急性肾功能衰竭与内皮素-1关系的电镜免疫组化观察
作者：王晓虹 梁延杰 陆江阳 李玲 杨毅
单位：解放军304医院病理智科，北京 100037
关键词：急性肾功能衰竭；免疫电镜；内皮素-1
军医进修学院学报000112摘 要：目的：探讨ET-1 在ARF发病机制中的作用。方法：甘油肌注法复制成大鼠ARF模型，免疫电镜技术动态观察ET-1 在超微水平的分布与变化。结果：ARF大鼠肾小管上皮及其线粒体中ET-1 含量明显增加，且与肾组织病变程度呈正相关。结论：肾小管上皮细胞中ET-1 持续增多是导致肾小管坏死的重要原因，提示ET-1 与ARF发病机制中有重要联系。
中图号：R392.3 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0036-38
, 百拇医药
Observation of immunohistochemistry and immunoelectron-microscopy
of ET-1 in acute renal failure
WANG Xiao-hong,LIANG Yan-jie,LU Jiang-yang,LI Ling,YANG Yi
(Department of Pathology, PLA 304th Hospital, Beijing 100037,China)
Abstract：Objective：To explore the effects of Endothelin-1 (ET-1) on acute renal failure (ARF).Methods：A model of ARF was done by injecting glycerol into the muscle of Wistar rats. We utilized immnohistochemistry and immunoelectronmicroscopy method at ultrastructure level in observation of the distribution and content of ET-1 in kidney of ARF rats.Results：ET-1 content in ARF rats was increased, most of ET-1 particles were distributed with plasma and mitochondria of renal tubular epithelial cells and at same time there were serious pathology changes. Conclusion：The maintain increase of ET-1 content is an important cause of renal tubular necrosis in ARF. It is suggested that ET-1 take part in the mechanism of ARF.
, 百拇医药
Key words：acute renal failure;immunoelectronmicroscopy; endothelin-1▲
内皮素(endothelin-1， ET-1)在急性肾功能衰竭(acute renal failure, ARF)发病机制中的作用，近年来已受到重视。但迄今在ARF的研究中尚未见有关ET-1 在亚细胞水平定位及定量分析的报告。笔者用肌注甘油复制大鼠ARF模型，在超微水平动态观察了肾组织中ET-1 的分布与含量变化，对ET-1 在ARF发病中的作用做了进一步的探讨。
1 材料和方法
1.1 分组 雄性健康Wistar大鼠80只，体重180～250g。①实验组64只，1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d各8只，共8组。②对照组16只，盐水与正常对照组各8只。
, 百拇医药 1.2 实验 实验鼠伤前禁水16h，将医用甘油与生理盐水等量混合液无菌肌注左后肢内侧(1ml/100g体重)。同法注射等量生理盐水作对照。正常对照组不作注射。各组按时相收集尿液做ET-1检测，并于左心室抽血作肾功能及ET-1检查，然后断头处死。取右肾即刻液氮保存，做肾组织匀浆ET-1放免检测。每组大鼠取左肾皮质做光镜、电镜制片及免疫组化标记。电镜免疫胶体金标记步骤：①8%高碘酸钠溶液腐蚀15min；②双蒸水浸洗5min，0.5mol/LTBS(pH7.4，含0.5%TritonX-100)浸洗10min；③3%卵蛋白封闭15min；④兔抗大鼠ET-1抗血清(北京医科大学心肺内分泌研究室提供)1∶200，4℃20h，加室温2h孵育；替代对照样品用0.05mol/LTBS液取代一抗。⑤0.05mol/LTBS和0.02mol/LTBS液(pH7.5，含0.1%PSA)分别浸洗5min；⑥3%卵蛋白再次封闭15min；⑦胶体金标记葡萄球菌蛋白A，(PAG，军事医学科学院基础所提供)10nm，1∶10，37℃1h；⑧0.02mol/LTBS浸洗10min，0.05mol/LTBS与双蒸水各浸洗5min；⑨醋酸铀染色10min，枸橼酸铅染色5min；10JEM-1200EX电镜观察，计数各组每4万倍视野胶体金颗粒数。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 肾功能改变 见表1。
