Lipofectin介导DNA聚合酶α反义寡核苷酸抑制人胃癌细胞生长
作者：程黎阳 宋新明 高毅 杨继震
单位：程黎阳 宋新明(广州军区广州总医院普外科(510010)；高毅 杨继震(第一军医大学江医院普外科(510282)
关键词：反义寡核苷酸；DNA聚合酶α；胃肿瘤；阳离子脂质体
广东医学000105
【摘要】 目的 研究阳离子脂质体Lipofectin(Lip)介导的DNA聚合酶α(DNA-pol α)反义寡核苷酸(ASODN)体外抑制人胃癌细胞的生长。 方法 合成与人pol α催化亚基mRNA翻译起始区18个碱基互补的寡核苷酸(ODN),与Lip混合制备Lip+ODN复合物,作用于MGC-803、SGC-7901人胃癌细胞24 h后,细胞换液,继续培养24 h,用噻唑蓝(MTT)比色法测细胞存活状态,流式细胞术(FCM)分析癌细胞DNA含量。结果 10 μg/ml pol α特异的ASODN在Lip介导下可显著抑制人胃癌细胞的DNA复制和细胞增殖,正义ODN(SODN)无此作用。 结论 DNA-pol α特异ASODN可用于胃癌的基因治疗, 阳离子脂质体可促进ASODN大量进入癌细胞, 增强其生物效应。
, http://www.100md.com
The growth inhibition of human gastric cancer cells by Lipofection-mediated of DNA polymerase alpha antisense oligodeoxynucleotides
Cheng Liyang Song Xinming Gao Yi et al
(Department o f General Surgery, General Hospital of Guangzhou Command Area, Guangzhou Command of PLA, Guangzhou 510010)
【Abstract】 Objective To sutdy the growth inhibition of human gastric cancer cells by Lipofectin-mediated DNA polymerase α(DNA-pol α) antisense oligodeoxynucleotides (ASODN). Methods Oligonucleotides (ODN) including ASODN and sense ODN (SODN) targeted against the translation start site of pol α mRNA were synthesized and combined to Lipofectin (Lip) to prepare Lip+ODN complexes. After exposure to these complexes for 24 hours and continual incubation in complete medium for another 24 hours, the growth inhibition and DNA contents of MGC-803 and SGC-7901 human gastric cancer cells were studied by means of MTT assay and flow cytometry (FCM). Results 10 μg/ml of ASODN specific to pol α mediated by Lipofectin exhibited a significant effect on the DNA replication and proliferation of human gastric cancer cellos. Sense ODN (SODN) had no similar effect. Conclusions ASODN specific to pol α may be used in the gene therapy of cancer. Cationic liposome can increase the entry of ASODN into target cells and inprove the biological effect of ASODN.
, 百拇医药
【Key words】 Oligodeoxynucleotide antisense DNA polymerase α Gastric neoplasm Lipofectin
反义寡核苷酸(ASODN)作为基因药物为癌症的特异治疗带来了希望[1]。 DNA聚合酶α(DNA-pol α) 是真核生物细胞DNA复制的关键酶，与肿瘤的发生和发展密切相关[2]。 人胃癌组织中pol α的含量增加, 酶活性增强,mRNA高表达。 因此, pol α催化亚基mRNA可作为理想靶核酸, 用以构建抗肿瘤的ASODN。但此类游离的ASODN带大量离子化基团, 亲脂性差, 靶细胞摄入困难。有研究发现:完整的培养细胞对ASODN的摄入在保温1～4 h后达到一个平台期, 其水平仅相当于外部浓度的10%。这使得投入细胞培养系中的ASODN浓度需很高(5～500 μm)才能显出有效作用。本文合成与pol α催化亚基mRNA翻译起始区互补的含18个核苷酸的ASODN, 利用阳离子脂质体Lipofectin介导ASODN快速大量进入体外培养的人胃癌细胞, 增强此ASODN的抗胃癌细胞生长作用。
