疱疹病毒经胎盘传播的研究
作者：陈阿英 左丽 舒莉萍
单位：陈阿英(贵阳医学院免疫学教研室 贵阳 550004)；左丽(贵阳医学院免疫学教研室 贵阳 550004)；舒莉萍(贵阳医学院附院妇产科)
关键词：疱疹病毒科；妊娠期；聚合酶链反应；酶联免疫吸附测定
贵阳医学院学报000103 摘要 应用PCR技术和ELISA间接法对贵阳地区286对母婴配对血清进行巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒(HSV)DNA和特异性IgM、IgG抗体检测。结果表明贵阳地区产妇CMV、HSV特异性IgG抗体阳性率分别为85.67%和80.77%；新生儿血清CMV、HSV特异性IgG抗体阳性率为82.87%和76.92%。而产妇血清CMV、HSV1，2DNA检出率分别为12.24%、9.79%和6.29%；新生儿脐血CMV、HSV1，2DNA检出率分别为7.34%，6.57%和4.20%。新生儿脐血CMV、HSV特异性IgM抗体阳性率分别为5.24%、4.55%。证实CMV、HSV确实可以经胎盘传播给胎儿。
, http://www.100md.com
中国图书馆分类法分类号 R714.52 R373
Studies on Herpesviruses Infection Through the Vertical Transmission
Chen Aying, Zuo Li, Su Liping
Department of Immunology, Guiyang Medical College
The DNA fragments and the antibodies of IgM and IgG against CMV and HSV in the serum from 286 couples of puerperas and thier newborn's umbilical cords were assayed by PCR and ELISA respectively. The DNA fragments and the specific antibodies IgM, IgG against CMV and HSV were detected. The results showed that the infectious rates of CMV and HSV in the puerperas were 85.67% and 80.77%；the positive ratas of the specific IgG against CMV and HSV in the serum from the newborm were 82.87% and 76.92%；the postive rates of the DNA of CMV and HSV1，2 in the serum from the puerperas were 12.24%，9.79% and 6.29%; in the group of newborns were 7.34%，6.57% and 4.40%，respectively. The specific antibodies IgM against CMV and HSV in the group of newborn were 5.24% and 4.55%. It suggested that the specific antibody IgG in newborn serum against CMV and HSV from the mother could not prevent the transmission of CMV and HSV through placenta.
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Key word: herpesviridae; pregnancy trimesters; polymerase chain reaction;enzyme-linked immunosorbent assay
疱疹病毒感染孕妇后，可经胎盘传播感染胎儿，造成胎儿发育异常，在证实了CMV、HSV先天性感染是造成贵阳地区新生儿畸形的重要因素后[1]，为进一步了解贵阳地区孕妇受疱疹病毒感染后经胎盘传播感染胎儿的情况，我们对贵阳市286对母婴配对血清进行CMV、HSV DNA及特异性IgM、IgG抗体检测，现报导如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源与收集 286对产妇外周血及其新生儿脐血由贵阳医学院附属医院、贵州省人民医院等医院妇产科提供。收集时间为1996.3～1998.2。产妇年龄22～36周岁，孕期36～40周。常规方法分离血清，分装，-30℃冻存备用。
, http://www.100md.com
1.2 主要试剂 Taq-DNA聚合酶，dNTP,蛋白酶K，RNA酶，BamH I限制性内切酶购于华美生物工程公司。CMV特异性IgM、IgG试剂由湖北医科大学病毒研究所提供，HSV特异性IgM、IgG试剂由本室自行制备。余为国产分析纯试剂。
