MS31A位点MVR－PCR技术在法医学鉴定中的应用
http://www.100md.com
法医学杂志 2000年第1期第16卷 论著
作者：侯光伟 姜先华
单位：辽宁省刑事科学技术研究所，辽宁沈阳 110032
关键词：小卫星MS31A；MVR-PCR；个体识别
法医学杂志000108
[摘要]应用小卫星特异性引物31A、31A-A、31A-G与α-32PdCTP掺入扩增技术对MS31A(位于D7S21位点)进行MVR-PCR分析，成功地建立了一套适合于刑事案件中微量血痕、混合斑、毛发、骨组织等样品鉴定的快速、简便、准确的分析技术。灵敏度分析表明，该方法能检测出低至1ng的基因组DNA，具有较高的灵敏性。本技术在40余起强奸、凶杀等疑难案件中应用均获得成功。本研究还利用MVR数据库资料对实际案件中的犯罪嫌疑人成功地进行了筛选、排查以及串并案工作。
[中图分类号]DF795.2 [文献标识码]A
, http://www.100md.com
[文章编号]1004-5619(2000)01-0018-03
The application of minisatellite MS31A MVR- PCR digital coding technique in forensic science
Hou Guangwei,et al.
(Forensic Science Institute of Liaoning Province; Shenyang 110032,P.R.China)
Using isotope incorporate amplification technique of special 31A, 31A- A, 31A- G primers and α - 32PdCTP, the minisatellite MS31A (located at D7S21 loci) was studied . A rapid, simple,and accurate MVR- PCR technique was successfully established. The technique can be applied in individual identification minutes amples, such as blood stains, semen stains contaminated by vaginal fluid, hair and bones. The sensitivity analysis revealed that this technique could detect 1ng genoma DNA. It is also discribed about the application of the method in 40 criminal cases of rape and murder.
, 百拇医药
Key words: minisatellite MS31A MVR- PCR; individual identification
小卫星DNA变异重复制图(minisatellite variant repeat mapping)技术简称MVR-PCR，是90年代初期出现的一种新型DNA分析技术，具有高灵敏度、高识别能力，尤其适合法医学中DNA多态性分析的需要。因此,这种技术一经出现，便受到法医界众多学者的充分重视。本研究选取了多态性好的小卫星MS31A进行MVR-PCR技术应用研究工作，总结如下。
1 材料与方法
1.1 材料
30份血痕、35份混合斑样品、15份毛发(带毛根)样品及同一个体的8种不同组织样品均为实际案件检材;5份骨组织样品为自然环境条件下放置1～3年的实际案件检材。
, 百拇医药
1.2 DNA模版的提取与制备
1.2.1 血痕、肌肉等检材DNA提取
对血痕、肌肉、心、肝、脾、肺、肾、脑等检材均采用蛋白酶K消化，用酚-氯仿有机溶剂法提取DNA，详见文献[1]。
1.2.2 混合斑中精虫DNA提取
用蛋白酶K两步消化，酚-氯仿法,详见文献[2]。
1.2.3 毛发DNA提取
见文献[3]。
1.2.4 骨组织DNA提取
采用常规酚-氯仿有机溶剂法。
, 百拇医药 1.3 MS31A位点的MVR-PCR扩增
1.3.1 MS31AMVR-PCR分析引物的选择与合成