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1 材料与方法
1.1 细胞系 人胃癌细胞系MGC-803和SGC-7901(第四军医大学西京医院消化中心赠) 培养于含10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液中(56℃, 1 h)。
1.2 ODN合成 与pol α催化亚基mRNA翻译起始区互补的ODN碱基顺序如下：ASODN：5′-GTGCACAGGTGCCACGGT- 3′;SODN：5′- ACCATGGCACCTGTGCAC-3′。 采用固相亚磷酰胺法在ABI381A型DNA自动合成仪上合成。
1.3 MTT法和FCM技术 参见我们的既往报告[3]。 其中细胞生长抑制率(%)=1-处理组A 560 nm/对照组A 560 nm。DNA指数(DI)=胃癌细胞G0G1期峰均道值/鸡红血球细胞G0G1期峰均道值。
, 百拇医药
1.4 Lip+ODN复合物的制备 Lip由阳离子脂质DOTMA和中性磷脂DOPE按1∶1(m/m)比例在膜过滤水中合成, 每毫升含1 mg。分别按1 μg∶20 μl 和1 μl ∶ 10 μl的比例用去离子水稀释寡核苷酸和脂质体, 轻混二溶液, 室温下置30 min, 制成Lip+ODN复合物, 然后分别加入一定量的含10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液, 使ODN的浓度区分为2.5，5.0，10.0和20.0 μg/ml 。
1.5 Lip+ODN转染人胃癌细胞 MGC-803和SGC-7901各设Lip+ASODN、Lip+SODN 2个实验组及一个空白Lip对照组,每个实验组中ODN浓度分为2.5，5.0，10.0，20.0 mg/L，这样每种细胞有8个实验组和1个对照组, 每组设3个复孔, 共27孔。 取对数生长期人胃癌细胞,制成5×104/ml的细胞悬液, 按5 000个/孔(100 μl) 的密度接种于96孔培养板上, 24 h后吸去培养液, 加入含Lip+ODN的RPMI-1640培养液, 继续培养24 h后细胞换液。再培养24 h后分别用MTT法测定吸光度A 560 nm, FCM分析细胞DNA含量, 最后结果取3个复孔的均值。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 配伍组设计的多个样本计数资料秩和检验和析因分析。
2 结果
2.1 Lip+ODN对人胃癌细胞生长的抑制作用 见表1。从表1可见10 μg/L的ASODN在Lip介导下即可显著抑制SGC-7901人胃癌细胞的生长, 且10 μg/L可视为ASODN的半数抑制浓度,而游离的ASODN在同样条件下需100 μg/L才可产生相当效应[3]。SODN无明显作用， MGC-803细胞的结果类似。
表1 Lip+ODN对SGC-7 901人胃癌细胞生长抑制作用 % 组别
ODN浓度(μg/L)
2.5
5.0
, http://www.100md.com
10.0
20.0
Lip+ASODN
9.2
8.4
47.8
53.9
Lip+SODN
5.1
7.6
11.8
8.3
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与Lip+SODN组比较P<0.01
2.2 Lip+ODN抑制人胃癌细胞DNA合成 见表2。表2显示与空白Lip对照组相比, 10 μg/ml的ASODN在Lip介导下可使人胃癌细胞的DI值显著降低。Lip+SON无显著作用(P>0.05)。
表2 Lip+ODN抑制人胃癌细胞DNA合成 细胞系
DI值
Lip+ASODN
Lip+SODN
Lip
SGC-7901
0.87
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1.28
1.41
MGC-803
0.89
1.34
1.37
与Lip组比较P<0.053 讨论
DNA自动合成仪研制成功后, 有关反义寡核苷酸的研究大量报道, 并成为基因治疗领域的热点。目前ASODN的靶核酸很多,我们选择的人DNA-pol α虽是正常和肿瘤细胞所共有的, 但在肿瘤细胞中表达的稳态pol α mRNA水平比正常细胞要高出40倍。根据“优先”的原则，pol α mRNA特异的ASODN“优先”抑制肿瘤细胞“优先”需要的高表达pol α mRNA,而使DNA-pol α合成减少,DNA复制受抑,胃癌细胞增殖受限。但正常细胞可以不受或极少受影响。
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ASODN的作用机理十分复杂。基因表达在mRNA的剪接、转录和翻译等各个水平都可能受到影响,目前的讨论大多限于理论方面。研究者在ASODN转染的细胞中通过直接检测RNA，DNA复合体及靶mRNA水平从而在分子水平揭示了ASODN作用的反义机制。本实验虽无分子生物学的直接证据, 但胃癌细胞中DNA合成大大减少，细胞增殖受限已足以说明问题。
