HCV体外感染多种细胞株的观察
作者：叶进 曾令兰 刘微 郭劲松 罗端德
单位：叶进(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)；曾令兰(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)；刘微(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)；郭劲松(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)；罗端德(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)
关键词：丙型肝炎病毒；体外感染；细胞株
疾病控制杂志000109
【摘 要】 目的 寻找HCV体外感染的细胞培养系统。方法 选用HCV RNA阳性血清感染人单核细胞株(U937)、人T淋巴细胞株(Molt-4)、人胆囊细胞株(Kirlich)、猪肾细胞株(PK15)、鼠睾丸细胞株(STE)、人肝癌细胞株(HepG2和Hep3B)等7种细胞。应用RT-PCR法检测HCV RNA在这7种细胞中的感染和复制情况。结果 7种细胞中均能检测到HCV RNA正链，并且在U937、Molt-4和HepG2细胞株中发现HCV RNA负链。结论 U937、Molt-4和HepG2细胞株可以作为HCV体外感染的细胞培养系统。
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【分类号】 R512.63； R392.33 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(2000)01-0030-02
A study of several kinds of cell lines infected with HCV in vitro
YE Jin ZENG Lin-lan LIU Wei GUO Jin-song LUO Duan-de
(Department of Infectious Diseases, Xiehe Hosptial, Tongji Medical University, Wuhan 430022, China)
【Abstract】 Objective To search for cell lines as a propagation model system for HCV infection in vitro. Methods The human mononuclear cell line (U937), human T lymph cell line (Molt-4), human gull cell line (Kirlich), swine kidney cell line (PK15), rat testicle cell line (STE), human liver cancer cell line (HepG2 and Hep3B) were infected with positive serum of HCV RNA, and the infection and replication of HCV RNA in those cell lines were studied by RT-PCR. Results The positive chains of HCV RNA were detected in all of those cell lines and the negative chains of HCV RNA were detected in cell lines of U937, Molt-4 and HepG2. Conclusions The cell lines of U937, Molt-4 and HepG2 could serve as propagation model systems for HCV infection in vitro.
, 百拇医药
【Key words】 hepatitis C Virus; infection in vitro; cell lines
丙型肝炎病毒(HCV)在感染者的肝组织和周围血白细胞中含量较少，因此在电镜下很难看到病毒颗粒。由于缺乏合适的HCV感染的细胞和动物模型，使得HCV的研究进展受到了很大的限制[1]。为了寻找HCV体外感染的细胞模型，我们对7种细胞株进行了感染和培养，现报道结果如下。
1 材料与方法
1.1 感染材料 选用经RT-PCR法证实为HCV RNA阳性的血清，用血清学方法检查甲、乙、丁、戊型肝炎标志为阴性，以此作为接种物。同时选用正常人的血清作为阴性对照。
1.2 HCV的细胞感染
1.2.1 细胞来源 人单核细胞株(U937)、人T淋巴细胞株(Molt-4)、人胆囊细胞株(Kirlich)、猪肾细胞株(PK15)、鼠睾丸细胞株(STE)，由德国海德堡大学肝病实验室提供。人肝癌细胞株(HepG2和Hep3B)由中国典型培养物保藏中心提供。
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1.2.2 悬浮细胞的感染 将U937和Molt-4细胞稀释至每瓶1×107，分别用1 ml HCV RNA阳性或阴性血清感染细胞，置于37℃二氧化碳孵箱中过夜。次日离心弃去上清，用1×PBS离心洗涤3次，再加入细胞培养液继续孵化。
1.2.3 贴壁细胞的感染 将其余的五种细胞培养至每瓶1×105，弃去上清，分别加入1 ml HCV RNA阳性或阴性血清孵化2 h，再加入细胞培养液过夜。次日弃去上清，用1×PBS洗涤细胞3次，加入细胞培养液继续孵化。
1.3 标本收集 于感染后的每三天细胞传代时收集细胞和上清直至第28天，准备作RT-PCR检测。
1.4 RT-PCR法检测HCV RNA 细胞和细胞培养上清经RNA抽提(酚/氯仿法抽提，乙醇沉淀)后，在适当的负链或正链引物存在下转录成cDNA，再经过两次nested PCR,完成cDNA的复制。所用引物由德国Tubingen动物病毒研究所提供。