MS31A位于D7S21位点上，D7S21位点定位于7P22-pter，包括MS31A和MS31B两个小卫星，二者间隔15bp，存在两个相邻的碱基替换多态性，从5'端为G/A与C/T，其中C/T变化更具有多态性。本研究根据C/T变化设计引物进行研究。
引物序列：
31A引物：5'CCCTTTGCACGCTGGACGGTGGCG3'
31A-A引物：5'AGTGTCTGTGGGAGGTGGA3'
31A-G引物：5'AGTGTCTGTGGGAGGTGGG3'
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1.3.2 MS31A的MVR-PCR反应(a-32PdCTP直接掺入扩增法)
反应体积为25μl，设置两个反应体系(A和T)：反应液中含2.0μmol/LMgCl2、2.5μl10×buffer、0.2mmol/LdNTP、56.5μg/mlBSA、20μmol/L31A引物，DNA模板1-100ng、1.25UTaq酶(PE公司)、a-32PdCTP5uCi。在A反应体系中再加入20μmol/L31A-A引物；在T反应体系中加入20μmol/L31A-G引物。液体石蜡覆盖，置于PE-2400型DNA扩增仪运行如下程序：94℃预变性3min;94℃变性1min、68℃退火1min、70℃延伸2.5min，25个循环，最后70℃延伸10min。
1.4 扩增产物电泳分离及放射自显影
扩增产物采用中性聚丙烯酰胺凝胶(T7%，C2%)电泳分离，分离后凝胶经干燥用X光片压片进行放射自显影8～12h，即可得MVR图谱。
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1.5 MVR图谱判读方法
根据MVR-PCR图谱上A、T二条泳道中不同重复单位位置处谱带的有或无及先后顺序按如下规定进行人工判读、编码:(1)-A泳道有带，-T泳道无带，为1型，编码为1，用数字“1”和“0”表示为(1,0),；(2)-A泳道无带，-T泳道有带，为2型，编码为2,用数字“0”和“1”表示为(0,1)；(3)-A泳道有带，-T泳道有带，为3型，编码为3,用数字“1”和“1”表示为(1,1)；(4)-A泳道无带，-T泳道无带，为4型，编码为4,用数字“0”和“0”表示为(0,0)。本编码方法与文献报导的小卫星DNAMVR分析的编码方法相似，只是不考虑谱带的强弱变化，从而避免了结果判读的主观性[4]。尽管这种编码方法减少了一定的信息量，但对MVR的个体识别能力没有大的影响，而且分析结果更客观、准确。
2 结果与讨论
2.1 微量及不同时间血痕样品的MVR-PCR分析
, 百拇医药
对30份于室温干燥条件下保存1～10年不等的血痕纱布剪取1cm长的纱线进行检测，获得的MVR图谱与新鲜血液100ngDNA样品相比，在谱带出现的条数及清晰度方面无明显差异；同时发现在1～10年内，时间因素对MVR-PCR分析结果无显著的影响。灵敏度分析表明，这种技术最低检材需要量为用0.5μl血液涂制的血痕。血痕样品的MVR图谱见图1。
图1 血痕DNA的MVR图谱
数字编码为：
1:11333 11233 31231 32212 32113 33331 3221 3311
2:11213 33113 13113 12213 22213 31322 21223
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3:13223 12212 12212 23333 23123 32332 23322 22333 233
4:13313 31131 32313 33121 33331 33331 11331 33311 2
5:13323 31223 23321 32313 13132 12333 32231 33332 22211 1
2.2 混合斑样品的MVR-PCR分析
对35份实际案件混合斑样品进行分析，MVR图谱显现35～40条清晰谱带，并可准确识别混合斑中精子的个体来源。在对犯罪现场的混合斑检材进行MVR-PCR分析时，如果采用有机溶剂方法提取DNA，当检材污染较严重，尤其是当载体有红、蓝染料时，对PCR反应影响较大，对DNA提取液进行适当的纯化、脱色处理，可取得更好的分析效果。灵敏度分析证明，这种技术可获得混合斑中1ng精子DNA的MVR图谱。混合斑样品中精子的MVR图谱见图2。
, 百拇医药
