体外转染野生型p16基因对兔血管平滑肌细胞生长的抑制作用
作者：张亚文 张国元 黄长晖
单位：张亚文(200003 上海市，上海长征医院 心内科)；张国元(200003 上海市，上海长征医院 心内科)；黄长晖(中国人民解放军第二军医大学 分子遗传学开放实验室)
关键词：p16基因 逆转录病毒载体 血管平滑肌细胞
中国循环杂志000128 摘 要：目的：研究体外转染外源性野生型p16基因对兔血管平滑肌细胞生长的影响。
方法：构建野生型p16基因的重组逆转录病毒载体，并体外转染兔血管平滑肌细胞，应用Northern blot及Western blot检测外源p16基因的表达，并用四唑盐(MTT)法及流式细胞仪检测其对细胞生长的抑制作用。
结果：逆转录病毒载体可有效地将外源性p16基因导入平滑肌细胞，表达P16蛋白，并显著抑制血管平滑肌细胞的生长使细胞滞留于G1期。
, 百拇医药
结论：体外转染外源性野生型p16基因可有效抑制血管平滑肌细胞的生长。
分类号：329.2+8 文献标识码：A
文章编号：1000—3614(2000) 01—0048—03
Inhibitory Effect of Transfer of Exogenous p16 Gene on the Growth of
Cultured Vascular Smooth Muscle Cells
Zhang Yawen, Zhang Guoyuan, Huang Changhui.
Department of Cardiology, Changzheng Hospital,Shanghai(200003)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To investigate the effect of transfer of exogenous wide-type p16 gene on the growth of cultured vascular smooth muscle cells.
Methods：A replication-defective retroviral vector encoding a wild-type p16 gene was constructed and transferred into cultured smooth muscle cells.The expression of p16 gene was detected by Northern and Western blot and the effect of its product on cell arrest was determined by Methyl thiazolyl tetrazolium MTT assay and flow cytometry.
, 百拇医药
Results：The exogenous p16 gene could be effectively transferred into cultured primary rabbit aortic smooth muscle cells by retroviral vector and P16 protein was expressed. It could also markedly inhibit vascular smooth muscle cells proliferation and the cells were held up in G1 phase.
Conclusion：Transfer of exogenous wide-type tumor-inhibiting gene p16 could inhibit the fact that the growth of vascular smooth muscle cells which demonstrates the role of p16 in regulating the proliferation of vascular smooth muscle cells.
, 百拇医药
Key words：p16 gene; Retroviral vector; Vascular smooth muscle cells
(Chinese Circulation Journal,2000,15∶48.)▲
动脉受损时可使正常情况下静止的中层血管平滑肌细胞(VSMCs)增生并迁移至内膜合成细胞外基质，这是导致动脉粥样硬化及再狭窄形成的重要原因〔1〕，因此抑制平滑肌细胞生长是治疗动脉粥样硬化及再狭窄的重要目标之一。野生型p16基因是一种抑癌基因，其表达的P16蛋白作为细胞周期抑制蛋白可通过抑制细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的活性来调节细胞周期，阻止细胞由G1期进入S期，抑制其生长〔2〕。本实验应用野生型p16基因重组逆转录病毒载体体外转染兔血管平滑肌细胞，观察野生型P16蛋白对血管平滑肌细胞生长的抑制作用，为临床对动脉粥样硬化及再狭窄的基因治疗探索新的途径和实验基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