, 百拇医药
1.5 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 将PCR产物置于2%琼脂糖凝胶电泳膜中，同时加入加样缓冲液(1 mg.ml-1溴酚兰，2 mg.ml-1 Orange G, 50%蔗糖和50% FM EDTA)。电泳完毕后用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察DNA条带。
2 结果
PCR扩增产物为290 bp，置于紫外灯下可见荧光条带。
2.1 U937细胞株 在感染后的第1代、第2代和第3代中同时发现HCV RNA的正、负链。
2.2 Molt-4细胞株 在感染后的第1代、第2代和第七代中发现HCV RNA的正链；第1代和第2代中发现HCV RNA负链。
, 百拇医药 2.3 Kirlich细胞株 仅在感染后的第1代中发现HCV RNA正链。
2.4 PK15细胞株 在感染后的第1代和第6代中发现HCV RNA的正链，未发现HCV RNA负链。
2.5 STE细胞株 仅在感染后的第1代和第2代中发现HCV RNA正链。
2.6 HepG2细胞株 在感染后的第1代、第2代和第6代中发现HCV RNA正链；同时在第1代和第2代中发现HCV RNA负链。
2.7 Hep3B细胞株 仅在感染后的第1代和第2代中发现HCV RNA正链。
7种细胞的感染情况详见表1。
表1 HCV感染7种细胞株后HCV RNA的检测情况
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Table 1 HCV RNA testing results after HCV infecting
7 types of cell lines HCV RNA
Cell lines
U937
Molt-4
Kirlich
PK15
STE
HepG2
Hep3B
Positive chain
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1、2、3
1、2、7
1
1、6
1、2
1、2、6
1、2
Negative chain
1、2、3
1、2
-
-
-
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1、2
-
3 讨论
自1989年美国Chiron公司首先成功地克隆了HCV cDNA以后[2]，先后有众多关于建立HCV体外感染细胞模型的报道[3～5]。目前已报道的HCV体外感染细胞模型包括两大类，即转基因细胞模型和血清感染细胞模型。我们选择了血清感染细胞模型这一实验方式，用HCV RNA阳性血清直接感染靶细胞，利用PCR法检测感染后的产物，结果证实这种实验方法具备直接、简单、快速和易重复等优点。在感染后的细胞中能直接检测到HCV的核酸。
HCV除感染人肝组织外，在外周血单核细胞、T淋巴细胞和其他组织中也能检测到HCV RNA[5]，说明在自然感染过程中，除了肝脏细胞外，外周血细胞和其他组织也能作为HCV感染的靶细胞。因此，我们选用了人肝癌细胞株、人单核细胞株，人T淋巴细胞株、人胆囊细胞株和其他细胞株作为靶细胞，试图研究HCV在这些细胞株中感染和复制的情况，寻找和筛选敏感的HCV体外感染细胞培养系统。实验结果表明，HCV在猪肾细胞株、鼠睾丸细胞株和人肝癌细胞(Hep3B)中能间断表达，能检测到HCV RNA的正链，但无HCV复制的中间体——负链存在。人胆囊细胞株仅在感染后的第1代检测到HCV RNA正链，从第2代直至感染结束，再无HCV RNA出现。人单核细胞株、人T淋巴细胞株和人肝癌细胞株(HepG2)可以作为HCV体外感染的细胞培养系统，这与HCV在人体内感染的情况相一致。
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HCV是丙型病毒性肝炎的病原体，丙型肝炎直接威胁人类健康，是导致肝硬化和肝癌的重要原因。对于HCV感染迄今缺乏有效的特异性抗病毒药物，干扰素是广泛应用的治疗丙型肝炎的抗病毒药物，但仅能使10%～25%的慢性丙型肝炎患者有效地清除血清中的HCV RNA[6]，因此提高抗病毒药物作用将取决于较好的细胞培养系统和对动物模型的进一步研究。
【作者简介】 叶进(1959-)，女，湖北武汉人，副教授，博士，1993～1994年赴德国海德堡大学学习，主要研究方向：丙型肝炎病毒传染性和复制研究。
【参考文献】
[1] 王小红. 抗丙型肝炎病毒药物评价模型研究进展 [J]. 国外医学*传染病学流行病学分册，1997，24(4)：156～157.
[2] Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A non-B viral hepatitis genome [J]. Science, 1989,244:359～401.
, 百拇医药
[3] Lanford RE, Sureau C, Jacob JR, et al. Demonstration of in vitro infection of chimpanzee hepatocytes with hepatitis C virus using strand-specific RT/PCR [J]. Virology, 1994,202:606～608.
[4] Hiramatsu N, Dash S, Gerber A. HCV cDNA transfection to HepG2 cells [J]. J Viral Hpat, 1997(suppl.1).61～62.
[5] Takamatsu K, Royanagi Y, Okita R, et al. Hepatitis C virus RNA in saliva [J]. Lancet, 1990,5:1515～1516.
[6] 张永祥. 慢性病毒性肝炎的治疗 [J]. 国外医学*传染病学流行病学分册，1997，24(6)：260～261.
