卡托普利对外源性羟自由基诱导心肌细胞凋亡的影响
作者：姜醒华 罗伟 程晓曙 苏海 吴清华
单位：330006 南昌市 江西医学院第二附属医院心内科
关键词：心肌细胞；细胞凋亡；羟自由基；卡托普利
岭南心血管病杂志000116 【摘要】 目的 观察卡托普利对由外源性羟自由基诱导的心肌细胞凋亡有无影响。方法 ①利用第4代心肌细胞，随机分成15组，在终浓度为10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L、10-1 mol/L的羟自由基无血清条件培养下分别共孵育8 h、16 h、 24 h，确定10-3 mol/L及24 h为诱导心肌细胞凋亡的最佳浓度及时间。②在上述条件下分别观察3种不同浓度卡托普利(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5 mol/L)对心肌细胞存活率、形态学、DNA琼脂糖凝胶电泳及培养液中血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)活性等参数的影响。结果 ①随着外源性羟自由基浓度升高、心肌细胞存活率明显降低，在外源性羟自由基终浓度为10-5～10-3 mol/L范围内，随着浓度升高，培养液中ACE活性逐渐升高，但高于10-3 mol/L浓度时反而降低。②10-3 mol/L作用心肌细胞24 h心肌细胞凋亡程度最明显，在此条件下，加用卡托普利(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5 mol/L)，心肌细胞存活率明显升高，培养液中ACE活性降低，心肌细胞凋亡程度降低，呈剂量依赖性。结论 卡托普利能减轻由外源性羟自由基诱导的乳鼠心肌细胞凋亡。
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The effect of captopril on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes induced by exogenous hydroxyl free radical
Jiang Xinghua, Luo Wei, Cheng Xiaoshu, et al. The Second Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College, Nanchang 330006
【Abstract】 Objective To observe the effect of captopril on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes (NRCs) induced by exogenous hydroxyl free radical (EHFR). Methods ①The fouth passage of NRCs were divided randomly into fifteen groups and were cultured with EHFR(10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L、10-1 mol/L) in free-serum medium for 8hr、 16hr and 24hr respectly in order to ditermine the best concentration of EHFR and culture time inducing apoptosis. ②Under 10-3 mol/L EHFR condition, NRCs were co-cultured with three end concentrations of captopril (10-7mol/L、10-6mol/L、10-5 mol/L). The survival rate and morphology of NRCs、 activity of angioteasin-converting enzyme (ACE) in medium DNA ladder and percentage of NRCs with positive reaction in nuclei by the terminal deoxynucleotidyl transferase were evaluated. Result ①The survival rate of NRCs significantly decreased as the concentration of EHFR increased. The activity of ACE in medium increased as the concentration EHFR increased within the arrange of 10-5～10-3 mol/L, but it decreased when the concentration of EHFR was beyond 10-3 mol/L. ② The most obvious apoptosis of NRCs was found at the concentration of 10-3 mol/L EHFR for 24hr culture. Under this culture condition, captopril significantly increased the survival rate of NRCs, decreased the activity of ACE in medium and attenuated apoptosis of NRCs in a dose-dependent fashion. Conclusion Captopril attenuates the apoptosis of NRCs induced by EHFR.
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【Key words】 Cardiomyocytes Apoptosis Hydroxyl free radical Captopril