复制—缺陷型野生型p16基因的重组逆转录病毒载体的构建：将0.5 kb的野生型p16基因互补脱氧核糖核酸(cDNA)插入到逆转录病毒载体pLXSN(第二军医大学分子遗传学开放实验室黄长晖博士提供)的BamHI和EcoRI位点上。重组载体含LTR启动子、neo基因及野生型p16基因，命名为Lg4，以磷酸钙共沉淀法转染PA317细胞(中科院细胞所)，G418(美国Sigma公司)筛选阳性克隆后扩增获取Lg4重组病毒。同样方法用空载体pLXSN转染PA317细胞获得空病毒作为对照，Hela细胞检测病毒滴度。
血管平滑肌细胞培养：取1.5 kg左右新西兰兔胸主动脉的中层平滑肌组织贴块法原代培养，用传2～3代的细胞进行实验。以Lg4、pLXSN病毒分别转染细胞后分为Lg4组和pLXSN组，并经G418筛选后挑取阳性克隆扩增，用于下一步检测。
Northern blot与Western blot检测：提取转染细胞总核糖核酸(RNA)(Qiagen公司试剂盒)，以地高辛标记的p16 cDNA为探针，做Northern blot检测(Boehringer Mannheim公司试剂盒)，并以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照；超声粉碎细胞提取蛋白后应用p16单克隆抗体DCS-50(Jiri Barter教授惠赠)和碱性磷酸酶标记的二抗作Western blot检测(华美ABC免疫试剂盒)；应用计算机对杂交结果进行密度扫描及定量分析(美国UVP公司)，将显色图像各点杂交信号做面积和灰度测定并计算表达量：(p16杂交信号面积×p16杂交信号灰度值)/(GAPDH杂交信号面积×杂交信号灰度值)
, 百拇医药
四唑盐(MTT)检测：取分别转染了Lg4、pLXSN的血管平滑肌细胞及正常血管平滑肌细胞，以5×103细胞/孔的密度接种于96孔板，分组为Lg4组、pLXSN组及正常组，每组3孔，以含20%小牛血清的DMEM培养液培养24小时后换0.5%小牛血清的DMEM培养液培养24小时，再以20%小牛血清的DMEM培养液分别培养24、48、72小时后四唑盐法检测血管平滑肌细胞的生长情况〔3〕，重复2次。
细胞周期测定：对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化，流式细胞仪测定细胞周期。
统计学处理：所有数值均以均值±标准误表示，采用t检验。
2 结果
2.1 pLXSN-p16(Lg4)及pLXSN载体，转入包装细胞PA317后，获得带有目的基因的重组病毒及对照的空病毒，扩增并转染后获得稳定表达外源性野生型p16的血管平滑肌细胞及其对照组细胞。其病毒滴度分别为5.2×104 CFU/ml和4.3×105 CFU/ml。
, 百拇医药
2.2 两组平滑肌细胞的p16基因及P16蛋白表达经Northern blot及Western blot分析检测结果如图1～2显示：Lg4组见明显条带，而pLXSN组条带不明显(Hela细胞和正常平滑肌细胞分别为阳性和阴性对照)；计算机密度扫描分析Northern blot结果显示Lg4组的(4.51±1.21比1.58±0.76)及Western blot的结果为(8.76±2.79比2.83±1.18)密度定量值均显著高于pLXSN组(P<0.01)，提示Lg4组血管平滑肌细胞p16的mRNA水平及P16蛋白表达量均较pLXSN组的血管平滑肌细胞明显增高，即外源性野生型p16基因成功地转入Lg4组的血管平滑肌细胞并在其中稳定高效表达。
图1 Northern blot检测Hela细胞、Lg4组、pLXSN组及正常组p16基因与磷酸甘油醛脱氢酶基因信使核糖核酸的表达结果
, 百拇医药
图2 Western blot检测Lg4组、pLXSN组、Hela细胞及正常组P16蛋白的表达结果
2.3 四唑盐检测：与转染了pLXSN及正常的血管平滑肌细胞相比，转染Lg4的血管平滑肌细胞生长状态差，生长速率明显减慢，各时间点光密度(OD)值均明显降低(P<0.01)(图3)，显示Lg4的导入即外源性野生型P16蛋白的表达可显著抑制血管平滑肌细胞的生长；转染pLXSN病毒的血管平滑肌细胞其生长速率与正常血管平滑肌细胞无明显差异。
图3 3组细胞在波长为570纳米检测，630纳米为基础对照，各时间点四唑盐检测值；24、48、72小时点Lg4组与pLXSN组，正常组相比均有显著差异(P<0.01)
2.4 流式细胞仪检测(图4)：转染Lg4和pLXSN的平滑肌细胞经检测细胞周期示Lg4组细胞大部分滞留于G1期(77.2%)，高于pLXSN组细胞(55.5%)，提示过度表达的外源性野生型P16蛋白通过阻滞细胞由G1期进入S期而抑制细胞的增殖。
, 百拇医药
图4A Lg4组细胞周期检测图 细胞周期分析：G1期细胞平均数：46.4%，变异系数8.3%，百分数77.2%；G2期细胞平均数：94.4%，变异系数6.9%，百分数3.3%；S期百分数：19.5%；G2/G1=2.034 图4B pLXSN组细胞周期检测图 细胞周期分析：G1期细胞平均数52.2%，变异系数6.9%，百分数55.5%；G2期细胞平均数103.9%，变异系数5.8%，百分数7.7%；S期百分数：36.8%；G2/G1=1.991。