(收稿日期：1999-06-27), 百拇医药
单位：叶进(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)；曾令兰(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)；刘微(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)；郭劲松(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)；罗端德(同济医科大学附属协和医院传染病学教研室， 湖北 武汉 430022)
关键词：丙型肝炎病毒；体外感染；细胞株
疾病控制杂志000109
【摘 要】 目的 寻找HCV体外感染的细胞培养系统。方法 选用HCV RNA阳性血清感染人单核细胞株(U937)、人T淋巴细胞株(Molt-4)、人胆囊细胞株(Kirlich)、猪肾细胞株(PK15)、鼠睾丸细胞株(STE)、人肝癌细胞株(HepG2和Hep3B)等7种细胞。应用RT-PCR法检测HCV RNA在这7种细胞中的感染和复制情况。结果 7种细胞中均能检测到HCV RNA正链，并且在U937、Molt-4和HepG2细胞株中发现HCV RNA负链。结论 U937、Molt-4和HepG2细胞株可以作为HCV体外感染的细胞培养系统。
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【分类号】 R512.63； R392.33 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(2000)01-0030-02
A study of several kinds of cell lines infected with HCV in vitro
YE Jin ZENG Lin-lan LIU Wei GUO Jin-song LUO Duan-de
(Department of Infectious Diseases, Xiehe Hosptial, Tongji Medical University, Wuhan 430022, China)
【Abstract】 Objective To search for cell lines as a propagation model system for HCV infection in vitro. Methods The human mononuclear cell line (U937), human T lymph cell line (Molt-4), human gull cell line (Kirlich), swine kidney cell line (PK15), rat testicle cell line (STE), human liver cancer cell line (HepG2 and Hep3B) were infected with positive serum of HCV RNA, and the infection and replication of HCV RNA in those cell lines were studied by RT-PCR. Results The positive chains of HCV RNA were detected in all of those cell lines and the negative chains of HCV RNA were detected in cell lines of U937, Molt-4 and HepG2. Conclusions The cell lines of U937, Molt-4 and HepG2 could serve as propagation model systems for HCV infection in vitro.
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【Key words】 hepatitis C Virus; infection in vitro; cell lines
丙型肝炎病毒(HCV)在感染者的肝组织和周围血白细胞中含量较少，因此在电镜下很难看到病毒颗粒。由于缺乏合适的HCV感染的细胞和动物模型，使得HCV的研究进展受到了很大的限制[1]。为了寻找HCV体外感染的细胞模型，我们对7种细胞株进行了感染和培养，现报道结果如下。
1 材料与方法
1.1 感染材料 选用经RT-PCR法证实为HCV RNA阳性的血清，用血清学方法检查甲、乙、丁、戊型肝炎标志为阴性，以此作为接种物。同时选用正常人的血清作为阴性对照。
1.2 HCV的细胞感染
1.2.1 细胞来源 人单核细胞株(U937)、人T淋巴细胞株(Molt-4)、人胆囊细胞株(Kirlich)、猪肾细胞株(PK15)、鼠睾丸细胞株(STE)，由德国海德堡大学肝病实验室提供。人肝癌细胞株(HepG2和Hep3B)由中国典型培养物保藏中心提供。
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1.2.2 悬浮细胞的感染 将U937和Molt-4细胞稀释至每瓶1×107，分别用1 ml HCV RNA阳性或阴性血清感染细胞，置于37℃二氧化碳孵箱中过夜。次日离心弃去上清，用1×PBS离心洗涤3次，再加入细胞培养液继续孵化。
1.2.3 贴壁细胞的感染 将其余的五种细胞培养至每瓶1×105，弃去上清，分别加入1 ml HCV RNA阳性或阴性血清孵化2 h，再加入细胞培养液过夜。次日弃去上清，用1×PBS洗涤细胞3次，加入细胞培养液继续孵化。
1.3 标本收集 于感染后的每三天细胞传代时收集细胞和上清直至第28天，准备作RT-PCR检测。
1.4 RT-PCR法检测HCV RNA 细胞和细胞培养上清经RNA抽提(酚/氯仿法抽提，乙醇沉淀)后，在适当的负链或正链引物存在下转录成cDNA，再经过两次nested PCR,完成cDNA的复制。所用引物由德国Tubingen动物病毒研究所提供。
