深低温保存对猪二尖瓣内皮细胞活性的影响*
作者：高光强 任兵 朱晓东 胡盛寿 谢宁
单位：任兵(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院 心脏瓣膜研究室)；朱晓东(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院 心脏瓣膜研究室)； 胡盛寿(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院 心脏瓣膜研究室)
关键词：低温保存 内皮细胞 细胞活性
中国循环杂志000129 摘 要：目的：研究深低温保存猪二尖瓣内皮细胞结构和功能变化。
方法：分别取新鲜(新鲜瓣膜组)、4℃抗生素灭菌24小时(4℃灭菌24小时组)以及深低温保存(深低温保存组)1月猪二尖瓣各8枚，取各自前叶组织10 mm×10 mm，M199液中孵育24小时。放射免疫方法测定培养液6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α) 浓度。电镜观察深低温保存二尖瓣组织超微结构。
, 百拇医药
结果：新鲜瓣膜组、4℃灭菌24小时组以及深低温保存组猪二尖瓣内皮细胞释放6-keto-PGF1α分别为每平方厘米121.5±16.2 ng/ml，66.0±9.5 ng/ml和67.3±6.7 ng/ml。新鲜瓣膜组明显高于4℃灭菌24小时组和深低温保存组。后两组间无差别。电镜观察到，深低温保存二尖瓣内皮细胞与其下的纤维层连接紧密，结构完整，无损伤性改变。除了胞质中脂褐素类物质较新鲜瓣膜内皮细胞内略增多外，与新鲜瓣膜内皮细胞无差异。
结论：深低温保存瓣膜的内皮细胞结构尚属正常时，其功能已经发生损害。深低温保存对内皮细胞的损伤主要发生在4℃抗生素灭菌过程。优化抗生素组合，缩短4℃灭菌时间，将减轻抗生素灭菌过程对内皮细胞的损伤。
分类号：R31808 文献标识码：A
文章编号：1000—3614(2000)01—0051—0
, http://www.100md.com
Effects of Cryopreservation on Endothelial Viability of Porcine Mitral Valves
Gao Guangqiang,Ren Bing,Zhu Xiaodong, et al.
Laboratory of Heart Valve Prosthesis, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMS, Beijing(100037)
Abstract：Objective：To investigate endothelial cell viability of cryopreserved porcine mitral valves.
Methods：One-month cryopreserved porcine mitral leaflets(n=8) were incubated in M199 at 37℃ and 5% CO2 for 24 hours.6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α) release was measured in the incubation medium by means of radioimmunoassay. 6-keto-PGF1α releases of fresh porcine valves and valves antibiotically sterilized at 4℃ for 24 hours were also determined. Electron microscopic studies of cryopreserved porcine valves were conducted.
, http://www.100md.com
Results：Observations in the transmission electron microscopy included intact and morphologically unaltered endothelial cells.No irreversible injury was observed. The 6-keto-PGF1α production level of cryopreserved valves,compared to that of fresh porcine mitral leaflets,declined(one square centimeter 121.5±16.2 ng/ml and 67.3±6.7 ng/ml,respectively,P=0.012).There is no difference between the 6-keto-PGF1α production level of cryopreserved valves and that of leaflets disinfected in 4℃ antibiotic solution for 24 hours.
, 百拇医药
Conclusion：These results indicated that the morphological alteration of cryopreserved leaflets was preceded by their cell malfunction and that the major injury to the cryopreserved valve mainly occurred in the course of 4℃ antibiotic disinfection.