图2 混合斑中精子DNA的MVR图谱
数字编码为：
1：23111 33131 21131 13131 33333 11331 11211 33111 112
2：22333 21313 32131 33321 33233 33133 12122 13333
2.3 毛发(带毛根)、骨组织样品的MVR-PCR分析
对15份单根毛发(带毛根)进行MVR-PCR，MVR图谱可显现近40条清晰谱带。在进行毛发样品分析时，为取得较好的效果，PCR反应时应将提取的单根毛发DNA样品一次全部投入。对5份骨组织样品分析，同样取得了满意的结果。毛发、骨组织样品的MVR图谱见图3。
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图3 毛发、骨组织DNA的MVR图谱1:毛发2:骨组织
毛发：23111 33113 33321 11312 11331 33113 11121 11211 11313
骨组织:23113 11312 11313 33321 12233 33331 33133 33112 33331 11
2.4 同一个体不同组织的MVR-PCR分析
检测同一个体肌肉、心、肝、脾、肺、肾、大脑、骨8种不同组织，所得MVR图谱数字编码完全相同，表明小卫星MS31A具有组织同一性，可以进行个体识别。
2.5 DNA提取方法对MVR-PCR分析的影响
本文比较了酚/氯仿有机溶剂提取方法与Chelex-100提取方法对MVR-PCR分析结果的影响，发现有机溶剂法所获得DNA的MVR图谱大分子片段区域比Chelex-100提取方法能增加5～6条谱带，提示酚/氯仿有机溶剂提取方法更适合这种技术。
, 百拇医药
2.6 小卫星MS31A的MVR-PCR技术在法医学鉴定中的应用
应用本项技术对45起刑事案件生物物证进行鉴定，涉及物证包括血痕、混合斑、毛发及骨组织，认定罪犯9人，否定230人。在物证中有微量血痕20例，量最少为4mm×4mm,载体有纱布、布料、石头及金属等，经检测均得出明确结论；混合斑35例，载体有纱布、棉球、布料等，时间1～4年不等，均得出准确结果；毛发15份,认定2份，否定13份；骨组织5份，均否定。
案例1：1996年某地发生一起杀人案，提取死者阴道的混合斑，用MVR-PCR分析技术对混合斑中的精子进行分析，所得MVR图谱显现35条谱带，编码后输入计算机。之后，对先后送检的40余名犯罪嫌疑人逐一排查，发现嫌疑人王某血液与现场精虫的MVR图谱相同，经计算偶合机率为1.2×10-15,从而认定王某即为犯罪人。对此案我们又经2个VNTR位点、4个STR位点复核，均支持MVR-PCR分析的结果，但其偶合机率为2.1×10-4，其识别能力远远低于MVR-PCR技术,同时检材使用量增至MVR-PCR法的6倍，工作量大大增加。
, 百拇医药
案例2:1997年某市发生一起杀人案，提取嫌疑人穿的墨绿色上衣一件，在上衣的前襟发现有一块约4×4mm的血斑，经MVR-PCR分析，该血痕MVR图谱显现34条谱带，与死者血纱布完全相同，从而认定这名嫌疑人就是犯罪人。后来，从罪犯家中搜出其作案的凶器，该罪犯在证据面前对犯罪事实供认不讳，此案告破。
2.7 MVR数据库资料在实际案件中的应用
我们利用计算机分析MVR数据库资料，成功地检索、排查了30起案件的嫌疑人，其中1例共排查48名犯罪嫌疑人，最终认定了罪犯。
总之，本研究建立的小卫星MS31A的MVR-PCR分析技术具有高灵敏度、高识别能力，完全适合于个体识别鉴定。同时，由于这项技术操作快速、简便，很容易向市县级公安部门推广，具有广阔的应用前景。
参考文献:
, 百拇医药
[1]姜先华,等.PCR扩增ZFX/ZFY基因鉴定人类干血痕的性别[J].中国法医学杂志,1993,8(4):197-220.
[2]姜先华,等.PCR法对HLA-DQa基因分型及在性犯罪鉴定中的应用[J].中国法医学杂志,1991,6(3):136.
[3]姜先华,等.线粒体DNA测序分析技术及其在毛干犯罪物证鉴定中的应用[C].中国刑事科学技术学会首届学术研讨会论文汇编,1996,245-252.
[4]Jeffreys AJ,et al.Minisatellite repeat coding as a digital approach to DNA typing[J].Nature，1991，354:204-230.