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1.5 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 将PCR产物置于2%琼脂糖凝胶电泳膜中，同时加入加样缓冲液(1 mg.ml-1溴酚兰，2 mg.ml-1 Orange G, 50%蔗糖和50% FM EDTA)。电泳完毕后用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察DNA条带。
2 结果
PCR扩增产物为290 bp，置于紫外灯下可见荧光条带。
2.1 U937细胞株 在感染后的第1代、第2代和第3代中同时发现HCV RNA的正、负链。
2.2 Molt-4细胞株 在感染后的第1代、第2代和第七代中发现HCV RNA的正链；第1代和第2代中发现HCV RNA负链。
, 百拇医药 2.3 Kirlich细胞株 仅在感染后的第1代中发现HCV RNA正链。
2.4 PK15细胞株 在感染后的第1代和第6代中发现HCV RNA的正链，未发现HCV RNA负链。
2.5 STE细胞株 仅在感染后的第1代和第2代中发现HCV RNA正链。
2.6 HepG2细胞株 在感染后的第1代、第2代和第6代中发现HCV RNA正链；同时在第1代和第2代中发现HCV RNA负链。
2.7 Hep3B细胞株 仅在感染后的第1代和第2代中发现HCV RNA正链。
7种细胞的感染情况详见表1。
表1 HCV感染7种细胞株后HCV RNA的检测情况
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Table 1 HCV RNA testing results after HCV infecting
7 types of cell lines HCV RNA
Cell lines
U937
Molt-4
Kirlich
PK15
STE
HepG2
Hep3B
Positive chain
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1、2、3
1、2、7
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1、2、6
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Negative chain
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3 讨论
自1989年美国Chiron公司首先成功地克隆了HCV cDNA以后[2]，先后有众多关于建立HCV体外感染细胞模型的报道[3～5]。目前已报道的HCV体外感染细胞模型包括两大类，即转基因细胞模型和血清感染细胞模型。我们选择了血清感染细胞模型这一实验方式，用HCV RNA阳性血清直接感染靶细胞，利用PCR法检测感染后的产物，结果证实这种实验方法具备直接、简单、快速和易重复等优点。在感染后的细胞中能直接检测到HCV的核酸。
HCV除感染人肝组织外，在外周血单核细胞、T淋巴细胞和其他组织中也能检测到HCV RNA[5]，说明在自然感染过程中，除了肝脏细胞外，外周血细胞和其他组织也能作为HCV感染的靶细胞。因此，我们选用了人肝癌细胞株、人单核细胞株，人T淋巴细胞株、人胆囊细胞株和其他细胞株作为靶细胞，试图研究HCV在这些细胞株中感染和复制的情况，寻找和筛选敏感的HCV体外感染细胞培养系统。实验结果表明，HCV在猪肾细胞株、鼠睾丸细胞株和人肝癌细胞(Hep3B)中能间断表达，能检测到HCV RNA的正链，但无HCV复制的中间体——负链存在。人胆囊细胞株仅在感染后的第1代检测到HCV RNA正链，从第2代直至感染结束，再无HCV RNA出现。人单核细胞株、人T淋巴细胞株和人肝癌细胞株(HepG2)可以作为HCV体外感染的细胞培养系统，这与HCV在人体内感染的情况相一致。
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HCV是丙型病毒性肝炎的病原体，丙型肝炎直接威胁人类健康，是导致肝硬化和肝癌的重要原因。对于HCV感染迄今缺乏有效的特异性抗病毒药物，干扰素是广泛应用的治疗丙型肝炎的抗病毒药物，但仅能使10%～25%的慢性丙型肝炎患者有效地清除血清中的HCV RNA[6]，因此提高抗病毒药物作用将取决于较好的细胞培养系统和对动物模型的进一步研究。
【作者简介】 叶进(1959-)，女，湖北武汉人，副教授，博士，1993～1994年赴德国海德堡大学学习，主要研究方向：丙型肝炎病毒传染性和复制研究。
【参考文献】
[1] 王小红. 抗丙型肝炎病毒药物评价模型研究进展 [J]. 国外医学*传染病学流行病学分册，1997，24(4)：156～157.
[2] Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A non-B viral hepatitis genome [J]. Science, 1989,244:359～401.
, 百拇医药
[3] Lanford RE, Sureau C, Jacob JR, et al. Demonstration of in vitro infection of chimpanzee hepatocytes with hepatitis C virus using strand-specific RT/PCR [J]. Virology, 1994,202:606～608.
[4] Hiramatsu N, Dash S, Gerber A. HCV cDNA transfection to HepG2 cells [J]. J Viral Hpat, 1997(suppl.1).61～62.
[5] Takamatsu K, Royanagi Y, Okita R, et al. Hepatitis C virus RNA in saliva [J]. Lancet, 1990,5:1515～1516.
[6] 张永祥. 慢性病毒性肝炎的治疗 [J]. 国外医学*传染病学流行病学分册，1997，24(6)：260～261.
(收稿日期：1999-06-27), 百拇医药