温度94℃、时间20min，94℃30s、55℃30s、72℃100s。延伸温度72℃，时间10min，共35个循环。l.2.3RFLP方法用HaeⅢ限制性内切酶消化PCR扩增产物。将10ul的PCR产物加入灭菌的微量离心管中并与8.0ul的灭菌蒸馏水混匀，加入2.0ul的10×限制酶消化缓冲液混匀。加入20U、2ul的内切酶,总反应体积22ul，混匀后置于37℃温育4h，加入EDTA(pH8.0)使终浓度达到10mmol/L，终止反应。加入6.0ul凝胶电泳载样液，将消化后的NDA直接加样进行凝胶电泳。BglⅠ和NheⅠ的酶切方法同HaeⅢ。1.2.4真菌菌种鉴定本方法所用引物是9种常见医学真菌的通用引物(购自中国军事医学科学院细菌室)，包含的菌种及酶切片段见表I。表1HaeⅢ酶切片段经HaeⅢ酶切可将假热带念珠菌、光滑念珠菌、解脂念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉菌、黄曲酶菌区分开来。白色念珠菌无NheⅠ酶切位点，可用NheⅠ酶切区分白色念球菌和热带念珠菌、近平滑念珠菌。BglⅠ可将近平滑念珠菌的DNA扩增产物水解为383bp和274bp两个片段，而热带念珠菌无BglⅠ的酶切位点，由此将二者区分开来。这样，在分子水平将9种重要医学真菌进行鉴定。2结果2.1菌种构成和阳性率共检测224份标本，真菌76例83抹，阳性率37.05%。83株中白色念珠菌35株占42.3%，假热带念株菌30株占36.1%，热带念珠菌10株占12%，光滑念株菌8株占9.6%。2.2PCR与RPLP用于痰标本和非痰标本检测的一致性和敏感性PCR-RFLP法对19例同时做痰和其中一种非痰标本(血、尿、胸水、BALF)的真菌检测共47次，痰标本18例阳性,阳性率38.8%。非痰标本17例阳性，阳性率36.1%。两组标本结果的一致性分析和敏感性检验表明一致性和敏感性良好(见表2、表3)。表2两组结果的一致性分析一致性：X2=11.75，v=1，PO.993讨论真菌感染的种类增加发病率上升，尤以近20年来变化明显[2]。本研究所用的9种真菌的通用引物能基本复盖临床常见重要真菌,这对混合感染的病原菌鉴定有其优越性。传统的真菌培养、鉴定需3～5天。进入90年代，国外将PCR技术引入真菌检测，但使用的多为单菌种引物。为适应感染菌种日益增多的现状，1994年后建立了广谱(通用)真菌引物进行PCR，辅以分子杂交、酶免疫分析、DNA指纹图等技术进行菌种鉴定，可先于培养阳性结果前l周检出真菌，可检出的景低菌量为l～4cfu/ml，敏感性100%，特异性98%[3,4]，而用于临床标本直接检测的报道较少。本研究所用引物可复盖9种重要医学真菌，辅以RFLP技术，不仅能检出真菌的存在，而且能进行菌种鉴定，与传统方法相比具有广谱(可检出、鉴定9种真菌)、快速(检测、鉴定需7小时)、敏感(先于培养早期检出)的优点。痰、BALF、血、胸水是目前临床检验最常使用的标本，后两种标本虽可达到无污染，但用于下呼吸道真菌感染的诊断其特异性高而敏感性差。BALF的定量细菌培养认为有较高的敏感性和特异性，分别为80%、66%，而真菌培养的敏感性仅有59%[5]。痰培养的敏感性、特异性各家报道不一，分别为15%～100%、11%～100%[6]，如此大的差别与标本的采集、处理有关。有学者对肺部感染患者分别采用正确方法留取痰标本和经气管镜用防污染标本毛刷采取支气管分泌物检测，两组培养结果无显著性差异，证明正确方法采集痰标本可以提高痰培养的阳性率和可信度。本研究痰标本和非痰标本的阳性率非常接近，两组的一致性良好，敏感性无差异。因此，严格按正确方法操作，痰标本可以替代非痰标本用于下呼吸道真菌感染的一般性诊断，对于一般情况差、病情重的患者尤为适宜。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]张素，等.痰培养标本采集方法的探讨[J].中华护理杂志，1993,28(6):323
[2]高明阳，等.下呼吸道感染中的真菌带菌状况[J].中华皮肤科杂志，1996,293(5):370
[3]Makimura K，et al. Detection of a wide range of medical important fungi by the polymerase chain reaction[J].J Med Microbiol，1994,40(5):358
[4]Van BJA，et al. Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens[J].J Clin Microbiol、1998,36(5):1169
[5]Von Eiff M，et al.Pulmonary fungal infections in patients with hematological malignancies-diagnostic approaches [J].Ann Henmatol，1995,70(3):135
[6]Reed W，et al.Sputum gram’s stain in community acquired pneumococcal pneumonia. A Meta-analysis[J].West J Med，1996,165(4):197
收稿日期：1999-12-30, 百拇医药