Key words Cryopreservation;Endothelial cell;Cell viability
(Chinese Circulation Journal,2000,15∶51.)▲
位于同种瓣膜表面的内皮细胞构成了瓣膜的屏障，具有防止血栓形成，提供成纤维细胞营养物质，刺激胶原生成和防止脂质沉着、钙化等作用[1]。本实验采用放射免疫方法测定前列环素(PGI2)的代谢产物6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)，了解深低温保存猪二尖瓣内皮细胞活性。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
瓣膜采集：实验时间自1996年5月至10月。将8头猪心脏的完整二尖瓣结构放入含抗生素M199液中(青霉素100 μg/ml，链霉素100 μg/ml，二性霉素B5 μg/ml，庆大霉素400 μg/ml，先锋霉素240 μg/ml)，4℃灭菌24小时，-85℃保存12小时后转移到液氮中冷冻保存(-196℃)。取深低温保存1月猪二尖瓣8枚(深低温保存组)，40℃生理盐水解冻。取相同部位的二尖瓣前叶10 mm×10 mm，放入含3 ml M199液的试管内，5%CO2 37℃孵育24小时，取出瓣叶加入0.1%消炎痛—依地酸二钠(EDTA Na2)溶液0.5 ml中止PGI2释放。培养液离心(800 r/min)，取上清液测6-keto-PGF1α。取新鲜猪瓣膜8枚(新鲜瓣膜组)和4℃灭菌24小时猪瓣膜8枚(4℃灭菌24小时组)，按同样方法测定6-keto-PGF1α。6-keto-PGF1α放射免疫法测定：取1 600 pg/ml 6-keto-PGF1α标准品200 μl，用0.05 mol/L PBS缓冲液(pH7.4)对半稀释成为1 600、800、400、200、100、50、25 pg/ml，取0.05 mol/L PBS缓冲液200 μl作为空白对照。各试管中加100 μl抗6-keto-PGF1α的兔抗体，混匀，4℃过夜后各加入100 μl125Ⅰ-6-keto-PGF1α混匀，4℃过夜，再加入1 ml驴抗兔抗体免疫分离剂，混匀，37℃置15分钟，离心15分钟(3 500 r/min),弃上清液，测定各管沉淀(125Ⅰ-6-keto-PGF1α与抗6-keto-PGF1α结合复合物)每分钟计数。以空白管每分钟计数为Bo，各标准管每分钟计数为Bi，求各标准管结合百分率(Bi/Bo)。以标准管Bi/Bo为纵坐标，标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线。同时取未知样品200 μl，以同样方法测定计算各样品Bi/Bo，并从标准曲线上查出样品6-keto-PGF1α浓度。
, 百拇医药
透射电镜检查：分别取新鲜和深低温保存1月猪二尖瓣前叶，经固定染色，透射电镜下观察比较新鲜和冷冻瓣膜超微结构分析。
统计学处理：各组间进行计量资料t检验统计分析。
2 结果
内皮细胞分泌：新鲜瓣膜组、4℃灭菌24小时组以及深低温保存组猪二尖瓣内皮细胞分泌PGI2水平，以测定6-keto-PGF1α的量表示，分别为每平方厘米121.5±16.2 ng/ml，66.0±9.5 ng/ml和67.3±6.7 ng/ml。新鲜瓣膜组内皮细胞分泌PGI2水平明显高于4℃灭菌24小时组和深低温保存组(P=0.013，P=0.012)。后两组的PGI2分泌水平无差别。
电镜观察结果：透射电镜观察到，深低温保存猪二尖瓣内皮细胞与其下的纤维层连接紧密，无损伤性改变。内皮细胞结构完整，除了胞质中脂褐素类物质较新鲜瓣膜内皮细胞内略增多外，与新鲜瓣膜内皮细胞无差异。纤维层结构致密，成纤维细胞完整，细胞核无固缩，胞浆内有丰富的内质网和线粒体，线粒体无明显肿胀。
, 百拇医药
3 讨论
许多学者认为保持瓣膜细胞活性将提高同种瓣膜的耐久性。内皮细胞位于瓣膜表面，直接与血液接触，构成瓣膜保护屏障。内皮细胞可产生防止血小板凝集的物质PGI2。6-keto-PGF1α是PGI2的代谢产物，通过测定6-keto-PGF1α可间接反映内皮细胞释放PGI2的功能。实验发现，深低温保存1月的二尖瓣内皮细胞分泌PGI2功能较新鲜瓣膜下降，而此时细胞结构尚未发生明显损伤性改变，提示细胞功能变化先于结构变化，在细胞结构尚接近正常时，细胞功能已严重下降。从本实验中可以看出，深低温保存1月瓣膜与单纯4℃灭菌24小时的瓣膜相比，其内皮细胞分泌PGI2功能无差别。提示深低温保存对内皮细胞损伤主要发生在4℃抗生素灭菌过程。此过程造成内皮细胞损伤的因素有二：一是4℃不足以对内皮细胞起到很好的保护作用。Feng等[2]报道4℃保存猪主动脉瓣2周后内皮细胞发生变形，细胞间隙增大等病理改变，3周后内皮细胞大部分脱落，胶原纤维裸露；4℃保存4天后内皮细胞分泌PGI2功能严重下降，2周后已测不出PGI2，深低温冷冻保存者1年后仍能够分泌PGI2。Fischlein等[3]测定深低温保存人主动脉瓣内皮细胞分泌PGI2的功能，发现冷冻前4℃保存超过24小时者远比24小时以内者分泌功能下降。另一个对内皮细胞损伤的因素是抗生素对内皮细胞的毒性作用，尤其是二性霉素的毒性作用[4]。Feng等[5]报道5 μg/ml二性霉素B起到足够的灭菌效果而不至于损伤内皮细胞。因此，尽量在无菌条件下取材，优化抗生素组合，缩短4℃灭菌时间，将减轻抗生素灭菌过程对内皮细胞的损伤。