*用波长为610纳米左右的荧光发射强度表示相对含量
3 讨论
动脉成形术后再狭窄高达30%～60%的发病率严重影响了冠心病介入性治疗的远期疗效。近来有报道显示应用细胞周期调节蛋白基因及抑癌基因如成视网膜细胞瘤蛋白基因(Rb基因)p27、p53基因进行基因治疗可抑制再狭窄的形成〔4～6〕，提示了导入外源性基因治疗动脉粥样硬化和再狭窄的前景。
, http://www.100md.com
p16基因定位于染色体9 p21区域，这是一个肿瘤敏感区域，其缺失或突变与多种恶性肿瘤发生有关，且肿瘤病变中p16基因的缺失、突变率远高于其它抑癌基因，可达60%以上，导入野生型或突变型p16基因可抑制或导致肿瘤的发生、发展，并可影响肿瘤细胞的凋亡〔7〕。同时P16蛋白作为CDK4和CDK6结合蛋白，可通过抑制细胞周期素/CDK4、细胞周期素/CDK6的活性影响成视网膜细胞瘤蛋白的磷酸化，参与细胞G1/S期的负调控。与p53、p27等基因相比，p16基因有其自身的优势：①P16蛋白既是细胞周期调节蛋白，本身又是抑癌基因的产物，它第一次将细胞周期调节蛋白基因与抑癌基因联系起来；②恶性肿瘤中它的缺失、突变发生率明显高于其它抑癌基因，显示了其在细胞生长与转化中的重要作用；③p16基因的分子较小，约为p53基因分子的1/4，且结合位点特异，故在基因治疗中具有操作简单、易于调控的优势；④P16蛋白只作用于CDK4，特异性强，可模仿其作用原理设计出直接调控细胞周期的药物。动脉粥样硬化及再狭窄发生中细胞因子、生长因子、原癌基因表达产物的增加是促使平滑肌细胞迁移增生的重要诱因，野生型p16基因表达的增加可阻断以上促有丝分裂原的作用途径〔8〕 ，有学者认为这种对核内细胞周期的干预比影响信号转导分子更为有效〔4〕。
, 百拇医药
本研究结果显示逆转录病毒载体可快速有效地将外源基因导入平滑肌细胞，且在转染细胞中检测到高表达的p16 mRNA和P16蛋白；而p16基因重组逆转录病毒载体转染后的细胞增殖速度减慢，滞留于G1期，说明导入外源性p16基因可有效地抑制平滑肌细胞增殖并可能成为治疗动脉粥样硬化和再狭窄的重要手段。
(致谢：本课题由第二军医大学遗传学开放实验室提供资助，并在该实验室完成。)
作者简介：张亚文(1967-) 女 主治医师 博士 主要从事冠心病防治研究
参考文献：
[1] Bauters C, Isner JM. The biology of restenosis.Prog Cardiovasc Dis, 1997，40∶107—116.
, 百拇医药 [2] Sherr CJ, Roberts JM. Inhibitor of mammalian G1 cyclin-dependent kinases.Genes & Dev,1995,9∶1149—1163.
[3] Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity.J Immun Meth,1983,65∶55—63.
[4] Chang MW,Barr E, Seltzer J, et al. Cytostatic gene therapy for vascular proliferative disorders with a constitutively active form of the retinoblastoma gene product.Science,1995,267∶518—522.
, 百拇医药
[5] Chen DH,Krasinski K,Chen DF,et al. Downregulation of cyclin-dependent kinase 2 activity and cyclin a promoter activity in vascular smooth muscle cells by p27kip1,an inhibitor of neointima formation in the rat carotid artery.J Clin Invest,1997,99∶2334—2341.
[6] Katayose D, Wersto R, Cowan K,et al. Consequences of p53 gene expression by adenovirus vector on cell cycle arrest and apoptosis in human aortic vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commmun,1995,215∶446—451.
[7] Sarrano M, Hannon GJ,Beach D, et al. A new regulatory motif in cell-cycle control causing Specifical inhibition of cyclinD/CDK4. Nature,1993,366∶704—707.
[8] Casscells W.Mechanism of restenosis. Tex Heart Inst J, 1994,21∶68—77.