细胞凋亡(细胞程序性死亡)是细胞在特定环境下的主动自杀过程，是在基因调控下的细胞死亡。细胞膜鼓泡或出芽、核固缩、胞浆浓集及凋亡小体形成为其形态学特征。DNA断裂成不同倍数的180～200个碱基对的片段，在琼脂糖电泳谱上呈“梯”状(DNA Ladder)为其生化特征[1]，在缺氧条件下，离体培养的乳鼠心肌细胞有凋亡现象[2]，在体条件下缺血及缺血再灌注心肌均可发生细胞凋亡[3]，并推测与氧自由基损伤有关；在人类，因扩张型心肌病和致心律失常性右心发育不全而致心功能衰竭的晚期患者心脏中也有心肌细胞凋亡现象[4]，并提出细胞凋亡是心肌受损，心力衰竭发展的重要因素，抑制心肌细胞凋亡成为抑制左心功能不全发展的一个新的理论。
卡托普利是血管紧张素转换酶抑制剂，已证明其具有清除氧自由基作用[5]，可明显改善缺血再灌注后心脏的功能，但目前尚无卡托普利对外源性羟自由基诱导的乳鼠心肌细胞凋亡有无保护作用的研究。
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材料与方法
一、实验药品及试剂
①卡托普利注射液(开富林)(常州制药厂出品 批号 980519)；②DMEM培养基、胰酶、蛋白酶K(购自sigma公司)；③小牛血清(购自杭州生物制品公司)；④程序性细胞死亡检测试剂盒(购自华美生物工程公司)；⑤ACE活性检测试剂盒(购自海军总医院)。
二、实验动物
刚出生2～3天的Spragu-Dawlay大鼠。(江西医学院实验动物中心提供)
三、实验方法
(一)心肌细胞原代、传代培养
取刚出生2～3天的SD乳鼠(每批30只)雌雄不拘，用改良的Harary′s法[6]进行心肌细胞分离，得分散的单心肌细胞，以0.5×106/mL细胞密度接种于25 cm2培养瓶中加入含10%小牛血清的DMEM培养液，于37℃，5%CO2孵箱中培养，24 h后可见心肌细胞已贴壁，2～3天形成细胞单层，并可见心肌细胞特有的向心同步化搏动，频率平均80次/min左右。将培养的心肌细胞以0.1%胰蛋白酶消化传代培养，实验用第4代细胞。
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(二)诱导心肌细胞凋亡的实验分组
利用铁催化的Fenton型Haber-weiss反应方法获得外源性OH-，实验时用FeCl2-H2O2反应体系，选择OH-终浓度分别为10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L、10-1 mol/L，利用外源性OH-诱导心肌细胞凋亡；取生长良好的第4代心肌细胞制成细胞悬液，按每孔2×105个密度接种于24孔培养板上，用含10%小牛血清的DMEM进行培养36h，使心肌细胞生长呈亚融合状态，弃去原培养液，每孔换成不含血清DMEM和不同终浓度的OH-共孵育，并随机分为6组：①正常对照组(C);②凋亡组1(A1)OH-终浓度为10-1 mol/L;③凋亡组2(A2)OH-终浓度为10-2mol/L；④凋亡组3(A3)OH-终浓度为10-3 mol/L;⑤凋亡组4(A4)OH-终浓度为10-4 mol/L;⑥凋亡组5(A5)OH-终浓度为10-5 mol/L，继续37℃，5% CO2孵箱中培养于8h、16h、24h时观察，并测定24h时培养液中ACE活性及DNA电泳图谱。
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(三)卡托普利干预作用的实验分组
待心肌细胞生长呈亚融合状态(36h)弃原培养液，换成不同终浓度的卡托普利和OH-终浓度为10-3 mol/L的DMEM培养，随机分为6个组：①正常对照组(C)，仅用DMEM培养；②凋亡组(A)，OH-终浓度为10-3mol/L;③单纯药物组(M)，卡托普利终浓度为10-5mol/L;④药物组1+凋亡组(AM1)，OH- 10-3 mol/L+cap 10-7 mol/L;⑤药物组2+凋亡组(AM2)，OH- 10-3 mol/L+cap 10-6 mol/L;⑥药物组3+凋亡组(AM3)，OH- 10-3 mol/L+cap 10-5 mol/L，继续37℃，5%CO2孵箱中培养于24 h观察。
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(四)观测指标及方法
1.细胞存活率
台盼蓝排斥法，取细胞悬液0.1 mL加0.4%台盼蓝20 μL(5∶1)染色，室温下5分钟内在光学显微镜下计数死活细胞数200个，死细胞着蓝色，活细胞透亮无色。
2.凋亡细胞形态学观察
(1)3′末端标记DNA降解片断检测(TUNEL法)：用0.1%蛋白酶将贴壁心肌细胞消化，用含20%小牛血清DMEM终止胰蛋白酶，离心，去上清液，用0.01 mol/L的PBS冲洗2次，作细胞涂片，固定，用程序性细胞死亡检测试剂盒染色。具体步骤见说明书。然后计数6个视野中的每100个细胞染色阳性的细胞数(%)。
(2)电镜观察：细胞悬液离心沉淀后以2.5%戊二醛固定，常规进行超薄切片，醋酸铀，柠檬酸铅染色后透射电镜观察。
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3.DNA凝胶电泳图谱定性
收集5×106个细胞，用2 mL细胞裂解液37℃保温1h。加入终浓度为100 μg/mL的蛋白酶K 50℃保温3h。酚： 氯仿抽提后，样品在1.4%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外光下拍照。
4.血管紧张素转换酶(ACE)活性的检测
取各孔培养液，用血清ACE(紫外法)测定试剂盒(海军总医院提供)检测ACE活性，具体步骤见说明书。
四、统计学处理
实验重复6次，所有计数资料均以均数±标准差(
±s)表示，统计学方法采用单因素多组资料的方差分析，进行F检验，两个样本率的差别统计意义检验用u检验，P<0.05有统计学意义，P<0.01有高度统计意义。
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结 果