, 百拇医药
基金项目：*本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助
作者简介：高光强(1965—) 男 主治医师 博士研究生 主要从事心脏瓣膜研究
谢宁(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院 心脏瓣膜研究室)
高光强(现在中国人民解放军第二军医大学 长征医院 胸心外科(200003))
参考文献：
[1] Villanueva AG,Farber HW,Rounds S,et al.Stimulation of fibroblast collagen and total protein formation by endothelial cellderived factor. Circ Res,1991,69∶134—141.
, http://www.100md.com
[2] Feng XJ,Van Hove CEJ, Walter PJ,et al.Effects of Storage temperature and fetal calf serum on the endothelium of porcine aortic valves.J Thorac Cardiovasc Surg,1996,111∶21—30.
[3] Fischlein T,Schutz A,Haushofer M,et al.Immunologic reaction and viaility of cryopreserved homografts.Ann Thorac Surg,1995,60∶S122—126.
[4] Brockbank KM, Dawson PE.Cytotoxicity of amphotericin B for fibroblasts in human heart valve leaflets. Cryobiology,1993,30∶19—24.
[5] Feng XJ,Van Hove CEJ,Mohan R,et al.Effects of different antibiotics on the endothelium of the porcine aortic valve.J Heart Valve Dis,1993,2∶694—704.
收稿：1999-06-04
修回：1999-08-04, http://www.100md.com
单位：任兵(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院 心脏瓣膜研究室)；朱晓东(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院 心脏瓣膜研究室)； 胡盛寿(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院 心脏瓣膜研究室)
关键词：低温保存 内皮细胞 细胞活性
中国循环杂志000129 摘 要：目的：研究深低温保存猪二尖瓣内皮细胞结构和功能变化。
方法：分别取新鲜(新鲜瓣膜组)、4℃抗生素灭菌24小时(4℃灭菌24小时组)以及深低温保存(深低温保存组)1月猪二尖瓣各8枚，取各自前叶组织10 mm×10 mm，M199液中孵育24小时。放射免疫方法测定培养液6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α) 浓度。电镜观察深低温保存二尖瓣组织超微结构。
, 百拇医药
结果：新鲜瓣膜组、4℃灭菌24小时组以及深低温保存组猪二尖瓣内皮细胞释放6-keto-PGF1α分别为每平方厘米121.5±16.2 ng/ml，66.0±9.5 ng/ml和67.3±6.7 ng/ml。新鲜瓣膜组明显高于4℃灭菌24小时组和深低温保存组。后两组间无差别。电镜观察到，深低温保存二尖瓣内皮细胞与其下的纤维层连接紧密，结构完整，无损伤性改变。除了胞质中脂褐素类物质较新鲜瓣膜内皮细胞内略增多外，与新鲜瓣膜内皮细胞无差异。
结论：深低温保存瓣膜的内皮细胞结构尚属正常时，其功能已经发生损害。深低温保存对内皮细胞的损伤主要发生在4℃抗生素灭菌过程。优化抗生素组合，缩短4℃灭菌时间，将减轻抗生素灭菌过程对内皮细胞的损伤。
分类号：R31808 文献标识码：A
文章编号：1000—3614(2000)01—0051—0
, http://www.100md.com
Effects of Cryopreservation on Endothelial Viability of Porcine Mitral Valves
Gao Guangqiang,Ren Bing,Zhu Xiaodong, et al.