收稿：1999-04-24
修回：1999-08-19, http://www.100md.com
单位：张亚文(200003 上海市，上海长征医院 心内科)；张国元(200003 上海市，上海长征医院 心内科)；黄长晖(中国人民解放军第二军医大学 分子遗传学开放实验室)
关键词：p16基因 逆转录病毒载体 血管平滑肌细胞
中国循环杂志000128 摘 要：目的：研究体外转染外源性野生型p16基因对兔血管平滑肌细胞生长的影响。
方法：构建野生型p16基因的重组逆转录病毒载体，并体外转染兔血管平滑肌细胞，应用Northern blot及Western blot检测外源p16基因的表达，并用四唑盐(MTT)法及流式细胞仪检测其对细胞生长的抑制作用。
结果：逆转录病毒载体可有效地将外源性p16基因导入平滑肌细胞，表达P16蛋白，并显著抑制血管平滑肌细胞的生长使细胞滞留于G1期。
, 百拇医药
结论：体外转染外源性野生型p16基因可有效抑制血管平滑肌细胞的生长。
分类号：329.2+8 文献标识码：A
文章编号：1000—3614(2000) 01—0048—03
Inhibitory Effect of Transfer of Exogenous p16 Gene on the Growth of
Cultured Vascular Smooth Muscle Cells
Zhang Yawen, Zhang Guoyuan, Huang Changhui.
Department of Cardiology, Changzheng Hospital,Shanghai(200003)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To investigate the effect of transfer of exogenous wide-type p16 gene on the growth of cultured vascular smooth muscle cells.
Methods：A replication-defective retroviral vector encoding a wild-type p16 gene was constructed and transferred into cultured smooth muscle cells.The expression of p16 gene was detected by Northern and Western blot and the effect of its product on cell arrest was determined by Methyl thiazolyl tetrazolium MTT assay and flow cytometry.
, 百拇医药
Results：The exogenous p16 gene could be effectively transferred into cultured primary rabbit aortic smooth muscle cells by retroviral vector and P16 protein was expressed. It could also markedly inhibit vascular smooth muscle cells proliferation and the cells were held up in G1 phase.
Conclusion：Transfer of exogenous wide-type tumor-inhibiting gene p16 could inhibit the fact that the growth of vascular smooth muscle cells which demonstrates the role of p16 in regulating the proliferation of vascular smooth muscle cells.
, 百拇医药
Key words：p16 gene; Retroviral vector; Vascular smooth muscle cells
(Chinese Circulation Journal,2000,15∶48.)▲
动脉受损时可使正常情况下静止的中层血管平滑肌细胞(VSMCs)增生并迁移至内膜合成细胞外基质，这是导致动脉粥样硬化及再狭窄形成的重要原因〔1〕，因此抑制平滑肌细胞生长是治疗动脉粥样硬化及再狭窄的重要目标之一。野生型p16基因是一种抑癌基因，其表达的P16蛋白作为细胞周期抑制蛋白可通过抑制细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的活性来调节细胞周期，阻止细胞由G1期进入S期，抑制其生长〔2〕。本实验应用野生型p16基因重组逆转录病毒载体体外转染兔血管平滑肌细胞，观察野生型P16蛋白对血管平滑肌细胞生长的抑制作用，为临床对动脉粥样硬化及再狭窄的基因治疗探索新的途径和实验基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