(收稿日期：1998-09-16 修回日期：1999-05-18), 百拇医药
单位：辽宁省刑事科学技术研究所，辽宁沈阳 110032
关键词：小卫星MS31A；MVR-PCR；个体识别
法医学杂志000108
[摘要]应用小卫星特异性引物31A、31A-A、31A-G与α-32PdCTP掺入扩增技术对MS31A(位于D7S21位点)进行MVR-PCR分析，成功地建立了一套适合于刑事案件中微量血痕、混合斑、毛发、骨组织等样品鉴定的快速、简便、准确的分析技术。灵敏度分析表明，该方法能检测出低至1ng的基因组DNA，具有较高的灵敏性。本技术在40余起强奸、凶杀等疑难案件中应用均获得成功。本研究还利用MVR数据库资料对实际案件中的犯罪嫌疑人成功地进行了筛选、排查以及串并案工作。
[中图分类号]DF795.2 [文献标识码]A
, http://www.100md.com
[文章编号]1004-5619(2000)01-0018-03
The application of minisatellite MS31A MVR- PCR digital coding technique in forensic science
Hou Guangwei,et al.
(Forensic Science Institute of Liaoning Province; Shenyang 110032,P.R.China)
Using isotope incorporate amplification technique of special 31A, 31A- A, 31A- G primers and α - 32PdCTP, the minisatellite MS31A (located at D7S21 loci) was studied . A rapid, simple,and accurate MVR- PCR technique was successfully established. The technique can be applied in individual identification minutes amples, such as blood stains, semen stains contaminated by vaginal fluid, hair and bones. The sensitivity analysis revealed that this technique could detect 1ng genoma DNA. It is also discribed about the application of the method in 40 criminal cases of rape and murder.
, 百拇医药
Key words: minisatellite MS31A MVR- PCR; individual identification
小卫星DNA变异重复制图(minisatellite variant repeat mapping)技术简称MVR-PCR，是90年代初期出现的一种新型DNA分析技术，具有高灵敏度、高识别能力，尤其适合法医学中DNA多态性分析的需要。因此,这种技术一经出现，便受到法医界众多学者的充分重视。本研究选取了多态性好的小卫星MS31A进行MVR-PCR技术应用研究工作，总结如下。
1 材料与方法
1.1 材料
30份血痕、35份混合斑样品、15份毛发(带毛根)样品及同一个体的8种不同组织样品均为实际案件检材;5份骨组织样品为自然环境条件下放置1～3年的实际案件检材。
, 百拇医药
1.2 DNA模版的提取与制备
1.2.1 血痕、肌肉等检材DNA提取
对血痕、肌肉、心、肝、脾、肺、肾、脑等检材均采用蛋白酶K消化，用酚-氯仿有机溶剂法提取DNA，详见文献[1]。
1.2.2 混合斑中精虫DNA提取
用蛋白酶K两步消化，酚-氯仿法,详见文献[2]。
1.2.3 毛发DNA提取
见文献[3]。
1.2.4 骨组织DNA提取
采用常规酚-氯仿有机溶剂法。
, 百拇医药 1.3 MS31A位点的MVR-PCR扩增
1.3.1 MS31AMVR-PCR分析引物的选择与合成
MS31A位于D7S21位点上，D7S21位点定位于7P22-pter，包括MS31A和MS31B两个小卫星，二者间隔15bp，存在两个相邻的碱基替换多态性，从5'端为G/A与C/T，其中C/T变化更具有多态性。本研究根据C/T变化设计引物进行研究。