Laboratory of Heart Valve Prosthesis, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMS, Beijing(100037)
Abstract：Objective：To investigate endothelial cell viability of cryopreserved porcine mitral valves.
Methods：One-month cryopreserved porcine mitral leaflets(n=8) were incubated in M199 at 37℃ and 5% CO2 for 24 hours.6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α) release was measured in the incubation medium by means of radioimmunoassay. 6-keto-PGF1α releases of fresh porcine valves and valves antibiotically sterilized at 4℃ for 24 hours were also determined. Electron microscopic studies of cryopreserved porcine valves were conducted.
, http://www.100md.com
Results：Observations in the transmission electron microscopy included intact and morphologically unaltered endothelial cells.No irreversible injury was observed. The 6-keto-PGF1α production level of cryopreserved valves,compared to that of fresh porcine mitral leaflets,declined(one square centimeter 121.5±16.2 ng/ml and 67.3±6.7 ng/ml,respectively,P=0.012).There is no difference between the 6-keto-PGF1α production level of cryopreserved valves and that of leaflets disinfected in 4℃ antibiotic solution for 24 hours.
, 百拇医药
Conclusion：These results indicated that the morphological alteration of cryopreserved leaflets was preceded by their cell malfunction and that the major injury to the cryopreserved valve mainly occurred in the course of 4℃ antibiotic disinfection.
Key words Cryopreservation;Endothelial cell;Cell viability
(Chinese Circulation Journal,2000,15∶51.)▲
位于同种瓣膜表面的内皮细胞构成了瓣膜的屏障，具有防止血栓形成，提供成纤维细胞营养物质，刺激胶原生成和防止脂质沉着、钙化等作用[1]。本实验采用放射免疫方法测定前列环素(PGI2)的代谢产物6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)，了解深低温保存猪二尖瓣内皮细胞活性。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
瓣膜采集：实验时间自1996年5月至10月。将8头猪心脏的完整二尖瓣结构放入含抗生素M199液中(青霉素100 μg/ml，链霉素100 μg/ml，二性霉素B5 μg/ml，庆大霉素400 μg/ml，先锋霉素240 μg/ml)，4℃灭菌24小时，-85℃保存12小时后转移到液氮中冷冻保存(-196℃)。取深低温保存1月猪二尖瓣8枚(深低温保存组)，40℃生理盐水解冻。取相同部位的二尖瓣前叶10 mm×10 mm，放入含3 ml M199液的试管内，5%CO2 37℃孵育24小时，取出瓣叶加入0.1%消炎痛—依地酸二钠(EDTA Na2)溶液0.5 ml中止PGI2释放。培养液离心(800 r/min)，取上清液测6-keto-PGF1α。取新鲜猪瓣膜8枚(新鲜瓣膜组)和4℃灭菌24小时猪瓣膜8枚(4℃灭菌24小时组)，按同样方法测定6-keto-PGF1α。6-keto-PGF1α放射免疫法测定：取1 600 pg/ml 6-keto-PGF1α标准品200 μl，用0.05 mol/L PBS缓冲液(pH7.4)对半稀释成为1 600、800、400、200、100、50、25 pg/ml，取0.05 mol/L PBS缓冲液200 μl作为空白对照。各试管中加100 μl抗6-keto-PGF1α的兔抗体，混匀，4℃过夜后各加入100 μl125Ⅰ-6-keto-PGF1α混匀，4℃过夜，再加入1 ml驴抗兔抗体免疫分离剂，混匀，37℃置15分钟，离心15分钟(3 500 r/min),弃上清液，测定各管沉淀(125Ⅰ-6-keto-PGF1α与抗6-keto-PGF1α结合复合物)每分钟计数。以空白管每分钟计数为Bo，各标准管每分钟计数为Bi，求各标准管结合百分率(Bi/Bo)。以标准管Bi/Bo为纵坐标，标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线。同时取未知样品200 μl，以同样方法测定计算各样品Bi/Bo，并从标准曲线上查出样品6-keto-PGF1α浓度。