表1 肾功能改变(
±s，C/mmol.L-1)
实 验 组
对 照 组
1h
3h
6h
12h
24h
48h
, 百拇医药
72h
7d
盐水
正常
BCr
86.85**
±11.62
154.41**
±13.45
163.99**
±16.28
182.48**
, 百拇医药
±13.14
210.44**
±16.12##
195.08**
±19.45
190.46**
±17.79**
53.19
±21.27
50.11
±11.30
, 百拇医药
48.33
±14.10
BBuN
10.80**
±1.02
19.93**
±0.93
20.63**
±0.73
21.63**
±0.79
, 百拇医药 24.07**
±1.08##
21.78**
±1.29
21.29**
±1.13
7.72
±0.75
5.33
±0.90
5.21
±0.82
, http://www.100md.com
与正常对照组比较*P<0.05，**P<0.01；
与盐水对照组比较△P<0.05，△△P<0.01
2.2 放免测定内皮素含量 见表2。
表2 放免测定内皮素含量(±s)
实 验 组
正常对照组
1h
3h
24h
, 百拇医药
72h
7d
血浆ET-1
(pg/ml)
163.95**
±15.57
146.06**
±14.36
138.63**
±15.26
105.50*
, 百拇医药
±13.38
123.11
±16.38
125.25
±14.56
尿ET-1
(pg/24h)
—
—
1450.71**
±58.67
694.58**
, http://www.100md.com
±33.13
607.63
±40.73
618.16
±39.62
肾组织ET-1
(pg/mg)
17.26**
±2.17
39.36**
±3.17
6.99**
, http://www.100md.com
±2.82
7.10
±2.71
5.12
±1.80
6.41
±1.73
与正常对照组比较*P<0.05；**P<0.01
2.3 病理形态学观察
2.3.1 实验鼠伤后1～2h，肾小管上皮呈浊肿、透明变性及空泡变性。电镜见肾小球足细胞水肿。24～48h，肾小管呈明显的斑片状或条带状坏死，管腔内多量肌红蛋白管型，残存的肾小管代偿扩张；电镜见毛细血管内皮饮泡增多，足细胞胞体增大、足突融合。72h～7d，病变减轻，肾小管坏死区出现钙化灶，并见肾小管再生现象。
, http://www.100md.com
2.3.2 光镜ET-1免疫组化染色 对照组肾组织中ET-1主要分布在远曲小管和集合管上皮细胞，呈棕黄色颗粒状；近曲小管上皮可见的少量淡黄色细颗粒；部分肾小球系膜细胞和球囊上皮细胞胞浆中亦见稀疏的棕黄色颗粒；少数肾间质血管内皮细胞及血管壁平滑肌中也含有棕黄色颗粒。实验组ET-1的含量变化主要表现在肾小管上皮。伤后1～12h组(早期)，远曲小管和集合管上皮ET-1呈强阳性反应，而近曲小管上皮则呈弱阳性反应；伤后24～48h组(中期)，远曲小管、集合管、近曲小管上皮ET-1均呈强阳性反应；72h～7d组(后期)，远曲小管和集合管上皮ET-1阳性反应减弱，近曲小管上皮反应强度接近正常组。
2.3.3 电镜ET-1免疫胶体金标记 见表3。
表3 免疫胶体金颗粒数(±s)
实 验 组
, http://www.100md.com
正 常
对照组
3h
24h
72h
7d
远曲小管
上皮细胞
23.72**
±6.11
21.92**
±7.21
, 百拇医药 19.30*
±5.44
16.62
±8.30
17.90
±5.07
近曲小管
上皮细胞
16.66**
±5.133
18.82**
±6.89
, http://www.100md.com
17.10*
±7.66
13.19
±9.98
14.30
±6.88
对照组见高电子密度的内皮素-胶体金颗粒成簇或单个散在分布于肾小管上皮、肾小球毛细血管内皮、系膜细胞、足细胞及肾小球囊上皮细胞中。其中远曲小管和集合管含量最多，近曲小管含量较少。金颗粒主要分布于胞浆及线粒体基质内，也见于高尔基复合体和部分溶酶体中，在细胞核内也见较多金颗粒分布在异染色质与核仁上。实验早、中期，远曲小管与集合管上皮及其线粒体基质内金颗粒数均明显增多(附图)；实验中期，近曲小管上皮中金颗粒数也明显增多。
, 百拇医药
附图 伤后3h组
肿胀的远曲小管上皮细胞线粒体中见较多成簇分布的致密金颗粒沉积 EM-PAG×3000
3 讨 论
ET-1是1998年日本学者发现的一种新的血管活性肽，具有强大的缩血管作用[1]。最初认为ET-1是由内皮细胞合成和释放的，但随后大量的实验证明，ET-1还可由非内皮细胞产生。原位杂交技术及免疫组化技术证明：肾小管上皮为分泌具有免疫活性ET-1的另一来源[2]。