引物序列：
31A引物：5'CCCTTTGCACGCTGGACGGTGGCG3'
31A-A引物：5'AGTGTCTGTGGGAGGTGGA3'
31A-G引物：5'AGTGTCTGTGGGAGGTGGG3'
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1.3.2 MS31A的MVR-PCR反应(a-32PdCTP直接掺入扩增法)
反应体积为25μl，设置两个反应体系(A和T)：反应液中含2.0μmol/LMgCl2、2.5μl10×buffer、0.2mmol/LdNTP、56.5μg/mlBSA、20μmol/L31A引物，DNA模板1-100ng、1.25UTaq酶(PE公司)、a-32PdCTP5uCi。在A反应体系中再加入20μmol/L31A-A引物；在T反应体系中加入20μmol/L31A-G引物。液体石蜡覆盖，置于PE-2400型DNA扩增仪运行如下程序：94℃预变性3min;94℃变性1min、68℃退火1min、70℃延伸2.5min，25个循环，最后70℃延伸10min。
1.4 扩增产物电泳分离及放射自显影
扩增产物采用中性聚丙烯酰胺凝胶(T7%，C2%)电泳分离，分离后凝胶经干燥用X光片压片进行放射自显影8～12h，即可得MVR图谱。
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1.5 MVR图谱判读方法
根据MVR-PCR图谱上A、T二条泳道中不同重复单位位置处谱带的有或无及先后顺序按如下规定进行人工判读、编码:(1)-A泳道有带，-T泳道无带，为1型，编码为1，用数字“1”和“0”表示为(1,0),；(2)-A泳道无带，-T泳道有带，为2型，编码为2,用数字“0”和“1”表示为(0,1)；(3)-A泳道有带，-T泳道有带，为3型，编码为3,用数字“1”和“1”表示为(1,1)；(4)-A泳道无带，-T泳道无带，为4型，编码为4,用数字“0”和“0”表示为(0,0)。本编码方法与文献报导的小卫星DNAMVR分析的编码方法相似，只是不考虑谱带的强弱变化，从而避免了结果判读的主观性[4]。尽管这种编码方法减少了一定的信息量，但对MVR的个体识别能力没有大的影响，而且分析结果更客观、准确。
2 结果与讨论
2.1 微量及不同时间血痕样品的MVR-PCR分析
, 百拇医药
对30份于室温干燥条件下保存1～10年不等的血痕纱布剪取1cm长的纱线进行检测，获得的MVR图谱与新鲜血液100ngDNA样品相比，在谱带出现的条数及清晰度方面无明显差异；同时发现在1～10年内，时间因素对MVR-PCR分析结果无显著的影响。灵敏度分析表明，这种技术最低检材需要量为用0.5μl血液涂制的血痕。血痕样品的MVR图谱见图1。
图1 血痕DNA的MVR图谱
数字编码为：
1:11333 11233 31231 32212 32113 33331 3221 3311
2:11213 33113 13113 12213 22213 31322 21223
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3:13223 12212 12212 23333 23123 32332 23322 22333 233
4:13313 31131 32313 33121 33331 33331 11331 33311 2
5:13323 31223 23321 32313 13132 12333 32231 33332 22211 1
2.2 混合斑样品的MVR-PCR分析
对35份实际案件混合斑样品进行分析，MVR图谱显现35～40条清晰谱带，并可准确识别混合斑中精子的个体来源。在对犯罪现场的混合斑检材进行MVR-PCR分析时，如果采用有机溶剂方法提取DNA，当检材污染较严重，尤其是当载体有红、蓝染料时，对PCR反应影响较大，对DNA提取液进行适当的纯化、脱色处理，可取得更好的分析效果。灵敏度分析证明，这种技术可获得混合斑中1ng精子DNA的MVR图谱。混合斑样品中精子的MVR图谱见图2。
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图2 混合斑中精子DNA的MVR图谱
数字编码为：
1：23111 33131 21131 13131 33333 11331 11211 33111 112