复制—缺陷型野生型p16基因的重组逆转录病毒载体的构建：将0.5 kb的野生型p16基因互补脱氧核糖核酸(cDNA)插入到逆转录病毒载体pLXSN(第二军医大学分子遗传学开放实验室黄长晖博士提供)的BamHI和EcoRI位点上。重组载体含LTR启动子、neo基因及野生型p16基因，命名为Lg4，以磷酸钙共沉淀法转染PA317细胞(中科院细胞所)，G418(美国Sigma公司)筛选阳性克隆后扩增获取Lg4重组病毒。同样方法用空载体pLXSN转染PA317细胞获得空病毒作为对照，Hela细胞检测病毒滴度。
血管平滑肌细胞培养：取1.5 kg左右新西兰兔胸主动脉的中层平滑肌组织贴块法原代培养，用传2～3代的细胞进行实验。以Lg4、pLXSN病毒分别转染细胞后分为Lg4组和pLXSN组，并经G418筛选后挑取阳性克隆扩增，用于下一步检测。
Northern blot与Western blot检测：提取转染细胞总核糖核酸(RNA)(Qiagen公司试剂盒)，以地高辛标记的p16 cDNA为探针，做Northern blot检测(Boehringer Mannheim公司试剂盒)，并以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照；超声粉碎细胞提取蛋白后应用p16单克隆抗体DCS-50(Jiri Barter教授惠赠)和碱性磷酸酶标记的二抗作Western blot检测(华美ABC免疫试剂盒)；应用计算机对杂交结果进行密度扫描及定量分析(美国UVP公司)，将显色图像各点杂交信号做面积和灰度测定并计算表达量：(p16杂交信号面积×p16杂交信号灰度值)/(GAPDH杂交信号面积×杂交信号灰度值)
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四唑盐(MTT)检测：取分别转染了Lg4、pLXSN的血管平滑肌细胞及正常血管平滑肌细胞，以5×103细胞/孔的密度接种于96孔板，分组为Lg4组、pLXSN组及正常组，每组3孔，以含20%小牛血清的DMEM培养液培养24小时后换0.5%小牛血清的DMEM培养液培养24小时，再以20%小牛血清的DMEM培养液分别培养24、48、72小时后四唑盐法检测血管平滑肌细胞的生长情况〔3〕，重复2次。
细胞周期测定：对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化，流式细胞仪测定细胞周期。
统计学处理：所有数值均以均值±标准误表示，采用t检验。
2 结果
2.1 pLXSN-p16(Lg4)及pLXSN载体，转入包装细胞PA317后，获得带有目的基因的重组病毒及对照的空病毒，扩增并转染后获得稳定表达外源性野生型p16的血管平滑肌细胞及其对照组细胞。其病毒滴度分别为5.2×104 CFU/ml和4.3×105 CFU/ml。
, 百拇医药
2.2 两组平滑肌细胞的p16基因及P16蛋白表达经Northern blot及Western blot分析检测结果如图1～2显示：Lg4组见明显条带，而pLXSN组条带不明显(Hela细胞和正常平滑肌细胞分别为阳性和阴性对照)；计算机密度扫描分析Northern blot结果显示Lg4组的(4.51±1.21比1.58±0.76)及Western blot的结果为(8.76±2.79比2.83±1.18)密度定量值均显著高于pLXSN组(P<0.01)，提示Lg4组血管平滑肌细胞p16的mRNA水平及P16蛋白表达量均较pLXSN组的血管平滑肌细胞明显增高，即外源性野生型p16基因成功地转入Lg4组的血管平滑肌细胞并在其中稳定高效表达。
图1 Northern blot检测Hela细胞、Lg4组、pLXSN组及正常组p16基因与磷酸甘油醛脱氢酶基因信使核糖核酸的表达结果
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图2 Western blot检测Lg4组、pLXSN组、Hela细胞及正常组P16蛋白的表达结果
2.3 四唑盐检测：与转染了pLXSN及正常的血管平滑肌细胞相比，转染Lg4的血管平滑肌细胞生长状态差，生长速率明显减慢，各时间点光密度(OD)值均明显降低(P<0.01)(图3)，显示Lg4的导入即外源性野生型P16蛋白的表达可显著抑制血管平滑肌细胞的生长；转染pLXSN病毒的血管平滑肌细胞其生长速率与正常血管平滑肌细胞无明显差异。
图3 3组细胞在波长为570纳米检测，630纳米为基础对照，各时间点四唑盐检测值；24、48、72小时点Lg4组与pLXSN组，正常组相比均有显著差异(P<0.01)
2.4 流式细胞仪检测(图4)：转染Lg4和pLXSN的平滑肌细胞经检测细胞周期示Lg4组细胞大部分滞留于G1期(77.2%)，高于pLXSN组细胞(55.5%)，提示过度表达的外源性野生型P16蛋白通过阻滞细胞由G1期进入S期而抑制细胞的增殖。
, 百拇医药
图4A Lg4组细胞周期检测图 细胞周期分析：G1期细胞平均数：46.4%，变异系数8.3%，百分数77.2%；G2期细胞平均数：94.4%，变异系数6.9%，百分数3.3%；S期百分数：19.5%；G2/G1=2.034 图4B pLXSN组细胞周期检测图 细胞周期分析：G1期细胞平均数52.2%，变异系数6.9%，百分数55.5%；G2期细胞平均数103.9%，变异系数5.8%，百分数7.7%；S期百分数：36.8%；G2/G1=1.991。
*用波长为610纳米左右的荧光发射强度表示相对含量
3 讨论