1.3 毒株和菌株 HSV1(F株)、HSV2(G株)、CMV(AD169)、结核杆菌、新型隐球菌均为本室保存毒株和菌株；弓形虫(RH10)由第一军医大学陈晓光博士惠赠。
1.4 引物 扩增靶序列位于疱疹病毒科病毒DNA多聚酶基因高保守区。扩增片段HSV为518 bp，CMV为589 bp。引物委托中山医科大学遗传室合成。
1.5 病毒DNA提取 取病毒液或血清100 μl，常规SDS-蛋白酶K-酚氯仿法提取病毒DNA，并加入RNA酶至终浓度为50 mg/L，37℃ 2 h，95℃ 5 min终止反应，-30℃冻存。
, 百拇医药
1.6 PCR扩增 反应体积50 μl。1169型全自动PCR扩增仪(北京新技术应用研究所)进行PCR循环：94℃60秒，58℃60秒，72℃90秒循环30次，未次循环72℃7 min。设阳、阴性对照。
1.7 PCR产物检测 取PCR产物10 μl，置1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶0.5 mg/L)电泳，电泳缓冲液0.5×TBE，40 min。紫外透射反射仪观察结果并拍照。
1.8 PCR产物酶切鉴定 用BMHI对该引物PCR产物作酶切鉴定。酶切体积20 μl；内切酶10 μl，37℃ 2 h。取酶切产物经琼脂糖电泳分离，条件、方法同上。
1.9 病毒特异性IgM、IgG抗体检测 将血清分别作1∶300、1∶100稀释，按说明书常规间接法检测特异性IgM、IgG抗体，酶标检测仪测定OD值，以待测孔OD值/阴性对照孔≥2.1为阳性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PCR的敏感性和特异性 敏感性：提取HSV1(F株)DNA，紫外分光光度计定量。作不同稀释后进行PCR扩增，可检出10 fg的HSV1DNA。特异性：用HSV1(F株)、HSV2(G株)、CMV(AD169)、弓形虫(RH10)，结核杆菌和新型隐球菌的DNA作PCR扩增，结果仅CMV、HSV1，2有特异性扩增。其余病原体未见扩增。
2.2 PCR产物酶切鉴定 将CMV、HSV1，2PCR产物用BamH I作酶切。结果HSV2被切成225和293 bp两个片段，CMV和HSV1不被酶切，两者因相差71 bp，故经琼脂糖凝胶电泳易于区别。
2.3 血清病毒DNA检测 286对母婴配对血清病毒DNA检测结果：母血CMV阳性35例(12.24%)，HSV1阳性28例(9.79%)，HSV2阳性18例(6.29%)；脐血CMV阳性21例(7.34%)，HSV1阳性21例(6.57%)，HSV2阳性12例(4.20%)。
, 百拇医药
2.4 血清中病毒特异性抗体的检测 常规ELISA间接法检测血清中CMV、HSV特异性IgM、IgG抗体，结果见表1。
表1 母婴配对血清CMV、HSV特异性抗体的检测
Tab.1 The results of the specific antibodies against CMV，HSV
in the serum from the puerperas and the umbilical cord 总例数
CMV
HSV
IgM
IgG
, 百拇医药 IgM
IgG
阳性数(%)
阳性数(%)
阳性数(%)
阳性数(%)
母血286
29(10.14)
245(85.67)
35(12.24)
231(80.77)
脐血286
, 百拇医药
15(5.24)
237(82.87)
13(4.55)
220(76.92)
3 讨论 妊娠期疱疹病毒感染是造成胎儿发育障碍的重要因素[2]。人群中CMV和HSV感染广泛，60%～90%成人血清中可查到CMV和HSV特异性IgG抗体。本研究结果表明贵阳地区孕妇CMV、HSV特异性IgG阳性率分别为85.67%和80.77%；IgG抗体可通过胎盘进入胎儿体内，新生儿脐血中CMV、HSV IgG抗体阳性率亦可分别达82.87%和76.92%。由于妊娠期母体对病毒原发感染和潜伏感染激活的易感性增加，而易受疱疹病毒感染。胎儿免疫系统未发育成熟，感染后易造成持续感染[3]；HSV感染新生儿的主要方式是经阴道分娩时接触病毒而致，经胎盘发生先天性HSV感染比例很小。近年有报道，经胎盘所致HSV先天性HSV感染明显增多[4]。CMV、HSV感染胎儿后，主要可侵袭心血管、中枢神经系统等，引起胎儿发育异常。
, 百拇医药
本研究应用PCR和ELISA技术对贵阳地区286对母婴配对血清进行CMV、HSV DNA和特异性IgM、IgG抗体检测。其中CMV?DNA检出率分别为12.24%和7.34%；HSV1?DNA检出率分别为9.79%和6.57%；HSV2?DNA检出率分别为6.29%和4.20%。而母婴配对血清CMV特异性IgM抗体阳性率为10.14%和5.24%，HSV?IgM抗体阳性率分别为12.24%和4.55%。2种检测相比，虽无明显差异(P>0.05)，但DNA检测阳性率较IgM阳性率绝对值高，说明血清中检出病毒DNA可反映机体受到病毒的感染。本研究中的286对母婴，9例出现新生儿异常，其中畸形2例，新生儿窒息3例，低体重儿4例，占总数的3.15%，且都是脐血CMV或HSV?DNA或IgM抗体阳性者。本研究再次为CMV、HSV可经胎盘感染胎儿提供了确切的证据。