一、心肌细胞存活率
各组心肌细胞存活率，见表1、表2。在表1可见，和C组比较，除A5组无显著性差别外，A1～A4组均有显著性差异(P<0.05)，甚至在A1组，心肌细胞存活率为零，均为坏死细胞，提示外源性OH-对心肌细胞生长具有明显抑制作用。
在表2中可见，M组细胞生长良好，与C组比较无显著性差别，AM1、AM2、AM3组呈剂量依赖性提高，和A组比较，分别有显著性差别(P<0.05)，提示卡托普利可降低外源性OH-对心肌细胞的生长抑制作用。
二、心肌细胞形态学观察
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在倒置相差显微镜下观察培养的心肌细胞，初为圆形或椭圆形，以后逐渐生长成梭形，继而逐渐伸出伪足，形成不规则的星形，24h绝大多数细胞都已搏动，频率为80次/min。48h心肌细胞交织成网，形成细胞单层，甚至有少量的细胞族(cluster)形成。图1在外源性OH-干预作用下，随着OH-终浓度的升高，心肌细胞搏动明显加速，至高浓度时，心肌细胞停止搏动，心肌细胞呈细长梭状，且可见漂浮在培养基中的呈圆形坏死心肌细胞(图2)。
表1 OH-诱导心肌细胞凋亡的各项指标参数 组别
(n=6)
OH-
(mol/L)
心肌细胞存活率
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心肌细胞凋亡细胞百分率
DNA “ladder”
ACE活性
(U)/2×105
8 h
16 h
24 h
8 h
16 h
24 h
对照组(C)
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0
98.3±0.6
97.9±0.6
97.5±0.8
1.1±0.2
1.4±0.7
1.9±0.6
-
3.45±0.20
凋亡组(A1)
10-1
0
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0
0
0
0
0
-
0
凋亡组(A2)
10-2
22.6±1.5*
18.4±2.8*
15.1±0.6*
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15.5±3.8*
12.4±1.4*
11.6±1.0*
-
0.24±0.06
凋亡组(A3)
10-3
76.2±3.1*
51.9±2.4*
38.3±3.5*
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22.7±1.3*
37.9±4.8*
48.5±4.1*
+
22.97±0.43
凋亡组(A4)
10-4
85.6±2.7*
79.4±3.0*
71.9±4.3*
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12.1±2.5*
16.6±3.6*
28.6±2.1*
+
15.11±0.13
凋亡组(A5)
10-5
94.6±1.1△
93.6±1.5△
91.1±1.2△
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4.6±1.4△
4.9±2.1△
6.8±0.9△
-
3.65±0.10
注：*与对照组相比较，A2、A3、A4组在心肌细胞存活率， 凋亡细胞百分率方面有显著性差异， P<0.05。△A5无显著差别，P>0.05。表2 卡托普利对OH-诱导心肌细胞凋亡影响 组别
(n=6)
OH-/cap
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mol/L/mol/L
24h心肌细胞
存活率
24h心肌细胞凋亡
细胞百分率
DNA “ladder”
ACE活性
(U)/2×105
对照组(C)
0
96.7±0.6
2.1±0.8
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-
3.45±0.20
单纯药物组(M)
0/10-5
96.4±0.9
2.3±0.4
-
0.35±0.06
凋亡组(A)
10-3/0
43.2±1.9
49.4±2.6
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+
22.97±0.43
凋亡+药物组1(AM1)
10-3/10-7
59.3±2.2*
34.9±1.4*
+
4.42±0.24
凋亡+药物组2(AM2)
10-3/10-6
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69.2±1.8*
27.3±2.6*
±
1.89±0.26
凋亡+药物组3(AM3)
10-3/10-5
85.2±1.1*
12.1±0.5*
-
0.26±0.03
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注：*药物干预各组AM1、AM2、AM3与凋亡组A比较，心肌细胞存活率和凋亡细胞百分率均有显著差别，P<0.05。
图1 正常培养的SD乳鼠心肌
细胞。(LM×400)
图2 10-2mol/L OH-干预24小时SD乳鼠心肌细胞。(LM×400)
在光镜下，心肌细胞涂片应用程序性细胞死亡检测试剂标记后，可见正常的心肌细胞呈圆形，胞浆丰满，细胞核呈青灰色，而凋亡细胞核呈棕色颗粒，坏死心肌细胞，细胞肿胀，胞膜不完整，细胞质溢出(图3)。
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在电镜下，凋亡心肌细胞呈特征性超微结构变化，如胞浆浓缩胞膜起泡，染色质浓集，凋亡小体形成等(图4)。
从表1可见，A5～A3组，心肌细胞凋亡细胞百分率呈浓度依赖性和时间依赖性增加，A2组凋亡细胞反而较A3组下降，而坏死细胞比例上升，A1组未见凋亡细胞，全为坏死细胞，提示OH-在低浓度时可诱导心肌细胞凋亡。
从表2可见，AM1、AM2、AM3组，随着卡托普利剂量增大，和A组比较凋亡百分率呈剂量依赖性减少，提示卡托普利对OH-诱导的心肌细胞凋亡有抑制作用。