对不同细胞和靶基因,靶位点的选择不尽相同。一般靶向mRNA翻译起始区的ASODN强于靶向编码区的ASODN。本研究中癌细胞DNA复制并未完全中止, 原因可能是: ①有些mRNA在体内存在时间极短, ASODN在培养系中又极易被降解,有效浓度难以维持, 且mRNA并非一条直线, 而是回折成二级结构。以上因素均可影响ASODN与靶mRNA的杂交效率; ②细胞中还存在pol α之外的DNA聚合酶参与DNA复制, 如DNA-pol β、pol γ及pol δ等;③观察时间不够长。 Tortora等[4]在人白血病细胞HL-60中每隔48 h重复加入10 μmol/L的RI α ASODN, 共培养8 d, 使HL-60细胞完全停止增埴。
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1987年Felgner等[5]首次用人工合成的阳离子脂质DOTMA构建小单层脂质体, 与DNA自发作用形成脂质-DNA复合物, 促进了DNA的细胞摄入及胞内稳定表达。后来的研究又进一步发现有中性磷脂参与构成的阳离子脂质体活性更强[6]。而Lipofectin即是由阳离子脂质DOTMA和中性磷脂DOPE合成的脂质体。其机理是阳离子脂质体通过静电引力作用与带负电荷的核酸自发形成复合物, 净电荷为正的此复合物又很容易结合到带负电荷的细胞表面, 与细胞膜融合, 通过细胞内吞作用进入胞内。因此它与传统脂质体不同, 并非将核酸包入脂质体囊内, 而是结合到表面, 只需混合即可俘获几乎100%的核酸, 而传统脂质体的核酸包裹率不到10%，与硫酸钙共沉淀法或DEAE-葡聚糖方法相比, 应用Lipofectin的核酸转染率要高出5～100倍。 1989年Stoolman[7]研究发现: DOTMA可使细胞摄入ASODN的量增加10倍以上, 而且因为显著改变了其在细胞内的分布情况使ASODN的生物活性增强了100倍。 1991年Chiang等[8]首次在哺乳动物细胞中证实阳离子脂质体可使ASODN的作用明显增强。1994年Nestle等[9]将Lipofectin与靶向细胞间粘连分子1(ICAM-1)mRNA的ASODN混合后作用于角细胞, 使ICAM-1的表达减少50%, 而无Lipofectin介导时仅减少30%。 本实验也表明人DNA-pol α mRNA特异的ASODN在Lipofectin介导下抑制人胃癌细胞增殖的作用增强了10倍。因此Lipofectin可望成为有效的运载工具, 介导ASODN进入体外培养细胞, 解决细胞摄入困难的问题。而且Lip+ODN复合物以细胞内吞方式进入胞内可避免溶酶体酶的降解, 克服ODN的不稳定性。 这为ASODN的进一步体内实验和将来过渡到临床应用打下基础。
, 百拇医药
参考文献
1，Bonn D. Prospects for antisense therapy are looking brighter. Lancet, 1996, 347(9004):820
2，程黎阳, 高，毅, 杨继震. DNA聚合酶与肿瘤. 医学综述, 1997，3(5)：227
3，程黎阳, 高，毅, 杨继震. DNA聚合酶α反义寡核苷酸抑制人胃癌细胞生长. 新消化病杂志, 1996，4(2)：666
4，Tortora G, Pepe S, Bianco C, et al. The RI alpha subunit of protein kinase A controls serum dependency and entry into cell cycle of human mammary epithelial cells. Oncogene, 1994, 9(11):3233～3240
, 百拇医药
5，Felgner PL, Gadek TK, Holm M, et al. Lipofection: a highly efficient lipid-mediated DNA transfection procedure. Pro Natl Acad USA, 1987, 84:7413
6，Felgner JH, Kumar R, Scidhar CN, et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J Biol Chem, 1994, 269(4):2550
7，Stoolman LM. Adhesion molecules controlling lymphocytic migration. Cell, 1989, 56:907
, http://www.100md.com
8，Chiang MY Chan H, Zounes MA, et al. Antisense oligonucleotides inhibit intercellular adhesion molecule 1 expression by two distinct mechanisms. J Biol Chem, 1991, 266(27):18162
9，Nestle FO, Mitra RS, Bennet CF, et al. Cationic lipidis required for uptake and selective inhibitory activity of ICAM-1 phosphorothioate antisense oligonucleotides in keratinocytes. J Invest Dermatol, 1994, 103(4):569
(收稿日期：1999-09-20), 百拇医药
单位：程黎阳 宋新明(广州军区广州总医院普外科(510010)；高毅 杨继震(第一军医大学江医院普外科(510282)
关键词：反义寡核苷酸；DNA聚合酶α；胃肿瘤；阳离子脂质体
广东医学000105