, 百拇医药
透射电镜检查：分别取新鲜和深低温保存1月猪二尖瓣前叶，经固定染色，透射电镜下观察比较新鲜和冷冻瓣膜超微结构分析。
统计学处理：各组间进行计量资料t检验统计分析。
2 结果
内皮细胞分泌：新鲜瓣膜组、4℃灭菌24小时组以及深低温保存组猪二尖瓣内皮细胞分泌PGI2水平，以测定6-keto-PGF1α的量表示，分别为每平方厘米121.5±16.2 ng/ml，66.0±9.5 ng/ml和67.3±6.7 ng/ml。新鲜瓣膜组内皮细胞分泌PGI2水平明显高于4℃灭菌24小时组和深低温保存组(P=0.013，P=0.012)。后两组的PGI2分泌水平无差别。
电镜观察结果：透射电镜观察到，深低温保存猪二尖瓣内皮细胞与其下的纤维层连接紧密，无损伤性改变。内皮细胞结构完整，除了胞质中脂褐素类物质较新鲜瓣膜内皮细胞内略增多外，与新鲜瓣膜内皮细胞无差异。纤维层结构致密，成纤维细胞完整，细胞核无固缩，胞浆内有丰富的内质网和线粒体，线粒体无明显肿胀。
, 百拇医药
3 讨论
许多学者认为保持瓣膜细胞活性将提高同种瓣膜的耐久性。内皮细胞位于瓣膜表面，直接与血液接触，构成瓣膜保护屏障。内皮细胞可产生防止血小板凝集的物质PGI2。6-keto-PGF1α是PGI2的代谢产物，通过测定6-keto-PGF1α可间接反映内皮细胞释放PGI2的功能。实验发现，深低温保存1月的二尖瓣内皮细胞分泌PGI2功能较新鲜瓣膜下降，而此时细胞结构尚未发生明显损伤性改变，提示细胞功能变化先于结构变化，在细胞结构尚接近正常时，细胞功能已严重下降。从本实验中可以看出，深低温保存1月瓣膜与单纯4℃灭菌24小时的瓣膜相比，其内皮细胞分泌PGI2功能无差别。提示深低温保存对内皮细胞损伤主要发生在4℃抗生素灭菌过程。此过程造成内皮细胞损伤的因素有二：一是4℃不足以对内皮细胞起到很好的保护作用。Feng等[2]报道4℃保存猪主动脉瓣2周后内皮细胞发生变形，细胞间隙增大等病理改变，3周后内皮细胞大部分脱落，胶原纤维裸露；4℃保存4天后内皮细胞分泌PGI2功能严重下降，2周后已测不出PGI2，深低温冷冻保存者1年后仍能够分泌PGI2。Fischlein等[3]测定深低温保存人主动脉瓣内皮细胞分泌PGI2的功能，发现冷冻前4℃保存超过24小时者远比24小时以内者分泌功能下降。另一个对内皮细胞损伤的因素是抗生素对内皮细胞的毒性作用，尤其是二性霉素的毒性作用[4]。Feng等[5]报道5 μg/ml二性霉素B起到足够的灭菌效果而不至于损伤内皮细胞。因此，尽量在无菌条件下取材，优化抗生素组合，缩短4℃灭菌时间，将减轻抗生素灭菌过程对内皮细胞的损伤。
, 百拇医药
基金项目：*本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助
作者简介：高光强(1965—) 男 主治医师 博士研究生 主要从事心脏瓣膜研究
谢宁(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院 心脏瓣膜研究室)
高光强(现在中国人民解放军第二军医大学 长征医院 胸心外科(200003))
参考文献：
[1] Villanueva AG,Farber HW,Rounds S,et al.Stimulation of fibroblast collagen and total protein formation by endothelial cellderived factor. Circ Res,1991,69∶134—141.
, http://www.100md.com
[2] Feng XJ,Van Hove CEJ, Walter PJ,et al.Effects of Storage temperature and fetal calf serum on the endothelium of porcine aortic valves.J Thorac Cardiovasc Surg,1996,111∶21—30.
[3] Fischlein T,Schutz A,Haushofer M,et al.Immunologic reaction and viaility of cryopreserved homografts.Ann Thorac Surg,1995,60∶S122—126.
[4] Brockbank KM, Dawson PE.Cytotoxicity of amphotericin B for fibroblasts in human heart valve leaflets. Cryobiology,1993,30∶19—24.
[5] Feng XJ,Van Hove CEJ,Mohan R,et al.Effects of different antibiotics on the endothelium of the porcine aortic valve.J Heart Valve Dis,1993,2∶694—704.
收稿：1999-06-04
修回：1999-08-04, http://www.100md.com