三、DNA琼脂糖凝胶电泳心肌细胞凋亡定性
, http://www.100md.com 从图5中可见C、A1、A2组均未见到凋亡特有的DNA“ladder”，在A3、A4、A5组均可见DNA“ladder”，以A3组24h时最明显。A1、A2组显示为坏死膜状模糊条带。
从图6中可见，AM1～AM3组DNA“ladder”呈减弱至消失趋势，AM3未见DNA“ladder”。
图3 10-7mol/L卡托普利干预OH-处理心肌细胞，程序性细胞死亡检测试剂盒标记后。(LM×400)细胞核染为棕色的为凋亡细胞。
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图4 10-3mol/L OH-处理心肌细胞24小时，核染色
质浓集，胞膜起泡。(TEM×5 000)
图5 不同浓度OH-作用心肌细胞24小时时，DNA琼脂糖电泳图谱。
图6 卡托普利干预24小时心肌细胞DNA琼脂糖电泳图谱。
四、ACE(血管紧张素Ⅰ转换酶)活性检测
从表1中可见，和C组比较，每单位(2×105 cell)ACE活性在OH-浓度为10-5～10-3mol/L范围内，随OH-浓度升高而升高，但当OH-浓度超过10-2mol/L时，ACE活性反而下降，ACE活性有明显差异，P<0.01，提示外源性OH-在浓度为10-5～10-3mol/L范围内能激活心肌细胞肾素-血管紧张素系统(RAS)中的ACE活性。表2示，和A组比较，卡托普利药物干预各组AM1、AM2、AM3、ACE活性均有降低，并随卡托普利浓度增大而降低，ACE活性有明显差异，P<0.01，提示卡托普利对心肌细胞凋亡抑制作用与ACE活性降低有一定关系。
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讨 论
已有文献报道[7]，高浓度氧自由基对细胞的作用是导致细胞坏死，低浓度的氧自由基会导致细胞凋亡，本研究中，用不同浓度的羟自由基作用培养的心肌细胞，结果证实外源性氧自由基可诱导培养心肌细胞发生凋亡，心肌细胞呈特征性超微结构变化，以10-3 mol/L的OH-作用24h最明显，可见典型的DNA “ladder”图形，凋亡细胞百分率也最高。高浓度时则主要致使心肌细胞坏死，即细胞溶解、破裂，与Lennon等的实验结果相似。
现已证实[8，9]，当低浓度外源性羟自由基作用于心肌细胞，使细胞膜Ca2+内流增加，活化黄嘌呤氧化酶，NO合酶等酶，使内源性氧自由基浓度增加，内源性氧自由基作为细胞内信使，激活转录因子核因子κB(NF-κB)，使NF-κB与细胞核DNA结合增强，进一步激活与NF-κB相关的转录因子，通过影响基因转录，使促凋亡基因P53，Ced-3、Ced-4等上调，改变细胞表形特征，诱导细胞发生凋亡，而高浓度的外源性羟自由基作用于心肌细胞，使心肌细胞膜脂质过度氧化，膜蛋白质变性，细胞膜结构破坏，细胞肿胀，胞膜不完整，细胞质溢出，细胞坏死。
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本研究中，通过检测心肌细胞培养基中ACE活性，发现随着外源性羟自由基(OH-为10-5～10-3 mol/L)浓度升高，每单位(2×105个cell)心肌细胞ACE活性也升高，在高浓度时(OH-为10-2～10-1mol/L)，心肌细胞全坏死，ACE活性也全无，进一步证实心肌组织局部存在肾素血管紧张素系统(RAS)。ACE几乎存在于所有哺乳动物的组织和体液中，已有研究证明[10]，蛋白激酶C(PKC)可增加培养的内皮细胞ACE的活力，PKC激活剂还能促进ACE的释放，Kajstura等[11]证实，血管紧张素Ⅱ可诱导体外培养的心肌细胞凋亡，且与心肌细胞内Ca2+浓度增加，蛋白激酶C活化有关，本研究证实在低浓度OH-诱导下，心肌细胞分泌ACE活性增加，这一现象是否与心肌细胞内Ca2+浓度增加，蛋白激酶C活化等细胞内信息传导途径有关，还有待于进一步研究。至于ACE活性增加促使心肌细胞凋亡加速可能与血管紧张素Ⅱ生成增加间接促进心肌细胞凋亡有关。
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在卡托普利抗心肌细胞凋亡的实验研究中，是在OFR诱导心肌细胞凋亡的基础上，观察了卡托普利的干预作用，实验显示，在体外培养的心肌细胞中，同时加入卡托普利和OFR共孵育24h，卡托普利可阻止OH-对心肌细胞的损伤，提高心肌细胞存活率，降低细胞的凋亡率，随着卡托普利浓度的升高，DNA“梯状”图谱逐渐消失，以卡托普利10-5mol/L效果最佳，本实验还显示与对照组比较，凋亡组心肌细胞的培养液ACE活性明显增高。与凋亡组比较，随着卡托普利浓度的增高，药物干预各组心肌细胞培养液中ACE活性降低，心肌细胞存活率也提高。
业已证实[12，13]，在体及离体条件下，卡托普利对缺血再灌注(I/R)产生的OFR对心肌细胞的损伤均有保护作用。卡托普利还可改善缺血心肌代谢：Wang等[14]证实卡托普利具有升高缺血心肌组织中超氧化歧化酶(SOD)活性，升高前列环素和谷胱甘肽的含量及降低丙二醛的水平等作用，Bagchi等[15]则发现卡托普利能抑制缺血再灌注心肌丙二醛的形成和羟自由基产生。通过本实验，进一步证实卡托普利对外源性羟自由基诱导心肌细胞凋亡具有保护作用。卡托普利可对抗外源性羟自由基对细胞的损伤，减轻细胞膜脂质过氧化[16]而发挥抗心肌细胞凋亡的作用。由于卡托普利结构上含有疏基，使其具有强力的OFR清除作用，减轻自由基损伤含疏基的蛋白质和酶(如Na+、K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶等)所造成的细胞内钙超负荷，细胞内游离Ca2+浓度降低[17] ，使心肌细胞凋亡受到抑制。
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本实验研究证明，羟自由基在(10-5～10-3 mol/L)浓度范围能促进心肌细胞释放ACE，诱导心肌细胞凋亡，卡托普利能抑制由羟自由基激所致心肌细胞ACE活性增高。卡托普利对心肌细胞凋亡的保护作用，也可能是通过卡托普利抑制ACE活性，使血管紧张素Ⅱ生成减少而发挥作用。