参考文献
1，左 丽，卓礼梅，董熙昌，等.疱疹病毒与人微小病毒B19与胎儿畸形相关性的研究.中华医学杂志，1996，76(9)：706～707
, 百拇医药
2，Gehrz RC, Christianson WR, Linner KM,et al. Cgtomegelovirus-specific humoral and cellular immune response in human pregnancy. J Infect Dis, 1981,143(3):391
3，Jam MD, Bernary MD. Teratogenic viral infections. Clin obstetrics and Gynecology, 1990,33(2):242
4，Freij BJ, Sever JL. Herpes virus infection in pregnancy risks to embryo, fetus and neonate. Clin Perinatol, 1997,24:203
(1999—11—02收稿), 百拇医药
单位：陈阿英(贵阳医学院免疫学教研室 贵阳 550004)；左丽(贵阳医学院免疫学教研室 贵阳 550004)；舒莉萍(贵阳医学院附院妇产科)
关键词：疱疹病毒科；妊娠期；聚合酶链反应；酶联免疫吸附测定
贵阳医学院学报000103 摘要 应用PCR技术和ELISA间接法对贵阳地区286对母婴配对血清进行巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒(HSV)DNA和特异性IgM、IgG抗体检测。结果表明贵阳地区产妇CMV、HSV特异性IgG抗体阳性率分别为85.67%和80.77%；新生儿血清CMV、HSV特异性IgG抗体阳性率为82.87%和76.92%。而产妇血清CMV、HSV1，2DNA检出率分别为12.24%、9.79%和6.29%；新生儿脐血CMV、HSV1，2DNA检出率分别为7.34%，6.57%和4.20%。新生儿脐血CMV、HSV特异性IgM抗体阳性率分别为5.24%、4.55%。证实CMV、HSV确实可以经胎盘传播给胎儿。
, http://www.100md.com
中国图书馆分类法分类号 R714.52 R373
Studies on Herpesviruses Infection Through the Vertical Transmission
Chen Aying, Zuo Li, Su Liping
Department of Immunology, Guiyang Medical College
The DNA fragments and the antibodies of IgM and IgG against CMV and HSV in the serum from 286 couples of puerperas and thier newborn's umbilical cords were assayed by PCR and ELISA respectively. The DNA fragments and the specific antibodies IgM, IgG against CMV and HSV were detected. The results showed that the infectious rates of CMV and HSV in the puerperas were 85.67% and 80.77%；the positive ratas of the specific IgG against CMV and HSV in the serum from the newborm were 82.87% and 76.92%；the postive rates of the DNA of CMV and HSV1，2 in the serum from the puerperas were 12.24%，9.79% and 6.29%; in the group of newborns were 7.34%，6.57% and 4.40%，respectively. The specific antibodies IgM against CMV and HSV in the group of newborn were 5.24% and 4.55%. It suggested that the specific antibody IgG in newborn serum against CMV and HSV from the mother could not prevent the transmission of CMV and HSV through placenta.