【摘要】 目的 研究阳离子脂质体Lipofectin(Lip)介导的DNA聚合酶α(DNA-pol α)反义寡核苷酸(ASODN)体外抑制人胃癌细胞的生长。 方法 合成与人pol α催化亚基mRNA翻译起始区18个碱基互补的寡核苷酸(ODN),与Lip混合制备Lip+ODN复合物,作用于MGC-803、SGC-7901人胃癌细胞24 h后,细胞换液,继续培养24 h,用噻唑蓝(MTT)比色法测细胞存活状态,流式细胞术(FCM)分析癌细胞DNA含量。结果 10 μg/ml pol α特异的ASODN在Lip介导下可显著抑制人胃癌细胞的DNA复制和细胞增殖,正义ODN(SODN)无此作用。 结论 DNA-pol α特异ASODN可用于胃癌的基因治疗, 阳离子脂质体可促进ASODN大量进入癌细胞, 增强其生物效应。
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The growth inhibition of human gastric cancer cells by Lipofection-mediated of DNA polymerase alpha antisense oligodeoxynucleotides
Cheng Liyang Song Xinming Gao Yi et al
(Department o f General Surgery, General Hospital of Guangzhou Command Area, Guangzhou Command of PLA, Guangzhou 510010)
【Abstract】 Objective To sutdy the growth inhibition of human gastric cancer cells by Lipofectin-mediated DNA polymerase α(DNA-pol α) antisense oligodeoxynucleotides (ASODN). Methods Oligonucleotides (ODN) including ASODN and sense ODN (SODN) targeted against the translation start site of pol α mRNA were synthesized and combined to Lipofectin (Lip) to prepare Lip+ODN complexes. After exposure to these complexes for 24 hours and continual incubation in complete medium for another 24 hours, the growth inhibition and DNA contents of MGC-803 and SGC-7901 human gastric cancer cells were studied by means of MTT assay and flow cytometry (FCM). Results 10 μg/ml of ASODN specific to pol α mediated by Lipofectin exhibited a significant effect on the DNA replication and proliferation of human gastric cancer cellos. Sense ODN (SODN) had no similar effect. Conclusions ASODN specific to pol α may be used in the gene therapy of cancer. Cationic liposome can increase the entry of ASODN into target cells and inprove the biological effect of ASODN.
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【Key words】 Oligodeoxynucleotide antisense DNA polymerase α Gastric neoplasm Lipofectin
反义寡核苷酸(ASODN)作为基因药物为癌症的特异治疗带来了希望[1]。 DNA聚合酶α(DNA-pol α) 是真核生物细胞DNA复制的关键酶，与肿瘤的发生和发展密切相关[2]。 人胃癌组织中pol α的含量增加, 酶活性增强,mRNA高表达。 因此, pol α催化亚基mRNA可作为理想靶核酸, 用以构建抗肿瘤的ASODN。但此类游离的ASODN带大量离子化基团, 亲脂性差, 靶细胞摄入困难。有研究发现:完整的培养细胞对ASODN的摄入在保温1～4 h后达到一个平台期, 其水平仅相当于外部浓度的10%。这使得投入细胞培养系中的ASODN浓度需很高(5～500 μm)才能显出有效作用。本文合成与pol α催化亚基mRNA翻译起始区互补的含18个核苷酸的ASODN, 利用阳离子脂质体Lipofectin介导ASODN快速大量进入体外培养的人胃癌细胞, 增强此ASODN的抗胃癌细胞生长作用。
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1 材料与方法