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岭南心血管病杂志000116 【摘要】 目的 观察卡托普利对由外源性羟自由基诱导的心肌细胞凋亡有无影响。方法 ①利用第4代心肌细胞，随机分成15组，在终浓度为10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L、10-1 mol/L的羟自由基无血清条件培养下分别共孵育8 h、16 h、 24 h，确定10-3 mol/L及24 h为诱导心肌细胞凋亡的最佳浓度及时间。②在上述条件下分别观察3种不同浓度卡托普利(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5 mol/L)对心肌细胞存活率、形态学、DNA琼脂糖凝胶电泳及培养液中血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)活性等参数的影响。结果 ①随着外源性羟自由基浓度升高、心肌细胞存活率明显降低，在外源性羟自由基终浓度为10-5～10-3 mol/L范围内，随着浓度升高，培养液中ACE活性逐渐升高，但高于10-3 mol/L浓度时反而降低。②10-3 mol/L作用心肌细胞24 h心肌细胞凋亡程度最明显，在此条件下，加用卡托普利(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5 mol/L)，心肌细胞存活率明显升高，培养液中ACE活性降低，心肌细胞凋亡程度降低，呈剂量依赖性。结论 卡托普利能减轻由外源性羟自由基诱导的乳鼠心肌细胞凋亡。
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The effect of captopril on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes induced by exogenous hydroxyl free radical
Jiang Xinghua, Luo Wei, Cheng Xiaoshu, et al. The Second Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College, Nanchang 330006
【Abstract】 Objective To observe the effect of captopril on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes (NRCs) induced by exogenous hydroxyl free radical (EHFR). Methods ①The fouth passage of NRCs were divided randomly into fifteen groups and were cultured with EHFR(10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L、10-1 mol/L) in free-serum medium for 8hr、 16hr and 24hr respectly in order to ditermine the best concentration of EHFR and culture time inducing apoptosis. ②Under 10-3 mol/L EHFR condition, NRCs were co-cultured with three end concentrations of captopril (10-7mol/L、10-6mol/L、10-5 mol/L). The survival rate and morphology of NRCs、 activity of angioteasin-converting enzyme (ACE) in medium DNA ladder and percentage of NRCs with positive reaction in nuclei by the terminal deoxynucleotidyl transferase were evaluated. Result ①The survival rate of NRCs significantly decreased as the concentration of EHFR increased. The activity of ACE in medium increased as the concentration EHFR increased within the arrange of 10-5～10-3 mol/L, but it decreased when the concentration of EHFR was beyond 10-3 mol/L. ② The most obvious apoptosis of NRCs was found at the concentration of 10-3 mol/L EHFR for 24hr culture. Under this culture condition, captopril significantly increased the survival rate of NRCs, decreased the activity of ACE in medium and attenuated apoptosis of NRCs in a dose-dependent fashion. Conclusion Captopril attenuates the apoptosis of NRCs induced by EHFR.
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【Key words】 Cardiomyocytes Apoptosis Hydroxyl free radical Captopril