2：22333 21313 32131 33321 33233 33133 12122 13333
2.3 毛发(带毛根)、骨组织样品的MVR-PCR分析
对15份单根毛发(带毛根)进行MVR-PCR，MVR图谱可显现近40条清晰谱带。在进行毛发样品分析时，为取得较好的效果，PCR反应时应将提取的单根毛发DNA样品一次全部投入。对5份骨组织样品分析，同样取得了满意的结果。毛发、骨组织样品的MVR图谱见图3。
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图3 毛发、骨组织DNA的MVR图谱1:毛发2:骨组织
毛发：23111 33113 33321 11312 11331 33113 11121 11211 11313
骨组织:23113 11312 11313 33321 12233 33331 33133 33112 33331 11
2.4 同一个体不同组织的MVR-PCR分析
检测同一个体肌肉、心、肝、脾、肺、肾、大脑、骨8种不同组织，所得MVR图谱数字编码完全相同，表明小卫星MS31A具有组织同一性，可以进行个体识别。
2.5 DNA提取方法对MVR-PCR分析的影响
本文比较了酚/氯仿有机溶剂提取方法与Chelex-100提取方法对MVR-PCR分析结果的影响，发现有机溶剂法所获得DNA的MVR图谱大分子片段区域比Chelex-100提取方法能增加5～6条谱带，提示酚/氯仿有机溶剂提取方法更适合这种技术。
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2.6 小卫星MS31A的MVR-PCR技术在法医学鉴定中的应用
应用本项技术对45起刑事案件生物物证进行鉴定，涉及物证包括血痕、混合斑、毛发及骨组织，认定罪犯9人，否定230人。在物证中有微量血痕20例，量最少为4mm×4mm,载体有纱布、布料、石头及金属等，经检测均得出明确结论；混合斑35例，载体有纱布、棉球、布料等，时间1～4年不等，均得出准确结果；毛发15份,认定2份，否定13份；骨组织5份，均否定。
案例1：1996年某地发生一起杀人案，提取死者阴道的混合斑，用MVR-PCR分析技术对混合斑中的精子进行分析，所得MVR图谱显现35条谱带，编码后输入计算机。之后，对先后送检的40余名犯罪嫌疑人逐一排查，发现嫌疑人王某血液与现场精虫的MVR图谱相同，经计算偶合机率为1.2×10-15,从而认定王某即为犯罪人。对此案我们又经2个VNTR位点、4个STR位点复核，均支持MVR-PCR分析的结果，但其偶合机率为2.1×10-4，其识别能力远远低于MVR-PCR技术,同时检材使用量增至MVR-PCR法的6倍，工作量大大增加。
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案例2:1997年某市发生一起杀人案，提取嫌疑人穿的墨绿色上衣一件，在上衣的前襟发现有一块约4×4mm的血斑，经MVR-PCR分析，该血痕MVR图谱显现34条谱带，与死者血纱布完全相同，从而认定这名嫌疑人就是犯罪人。后来，从罪犯家中搜出其作案的凶器，该罪犯在证据面前对犯罪事实供认不讳，此案告破。
2.7 MVR数据库资料在实际案件中的应用
我们利用计算机分析MVR数据库资料，成功地检索、排查了30起案件的嫌疑人，其中1例共排查48名犯罪嫌疑人，最终认定了罪犯。
总之，本研究建立的小卫星MS31A的MVR-PCR分析技术具有高灵敏度、高识别能力，完全适合于个体识别鉴定。同时，由于这项技术操作快速、简便，很容易向市县级公安部门推广，具有广阔的应用前景。
参考文献:
, 百拇医药
[1]姜先华,等.PCR扩增ZFX/ZFY基因鉴定人类干血痕的性别[J].中国法医学杂志,1993,8(4):197-220.
[2]姜先华,等.PCR法对HLA-DQa基因分型及在性犯罪鉴定中的应用[J].中国法医学杂志,1991,6(3):136.
[3]姜先华,等.线粒体DNA测序分析技术及其在毛干犯罪物证鉴定中的应用[C].中国刑事科学技术学会首届学术研讨会论文汇编,1996,245-252.
[4]Jeffreys AJ,et al.Minisatellite repeat coding as a digital approach to DNA typing[J].Nature，1991，354:204-230.
(收稿日期：1998-09-16 修回日期：1999-05-18), 百拇医药