1.1 细胞系 人胃癌细胞系MGC-803和SGC-7901(第四军医大学西京医院消化中心赠) 培养于含10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液中(56℃, 1 h)。
1.2 ODN合成 与pol α催化亚基mRNA翻译起始区互补的ODN碱基顺序如下：ASODN：5′-GTGCACAGGTGCCACGGT- 3′;SODN：5′- ACCATGGCACCTGTGCAC-3′。 采用固相亚磷酰胺法在ABI381A型DNA自动合成仪上合成。
1.3 MTT法和FCM技术 参见我们的既往报告[3]。 其中细胞生长抑制率(%)=1-处理组A 560 nm/对照组A 560 nm。DNA指数(DI)=胃癌细胞G0G1期峰均道值/鸡红血球细胞G0G1期峰均道值。
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1.4 Lip+ODN复合物的制备 Lip由阳离子脂质DOTMA和中性磷脂DOPE按1∶1(m/m)比例在膜过滤水中合成, 每毫升含1 mg。分别按1 μg∶20 μl 和1 μl ∶ 10 μl的比例用去离子水稀释寡核苷酸和脂质体, 轻混二溶液, 室温下置30 min, 制成Lip+ODN复合物, 然后分别加入一定量的含10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液, 使ODN的浓度区分为2.5，5.0，10.0和20.0 μg/ml 。
1.5 Lip+ODN转染人胃癌细胞 MGC-803和SGC-7901各设Lip+ASODN、Lip+SODN 2个实验组及一个空白Lip对照组,每个实验组中ODN浓度分为2.5，5.0，10.0，20.0 mg/L，这样每种细胞有8个实验组和1个对照组, 每组设3个复孔, 共27孔。 取对数生长期人胃癌细胞,制成5×104/ml的细胞悬液, 按5 000个/孔(100 μl) 的密度接种于96孔培养板上, 24 h后吸去培养液, 加入含Lip+ODN的RPMI-1640培养液, 继续培养24 h后细胞换液。再培养24 h后分别用MTT法测定吸光度A 560 nm, FCM分析细胞DNA含量, 最后结果取3个复孔的均值。
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1.6 统计学处理 配伍组设计的多个样本计数资料秩和检验和析因分析。
2 结果
2.1 Lip+ODN对人胃癌细胞生长的抑制作用 见表1。从表1可见10 μg/L的ASODN在Lip介导下即可显著抑制SGC-7901人胃癌细胞的生长, 且10 μg/L可视为ASODN的半数抑制浓度,而游离的ASODN在同样条件下需100 μg/L才可产生相当效应[3]。SODN无明显作用， MGC-803细胞的结果类似。
表1 Lip+ODN对SGC-7 901人胃癌细胞生长抑制作用 % 组别
ODN浓度(μg/L)
2.5
5.0
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10.0
20.0
Lip+ASODN
9.2
8.4
47.8
53.9
Lip+SODN
5.1
7.6
11.8
8.3
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与Lip+SODN组比较P<0.01
2.2 Lip+ODN抑制人胃癌细胞DNA合成 见表2。表2显示与空白Lip对照组相比, 10 μg/ml的ASODN在Lip介导下可使人胃癌细胞的DI值显著降低。Lip+SON无显著作用(P>0.05)。
表2 Lip+ODN抑制人胃癌细胞DNA合成 细胞系
DI值
Lip+ASODN
Lip+SODN
Lip
SGC-7901
0.87
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1.28
1.41
MGC-803
0.89
1.34
1.37
与Lip组比较P<0.053 讨论
DNA自动合成仪研制成功后, 有关反义寡核苷酸的研究大量报道, 并成为基因治疗领域的热点。目前ASODN的靶核酸很多,我们选择的人DNA-pol α虽是正常和肿瘤细胞所共有的, 但在肿瘤细胞中表达的稳态pol α mRNA水平比正常细胞要高出40倍。根据“优先”的原则，pol α mRNA特异的ASODN“优先”抑制肿瘤细胞“优先”需要的高表达pol α mRNA,而使DNA-pol α合成减少,DNA复制受抑,胃癌细胞增殖受限。但正常细胞可以不受或极少受影响。
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ASODN的作用机理十分复杂。基因表达在mRNA的剪接、转录和翻译等各个水平都可能受到影响,目前的讨论大多限于理论方面。研究者在ASODN转染的细胞中通过直接检测RNA，DNA复合体及靶mRNA水平从而在分子水平揭示了ASODN作用的反义机制。本实验虽无分子生物学的直接证据, 但胃癌细胞中DNA合成大大减少，细胞增殖受限已足以说明问题。