细胞凋亡(细胞程序性死亡)是细胞在特定环境下的主动自杀过程，是在基因调控下的细胞死亡。细胞膜鼓泡或出芽、核固缩、胞浆浓集及凋亡小体形成为其形态学特征。DNA断裂成不同倍数的180～200个碱基对的片段，在琼脂糖电泳谱上呈“梯”状(DNA Ladder)为其生化特征[1]，在缺氧条件下，离体培养的乳鼠心肌细胞有凋亡现象[2]，在体条件下缺血及缺血再灌注心肌均可发生细胞凋亡[3]，并推测与氧自由基损伤有关；在人类，因扩张型心肌病和致心律失常性右心发育不全而致心功能衰竭的晚期患者心脏中也有心肌细胞凋亡现象[4]，并提出细胞凋亡是心肌受损，心力衰竭发展的重要因素，抑制心肌细胞凋亡成为抑制左心功能不全发展的一个新的理论。
卡托普利是血管紧张素转换酶抑制剂，已证明其具有清除氧自由基作用[5]，可明显改善缺血再灌注后心脏的功能，但目前尚无卡托普利对外源性羟自由基诱导的乳鼠心肌细胞凋亡有无保护作用的研究。
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材料与方法
一、实验药品及试剂
①卡托普利注射液(开富林)(常州制药厂出品 批号 980519)；②DMEM培养基、胰酶、蛋白酶K(购自sigma公司)；③小牛血清(购自杭州生物制品公司)；④程序性细胞死亡检测试剂盒(购自华美生物工程公司)；⑤ACE活性检测试剂盒(购自海军总医院)。
二、实验动物
刚出生2～3天的Spragu-Dawlay大鼠。(江西医学院实验动物中心提供)
三、实验方法
(一)心肌细胞原代、传代培养
取刚出生2～3天的SD乳鼠(每批30只)雌雄不拘，用改良的Harary′s法[6]进行心肌细胞分离，得分散的单心肌细胞，以0.5×106/mL细胞密度接种于25 cm2培养瓶中加入含10%小牛血清的DMEM培养液，于37℃，5%CO2孵箱中培养，24 h后可见心肌细胞已贴壁，2～3天形成细胞单层，并可见心肌细胞特有的向心同步化搏动，频率平均80次/min左右。将培养的心肌细胞以0.1%胰蛋白酶消化传代培养，实验用第4代细胞。
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(二)诱导心肌细胞凋亡的实验分组
利用铁催化的Fenton型Haber-weiss反应方法获得外源性OH-，实验时用FeCl2-H2O2反应体系，选择OH-终浓度分别为10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L、10-1 mol/L，利用外源性OH-诱导心肌细胞凋亡；取生长良好的第4代心肌细胞制成细胞悬液，按每孔2×105个密度接种于24孔培养板上，用含10%小牛血清的DMEM进行培养36h，使心肌细胞生长呈亚融合状态，弃去原培养液，每孔换成不含血清DMEM和不同终浓度的OH-共孵育，并随机分为6组：①正常对照组(C);②凋亡组1(A1)OH-终浓度为10-1 mol/L;③凋亡组2(A2)OH-终浓度为10-2mol/L；④凋亡组3(A3)OH-终浓度为10-3 mol/L;⑤凋亡组4(A4)OH-终浓度为10-4 mol/L;⑥凋亡组5(A5)OH-终浓度为10-5 mol/L，继续37℃，5% CO2孵箱中培养于8h、16h、24h时观察，并测定24h时培养液中ACE活性及DNA电泳图谱。
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(三)卡托普利干预作用的实验分组
待心肌细胞生长呈亚融合状态(36h)弃原培养液，换成不同终浓度的卡托普利和OH-终浓度为10-3 mol/L的DMEM培养，随机分为6个组：①正常对照组(C)，仅用DMEM培养；②凋亡组(A)，OH-终浓度为10-3mol/L;③单纯药物组(M)，卡托普利终浓度为10-5mol/L;④药物组1+凋亡组(AM1)，OH- 10-3 mol/L+cap 10-7 mol/L;⑤药物组2+凋亡组(AM2)，OH- 10-3 mol/L+cap 10-6 mol/L;⑥药物组3+凋亡组(AM3)，OH- 10-3 mol/L+cap 10-5 mol/L，继续37℃，5%CO2孵箱中培养于24 h观察。
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(四)观测指标及方法
1.细胞存活率
台盼蓝排斥法，取细胞悬液0.1 mL加0.4%台盼蓝20 μL(5∶1)染色，室温下5分钟内在光学显微镜下计数死活细胞数200个，死细胞着蓝色，活细胞透亮无色。
2.凋亡细胞形态学观察
(1)3′末端标记DNA降解片断检测(TUNEL法)：用0.1%蛋白酶将贴壁心肌细胞消化，用含20%小牛血清DMEM终止胰蛋白酶，离心，去上清液，用0.01 mol/L的PBS冲洗2次，作细胞涂片，固定，用程序性细胞死亡检测试剂盒染色。具体步骤见说明书。然后计数6个视野中的每100个细胞染色阳性的细胞数(%)。
(2)电镜观察：细胞悬液离心沉淀后以2.5%戊二醛固定，常规进行超薄切片，醋酸铀，柠檬酸铅染色后透射电镜观察。
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3.DNA凝胶电泳图谱定性
收集5×106个细胞，用2 mL细胞裂解液37℃保温1h。加入终浓度为100 μg/mL的蛋白酶K 50℃保温3h。酚： 氯仿抽提后，样品在1.4%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外光下拍照。
4.血管紧张素转换酶(ACE)活性的检测
取各孔培养液，用血清ACE(紫外法)测定试剂盒(海军总医院提供)检测ACE活性，具体步骤见说明书。
四、统计学处理
实验重复6次，所有计数资料均以均数±标准差(
±s)表示，统计学方法采用单因素多组资料的方差分析，进行F检验，两个样本率的差别统计意义检验用u检验，P<0.05有统计学意义，P<0.01有高度统计意义。, 百拇医药
结 果
一、心肌细胞存活率