动脉成形术后再狭窄高达30%～60%的发病率严重影响了冠心病介入性治疗的远期疗效。近来有报道显示应用细胞周期调节蛋白基因及抑癌基因如成视网膜细胞瘤蛋白基因(Rb基因)p27、p53基因进行基因治疗可抑制再狭窄的形成〔4～6〕，提示了导入外源性基因治疗动脉粥样硬化和再狭窄的前景。
, http://www.100md.com
p16基因定位于染色体9 p21区域，这是一个肿瘤敏感区域，其缺失或突变与多种恶性肿瘤发生有关，且肿瘤病变中p16基因的缺失、突变率远高于其它抑癌基因，可达60%以上，导入野生型或突变型p16基因可抑制或导致肿瘤的发生、发展，并可影响肿瘤细胞的凋亡〔7〕。同时P16蛋白作为CDK4和CDK6结合蛋白，可通过抑制细胞周期素/CDK4、细胞周期素/CDK6的活性影响成视网膜细胞瘤蛋白的磷酸化，参与细胞G1/S期的负调控。与p53、p27等基因相比，p16基因有其自身的优势：①P16蛋白既是细胞周期调节蛋白，本身又是抑癌基因的产物，它第一次将细胞周期调节蛋白基因与抑癌基因联系起来；②恶性肿瘤中它的缺失、突变发生率明显高于其它抑癌基因，显示了其在细胞生长与转化中的重要作用；③p16基因的分子较小，约为p53基因分子的1/4，且结合位点特异，故在基因治疗中具有操作简单、易于调控的优势；④P16蛋白只作用于CDK4，特异性强，可模仿其作用原理设计出直接调控细胞周期的药物。动脉粥样硬化及再狭窄发生中细胞因子、生长因子、原癌基因表达产物的增加是促使平滑肌细胞迁移增生的重要诱因，野生型p16基因表达的增加可阻断以上促有丝分裂原的作用途径〔8〕 ，有学者认为这种对核内细胞周期的干预比影响信号转导分子更为有效〔4〕。
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本研究结果显示逆转录病毒载体可快速有效地将外源基因导入平滑肌细胞，且在转染细胞中检测到高表达的p16 mRNA和P16蛋白；而p16基因重组逆转录病毒载体转染后的细胞增殖速度减慢，滞留于G1期，说明导入外源性p16基因可有效地抑制平滑肌细胞增殖并可能成为治疗动脉粥样硬化和再狭窄的重要手段。
(致谢：本课题由第二军医大学遗传学开放实验室提供资助，并在该实验室完成。)
作者简介：张亚文(1967-) 女 主治医师 博士 主要从事冠心病防治研究
参考文献：
[1] Bauters C, Isner JM. The biology of restenosis.Prog Cardiovasc Dis, 1997，40∶107—116.
, 百拇医药 [2] Sherr CJ, Roberts JM. Inhibitor of mammalian G1 cyclin-dependent kinases.Genes & Dev,1995,9∶1149—1163.
[3] Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity.J Immun Meth,1983,65∶55—63.
[4] Chang MW,Barr E, Seltzer J, et al. Cytostatic gene therapy for vascular proliferative disorders with a constitutively active form of the retinoblastoma gene product.Science,1995,267∶518—522.
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[5] Chen DH,Krasinski K,Chen DF,et al. Downregulation of cyclin-dependent kinase 2 activity and cyclin a promoter activity in vascular smooth muscle cells by p27kip1,an inhibitor of neointima formation in the rat carotid artery.J Clin Invest,1997,99∶2334—2341.
[6] Katayose D, Wersto R, Cowan K,et al. Consequences of p53 gene expression by adenovirus vector on cell cycle arrest and apoptosis in human aortic vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commmun,1995,215∶446—451.
[7] Sarrano M, Hannon GJ,Beach D, et al. A new regulatory motif in cell-cycle control causing Specifical inhibition of cyclinD/CDK4. Nature,1993,366∶704—707.
[8] Casscells W.Mechanism of restenosis. Tex Heart Inst J, 1994,21∶68—77.
收稿：1999-04-24
修回：1999-08-19, http://www.100md.com