对不同细胞和靶基因,靶位点的选择不尽相同。一般靶向mRNA翻译起始区的ASODN强于靶向编码区的ASODN。本研究中癌细胞DNA复制并未完全中止, 原因可能是: ①有些mRNA在体内存在时间极短, ASODN在培养系中又极易被降解,有效浓度难以维持, 且mRNA并非一条直线, 而是回折成二级结构。以上因素均可影响ASODN与靶mRNA的杂交效率; ②细胞中还存在pol α之外的DNA聚合酶参与DNA复制, 如DNA-pol β、pol γ及pol δ等;③观察时间不够长。 Tortora等[4]在人白血病细胞HL-60中每隔48 h重复加入10 μmol/L的RI α ASODN, 共培养8 d, 使HL-60细胞完全停止增埴。
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1987年Felgner等[5]首次用人工合成的阳离子脂质DOTMA构建小单层脂质体, 与DNA自发作用形成脂质-DNA复合物, 促进了DNA的细胞摄入及胞内稳定表达。后来的研究又进一步发现有中性磷脂参与构成的阳离子脂质体活性更强[6]。而Lipofectin即是由阳离子脂质DOTMA和中性磷脂DOPE合成的脂质体。其机理是阳离子脂质体通过静电引力作用与带负电荷的核酸自发形成复合物, 净电荷为正的此复合物又很容易结合到带负电荷的细胞表面, 与细胞膜融合, 通过细胞内吞作用进入胞内。因此它与传统脂质体不同, 并非将核酸包入脂质体囊内, 而是结合到表面, 只需混合即可俘获几乎100%的核酸, 而传统脂质体的核酸包裹率不到10%，与硫酸钙共沉淀法或DEAE-葡聚糖方法相比, 应用Lipofectin的核酸转染率要高出5～100倍。 1989年Stoolman[7]研究发现: DOTMA可使细胞摄入ASODN的量增加10倍以上, 而且因为显著改变了其在细胞内的分布情况使ASODN的生物活性增强了100倍。 1991年Chiang等[8]首次在哺乳动物细胞中证实阳离子脂质体可使ASODN的作用明显增强。1994年Nestle等[9]将Lipofectin与靶向细胞间粘连分子1(ICAM-1)mRNA的ASODN混合后作用于角细胞, 使ICAM-1的表达减少50%, 而无Lipofectin介导时仅减少30%。 本实验也表明人DNA-pol α mRNA特异的ASODN在Lipofectin介导下抑制人胃癌细胞增殖的作用增强了10倍。因此Lipofectin可望成为有效的运载工具, 介导ASODN进入体外培养细胞, 解决细胞摄入困难的问题。而且Lip+ODN复合物以细胞内吞方式进入胞内可避免溶酶体酶的降解, 克服ODN的不稳定性。 这为ASODN的进一步体内实验和将来过渡到临床应用打下基础。
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参考文献
1，Bonn D. Prospects for antisense therapy are looking brighter. Lancet, 1996, 347(9004):820
2，程黎阳, 高，毅, 杨继震. DNA聚合酶与肿瘤. 医学综述, 1997，3(5)：227
3，程黎阳, 高，毅, 杨继震. DNA聚合酶α反义寡核苷酸抑制人胃癌细胞生长. 新消化病杂志, 1996，4(2)：666
4，Tortora G, Pepe S, Bianco C, et al. The RI alpha subunit of protein kinase A controls serum dependency and entry into cell cycle of human mammary epithelial cells. Oncogene, 1994, 9(11):3233～3240
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5，Felgner PL, Gadek TK, Holm M, et al. Lipofection: a highly efficient lipid-mediated DNA transfection procedure. Pro Natl Acad USA, 1987, 84:7413
6，Felgner JH, Kumar R, Scidhar CN, et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J Biol Chem, 1994, 269(4):2550
7，Stoolman LM. Adhesion molecules controlling lymphocytic migration. Cell, 1989, 56:907
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8，Chiang MY Chan H, Zounes MA, et al. Antisense oligonucleotides inhibit intercellular adhesion molecule 1 expression by two distinct mechanisms. J Biol Chem, 1991, 266(27):18162
9，Nestle FO, Mitra RS, Bennet CF, et al. Cationic lipidis required for uptake and selective inhibitory activity of ICAM-1 phosphorothioate antisense oligonucleotides in keratinocytes. J Invest Dermatol, 1994, 103(4):569
(收稿日期：1999-09-20), 百拇医药