各组心肌细胞存活率，见表1、表2。在表1可见，和C组比较，除A5组无显著性差别外，A1～A4组均有显著性差异(P<0.05)，甚至在A1组，心肌细胞存活率为零，均为坏死细胞，提示外源性OH-对心肌细胞生长具有明显抑制作用。
在表2中可见，M组细胞生长良好，与C组比较无显著性差别，AM1、AM2、AM3组呈剂量依赖性提高，和A组比较，分别有显著性差别(P<0.05)，提示卡托普利可降低外源性OH-对心肌细胞的生长抑制作用。
二、心肌细胞形态学观察
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在倒置相差显微镜下观察培养的心肌细胞，初为圆形或椭圆形，以后逐渐生长成梭形，继而逐渐伸出伪足，形成不规则的星形，24h绝大多数细胞都已搏动，频率为80次/min。48h心肌细胞交织成网，形成细胞单层，甚至有少量的细胞族(cluster)形成。图1在外源性OH-干预作用下，随着OH-终浓度的升高，心肌细胞搏动明显加速，至高浓度时，心肌细胞停止搏动，心肌细胞呈细长梭状，且可见漂浮在培养基中的呈圆形坏死心肌细胞(图2)。
表1 OH-诱导心肌细胞凋亡的各项指标参数 组别
(n=6)
OH-
(mol/L)
心肌细胞存活率
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心肌细胞凋亡细胞百分率
DNA “ladder”
ACE活性
(U)/2×105
8 h
16 h
24 h
8 h
16 h
24 h
对照组(C)
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0
98.3±0.6
97.9±0.6
97.5±0.8
1.1±0.2
1.4±0.7
1.9±0.6
-
3.45±0.20
凋亡组(A1)
10-1
0
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0
0
0
0
0
-
0
凋亡组(A2)
10-2
22.6±1.5*
18.4±2.8*
15.1±0.6*
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15.5±3.8*
12.4±1.4*
11.6±1.0*
-
0.24±0.06
凋亡组(A3)
10-3
76.2±3.1*
51.9±2.4*
38.3±3.5*
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22.7±1.3*
37.9±4.8*
48.5±4.1*
+
22.97±0.43
凋亡组(A4)
10-4
85.6±2.7*
79.4±3.0*
71.9±4.3*
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12.1±2.5*
16.6±3.6*
28.6±2.1*
+
15.11±0.13
凋亡组(A5)
10-5
94.6±1.1△
93.6±1.5△
91.1±1.2△
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4.6±1.4△
4.9±2.1△
6.8±0.9△
-
3.65±0.10
注：*与对照组相比较，A2、A3、A4组在心肌细胞存活率， 凋亡细胞百分率方面有显著性差异， P<0.05。△A5无显著差别，P>0.05。表2 卡托普利对OH-诱导心肌细胞凋亡影响 组别
(n=6)
OH-/cap
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mol/L/mol/L
24h心肌细胞
存活率
24h心肌细胞凋亡
细胞百分率
DNA “ladder”
ACE活性
(U)/2×105
对照组(C)
0
96.7±0.6
2.1±0.8
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-
3.45±0.20
单纯药物组(M)
0/10-5
96.4±0.9
2.3±0.4
-
0.35±0.06
凋亡组(A)
10-3/0
43.2±1.9
49.4±2.6
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+
22.97±0.43
凋亡+药物组1(AM1)
10-3/10-7
59.3±2.2*
34.9±1.4*
+
4.42±0.24
凋亡+药物组2(AM2)
10-3/10-6
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69.2±1.8*
27.3±2.6*
±
1.89±0.26
凋亡+药物组3(AM3)
10-3/10-5
85.2±1.1*
12.1±0.5*
-
0.26±0.03
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注：*药物干预各组AM1、AM2、AM3与凋亡组A比较，心肌细胞存活率和凋亡细胞百分率均有显著差别，P<0.05。
图1 正常培养的SD乳鼠心肌
细胞。(LM×400)
图2 10-2mol/L OH-干预24小时SD乳鼠心肌细胞。(LM×400)
在光镜下，心肌细胞涂片应用程序性细胞死亡检测试剂标记后，可见正常的心肌细胞呈圆形，胞浆丰满，细胞核呈青灰色，而凋亡细胞核呈棕色颗粒，坏死心肌细胞，细胞肿胀，胞膜不完整，细胞质溢出(图3)。
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在电镜下，凋亡心肌细胞呈特征性超微结构变化，如胞浆浓缩胞膜起泡，染色质浓集，凋亡小体形成等(图4)。
从表1可见，A5～A3组，心肌细胞凋亡细胞百分率呈浓度依赖性和时间依赖性增加，A2组凋亡细胞反而较A3组下降，而坏死细胞比例上升，A1组未见凋亡细胞，全为坏死细胞，提示OH-在低浓度时可诱导心肌细胞凋亡。
从表2可见，AM1、AM2、AM3组，随着卡托普利剂量增大，和A组比较凋亡百分率呈剂量依赖性减少，提示卡托普利对OH-诱导的心肌细胞凋亡有抑制作用。
三、DNA琼脂糖凝胶电泳心肌细胞凋亡定性