, http://www.100md.com
Key word: herpesviridae; pregnancy trimesters; polymerase chain reaction;enzyme-linked immunosorbent assay
疱疹病毒感染孕妇后，可经胎盘传播感染胎儿，造成胎儿发育异常，在证实了CMV、HSV先天性感染是造成贵阳地区新生儿畸形的重要因素后[1]，为进一步了解贵阳地区孕妇受疱疹病毒感染后经胎盘传播感染胎儿的情况，我们对贵阳市286对母婴配对血清进行CMV、HSV DNA及特异性IgM、IgG抗体检测，现报导如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源与收集 286对产妇外周血及其新生儿脐血由贵阳医学院附属医院、贵州省人民医院等医院妇产科提供。收集时间为1996.3～1998.2。产妇年龄22～36周岁，孕期36～40周。常规方法分离血清，分装，-30℃冻存备用。
, http://www.100md.com
1.2 主要试剂 Taq-DNA聚合酶，dNTP,蛋白酶K，RNA酶，BamH I限制性内切酶购于华美生物工程公司。CMV特异性IgM、IgG试剂由湖北医科大学病毒研究所提供，HSV特异性IgM、IgG试剂由本室自行制备。余为国产分析纯试剂。
1.3 毒株和菌株 HSV1(F株)、HSV2(G株)、CMV(AD169)、结核杆菌、新型隐球菌均为本室保存毒株和菌株；弓形虫(RH10)由第一军医大学陈晓光博士惠赠。
1.4 引物 扩增靶序列位于疱疹病毒科病毒DNA多聚酶基因高保守区。扩增片段HSV为518 bp，CMV为589 bp。引物委托中山医科大学遗传室合成。
1.5 病毒DNA提取 取病毒液或血清100 μl，常规SDS-蛋白酶K-酚氯仿法提取病毒DNA，并加入RNA酶至终浓度为50 mg/L，37℃ 2 h，95℃ 5 min终止反应，-30℃冻存。
, 百拇医药
1.6 PCR扩增 反应体积50 μl。1169型全自动PCR扩增仪(北京新技术应用研究所)进行PCR循环：94℃60秒，58℃60秒，72℃90秒循环30次，未次循环72℃7 min。设阳、阴性对照。
1.7 PCR产物检测 取PCR产物10 μl，置1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶0.5 mg/L)电泳，电泳缓冲液0.5×TBE，40 min。紫外透射反射仪观察结果并拍照。
1.8 PCR产物酶切鉴定 用BMHI对该引物PCR产物作酶切鉴定。酶切体积20 μl；内切酶10 μl，37℃ 2 h。取酶切产物经琼脂糖电泳分离，条件、方法同上。
1.9 病毒特异性IgM、IgG抗体检测 将血清分别作1∶300、1∶100稀释，按说明书常规间接法检测特异性IgM、IgG抗体，酶标检测仪测定OD值，以待测孔OD值/阴性对照孔≥2.1为阳性。
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2 结果
2.1 PCR的敏感性和特异性 敏感性：提取HSV1(F株)DNA，紫外分光光度计定量。作不同稀释后进行PCR扩增，可检出10 fg的HSV1DNA。特异性：用HSV1(F株)、HSV2(G株)、CMV(AD169)、弓形虫(RH10)，结核杆菌和新型隐球菌的DNA作PCR扩增，结果仅CMV、HSV1，2有特异性扩增。其余病原体未见扩增。
2.2 PCR产物酶切鉴定 将CMV、HSV1，2PCR产物用BamH I作酶切。结果HSV2被切成225和293 bp两个片段，CMV和HSV1不被酶切，两者因相差71 bp，故经琼脂糖凝胶电泳易于区别。
2.3 血清病毒DNA检测 286对母婴配对血清病毒DNA检测结果：母血CMV阳性35例(12.24%)，HSV1阳性28例(9.79%)，HSV2阳性18例(6.29%)；脐血CMV阳性21例(7.34%)，HSV1阳性21例(6.57%)，HSV2阳性12例(4.20%)。