, http://www.100md.com 从图5中可见C、A1、A2组均未见到凋亡特有的DNA“ladder”，在A3、A4、A5组均可见DNA“ladder”，以A3组24h时最明显。A1、A2组显示为坏死膜状模糊条带。
从图6中可见，AM1～AM3组DNA“ladder”呈减弱至消失趋势，AM3未见DNA“ladder”。
图3 10-7mol/L卡托普利干预OH-处理心肌细胞，程序性细胞死亡检测试剂盒标记后。(LM×400)细胞核染为棕色的为凋亡细胞。
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图4 10-3mol/L OH-处理心肌细胞24小时，核染色
质浓集，胞膜起泡。(TEM×5 000)
图5 不同浓度OH-作用心肌细胞24小时时，DNA琼脂糖电泳图谱。
图6 卡托普利干预24小时心肌细胞DNA琼脂糖电泳图谱。
四、ACE(血管紧张素Ⅰ转换酶)活性检测
从表1中可见，和C组比较，每单位(2×105 cell)ACE活性在OH-浓度为10-5～10-3mol/L范围内，随OH-浓度升高而升高，但当OH-浓度超过10-2mol/L时，ACE活性反而下降，ACE活性有明显差异，P<0.01，提示外源性OH-在浓度为10-5～10-3mol/L范围内能激活心肌细胞肾素-血管紧张素系统(RAS)中的ACE活性。表2示，和A组比较，卡托普利药物干预各组AM1、AM2、AM3、ACE活性均有降低，并随卡托普利浓度增大而降低，ACE活性有明显差异，P<0.01，提示卡托普利对心肌细胞凋亡抑制作用与ACE活性降低有一定关系。
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讨 论
已有文献报道[7]，高浓度氧自由基对细胞的作用是导致细胞坏死，低浓度的氧自由基会导致细胞凋亡，本研究中，用不同浓度的羟自由基作用培养的心肌细胞，结果证实外源性氧自由基可诱导培养心肌细胞发生凋亡，心肌细胞呈特征性超微结构变化，以10-3 mol/L的OH-作用24h最明显，可见典型的DNA “ladder”图形，凋亡细胞百分率也最高。高浓度时则主要致使心肌细胞坏死，即细胞溶解、破裂，与Lennon等的实验结果相似。
现已证实[8，9]，当低浓度外源性羟自由基作用于心肌细胞，使细胞膜Ca2+内流增加，活化黄嘌呤氧化酶，NO合酶等酶，使内源性氧自由基浓度增加，内源性氧自由基作为细胞内信使，激活转录因子核因子κB(NF-κB)，使NF-κB与细胞核DNA结合增强，进一步激活与NF-κB相关的转录因子，通过影响基因转录，使促凋亡基因P53，Ced-3、Ced-4等上调，改变细胞表形特征，诱导细胞发生凋亡，而高浓度的外源性羟自由基作用于心肌细胞，使心肌细胞膜脂质过度氧化，膜蛋白质变性，细胞膜结构破坏，细胞肿胀，胞膜不完整，细胞质溢出，细胞坏死。
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本研究中，通过检测心肌细胞培养基中ACE活性，发现随着外源性羟自由基(OH-为10-5～10-3 mol/L)浓度升高，每单位(2×105个cell)心肌细胞ACE活性也升高，在高浓度时(OH-为10-2～10-1mol/L)，心肌细胞全坏死，ACE活性也全无，进一步证实心肌组织局部存在肾素血管紧张素系统(RAS)。ACE几乎存在于所有哺乳动物的组织和体液中，已有研究证明[10]，蛋白激酶C(PKC)可增加培养的内皮细胞ACE的活力，PKC激活剂还能促进ACE的释放，Kajstura等[11]证实，血管紧张素Ⅱ可诱导体外培养的心肌细胞凋亡，且与心肌细胞内Ca2+浓度增加，蛋白激酶C活化有关，本研究证实在低浓度OH-诱导下，心肌细胞分泌ACE活性增加，这一现象是否与心肌细胞内Ca2+浓度增加，蛋白激酶C活化等细胞内信息传导途径有关，还有待于进一步研究。至于ACE活性增加促使心肌细胞凋亡加速可能与血管紧张素Ⅱ生成增加间接促进心肌细胞凋亡有关。
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在卡托普利抗心肌细胞凋亡的实验研究中，是在OFR诱导心肌细胞凋亡的基础上，观察了卡托普利的干预作用，实验显示，在体外培养的心肌细胞中，同时加入卡托普利和OFR共孵育24h，卡托普利可阻止OH-对心肌细胞的损伤，提高心肌细胞存活率，降低细胞的凋亡率，随着卡托普利浓度的升高，DNA“梯状”图谱逐渐消失，以卡托普利10-5mol/L效果最佳，本实验还显示与对照组比较，凋亡组心肌细胞的培养液ACE活性明显增高。与凋亡组比较，随着卡托普利浓度的增高，药物干预各组心肌细胞培养液中ACE活性降低，心肌细胞存活率也提高。
业已证实[12，13]，在体及离体条件下，卡托普利对缺血再灌注(I/R)产生的OFR对心肌细胞的损伤均有保护作用。卡托普利还可改善缺血心肌代谢：Wang等[14]证实卡托普利具有升高缺血心肌组织中超氧化歧化酶(SOD)活性，升高前列环素和谷胱甘肽的含量及降低丙二醛的水平等作用，Bagchi等[15]则发现卡托普利能抑制缺血再灌注心肌丙二醛的形成和羟自由基产生。通过本实验，进一步证实卡托普利对外源性羟自由基诱导心肌细胞凋亡具有保护作用。卡托普利可对抗外源性羟自由基对细胞的损伤，减轻细胞膜脂质过氧化[16]而发挥抗心肌细胞凋亡的作用。由于卡托普利结构上含有疏基，使其具有强力的OFR清除作用，减轻自由基损伤含疏基的蛋白质和酶(如Na+、K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶等)所造成的细胞内钙超负荷，细胞内游离Ca2+浓度降低[17] ，使心肌细胞凋亡受到抑制。
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本实验研究证明，羟自由基在(10-5～10-3 mol/L)浓度范围能促进心肌细胞释放ACE，诱导心肌细胞凋亡，卡托普利能抑制由羟自由基激所致心肌细胞ACE活性增高。卡托普利对心肌细胞凋亡的保护作用，也可能是通过卡托普利抑制ACE活性，使血管紧张素Ⅱ生成减少而发挥作用。
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