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2.4 血清中病毒特异性抗体的检测 常规ELISA间接法检测血清中CMV、HSV特异性IgM、IgG抗体，结果见表1。
表1 母婴配对血清CMV、HSV特异性抗体的检测
Tab.1 The results of the specific antibodies against CMV，HSV
in the serum from the puerperas and the umbilical cord 总例数
CMV
HSV
IgM
IgG
, 百拇医药 IgM
IgG
阳性数(%)
阳性数(%)
阳性数(%)
阳性数(%)
母血286
29(10.14)
245(85.67)
35(12.24)
231(80.77)
脐血286
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15(5.24)
237(82.87)
13(4.55)
220(76.92)
3 讨论 妊娠期疱疹病毒感染是造成胎儿发育障碍的重要因素[2]。人群中CMV和HSV感染广泛，60%～90%成人血清中可查到CMV和HSV特异性IgG抗体。本研究结果表明贵阳地区孕妇CMV、HSV特异性IgG阳性率分别为85.67%和80.77%；IgG抗体可通过胎盘进入胎儿体内，新生儿脐血中CMV、HSV IgG抗体阳性率亦可分别达82.87%和76.92%。由于妊娠期母体对病毒原发感染和潜伏感染激活的易感性增加，而易受疱疹病毒感染。胎儿免疫系统未发育成熟，感染后易造成持续感染[3]；HSV感染新生儿的主要方式是经阴道分娩时接触病毒而致，经胎盘发生先天性HSV感染比例很小。近年有报道，经胎盘所致HSV先天性HSV感染明显增多[4]。CMV、HSV感染胎儿后，主要可侵袭心血管、中枢神经系统等，引起胎儿发育异常。
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本研究应用PCR和ELISA技术对贵阳地区286对母婴配对血清进行CMV、HSV DNA和特异性IgM、IgG抗体检测。其中CMV?DNA检出率分别为12.24%和7.34%；HSV1?DNA检出率分别为9.79%和6.57%；HSV2?DNA检出率分别为6.29%和4.20%。而母婴配对血清CMV特异性IgM抗体阳性率为10.14%和5.24%，HSV?IgM抗体阳性率分别为12.24%和4.55%。2种检测相比，虽无明显差异(P>0.05)，但DNA检测阳性率较IgM阳性率绝对值高，说明血清中检出病毒DNA可反映机体受到病毒的感染。本研究中的286对母婴，9例出现新生儿异常，其中畸形2例，新生儿窒息3例，低体重儿4例，占总数的3.15%，且都是脐血CMV或HSV?DNA或IgM抗体阳性者。本研究再次为CMV、HSV可经胎盘感染胎儿提供了确切的证据。
参考文献
1，左 丽，卓礼梅，董熙昌，等.疱疹病毒与人微小病毒B19与胎儿畸形相关性的研究.中华医学杂志，1996，76(9)：706～707
, 百拇医药
2，Gehrz RC, Christianson WR, Linner KM,et al. Cgtomegelovirus-specific humoral and cellular immune response in human pregnancy. J Infect Dis, 1981,143(3):391
3，Jam MD, Bernary MD. Teratogenic viral infections. Clin obstetrics and Gynecology, 1990,33(2):242
4，Freij BJ, Sever JL. Herpes virus infection in pregnancy risks to embryo, fetus and neonate. Clin Perinatol, 1997,24:203
(1999—11—02收稿), 百拇医药