作者曾报道甘油致大鼠ARF模型及内皮素在ARF发病中的作用[3]。电镜免疫组化研究进一步显示，标记有ET-1的胶体金颗粒多定位于细胞线粒体和细胞核中，表明ET-1的分布与Ca2+的分布特点有一定关系；而细胞核内所显示的ET-1，是ET-1在核内翻译和转录的结果[4，5]。在实验早、中期肾远曲小管与集合管中ET-1含量增加，尤以早期的3h组为著，表明肾组织遭受缺血等因素作用之初，就需要大量的ET-1参与血浆ET-1水平的调节并维持肾循环功能。提示远曲小管和集合管可能是肾内合成、分泌ET-1的重要场所；实验中期近曲小管上皮ET-1含量也有增加，这可能是近曲小管对滤液中ET-1的重吸收造成的。我们认为ET-1在ARF发病中的作用机制表现在以下两个方面：①间接作用：当肌注甘油致使大鼠股部肌肉变性坏死并造成大量血浆外渗形成水肿时，全身循环血量包括肾血流量减少，而这种缺血性改变又反射性地促使ET-1合成、分泌增加，ET-1大量入血引起血管收缩以维持循环血量。但是在致伤因素未除、又未做积极治疗的情况下，血浆中高浓度的ET-1对血管，尤其是对肾血管的持续收缩作用，势必会进一步加重肾组织缺血，造成更严重的病理改变与肾功能障碍。本实验继1h组血浆ET-1达到高峰值后，所有肾功能与形态学改变都明显的加重。提示ET-1通过收缩血管使肾组织低灌流造成损伤。②直接作用：ET-1一般是通过Ca2+的介导对细胞发生作用的。血浆ET-1可促使细胞外Ca2+内流，细胞浆中较高浓度的ET-1又驱使并协同大量Ca2+进入线粒体，即：超量的ET-1可导致线粒体钙过载，进而引起线粒体肿胀、变性和细胞坏死、钙化[6～8]。当血浆与肾小管滤液中ET-1浓度过度增高时，可促使大量细胞外钙离子伴随ET-1进入肾小管上皮，加之肾小管上皮本身合成或重吸收大量的ET-1，就会引起细胞及其线粒体钙过载。结果表明肾小管上皮细胞中ET-1含量增多，是导致肾小管上皮坏死的重要原因。■
, http://www.100md.com
基金项目：“八五”军队科研基金项目(91Z005)；
作者简介：王晓虹，女，1949-03-06生，湖北阳新县，1994年军医进修学院硕士毕业，病理科副主任医师，科室副主任；发表论文23篇。电话：(010)66867438
参考文献：
[1]Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endotheliel cells [J]. Nature (Lond), 1988,322:411-414.
[2]Shichiri M, Hirata Y, Emori T et al. Secretion of endothelin and related peptides from renal epithelial cell lies [J]. FEBS Lett, 1989,253：203-206.
, 百拇医药
[3]王晓虹，梁延杰，陆江阳等.内皮素在急性肾功能衰竭发病中的作用[J].解放军医学杂志，1999，24：43-45.
[4]Nunez DJR, Brown MJ, Daveport AP et al. Endothelin-1 mRNA is widely expressed in porcine and human tissues [J]. J Clin Invest, 1990,85:1537-1541.
[5]Battistini B, Chailler P, D′orleans-Justep et al. Growth regulatatory properties of endothelins [J]. Peptides, 1993,14:385-389.
[6]Goto K, Kasuya Y, Mastuki N et al. Endothelin activates the dihydropyridine-sensitive, voltage-dependent Ca2+ channel in vascular smooth muscle [J]. Physiological Sciences, 1989,86:3915-3920.
, http://www.100md.com
[7]Mitsuhashi T, Morris RC Jr, Ives HE et al. Endothelin-induced increases in vascular smooth muscle Ca2+ do not depend on dihydropyridine-sensitive Ca2+ channels [J]. J Clin Invest， 1989,84:635-639.
[8]Hirata Y, Yoshimi H, Takata S et al. Cellular mechanism of action by a novel vasocons-trictor endothelin in cultured rat vascular smooth muscle cells [J]. Biochem Biophys Res Commun， 1988,154:868-872.
[9]Mino N, Kobayashi M, Nakajima A et al. Protective effect of a selective endothelin receptor antagonist, BQ-123, inischemic acute renal failure in rats [J]. Eur Pharmacol， 1992,221:77-82.
收稿日期：1999-07-12
改回日期：1999-08-10, 百拇医药
单位：解放军304医院病理智科，北京 100037
关键词：急性肾功能衰竭；免疫电镜；内皮素-1
军医进修学院学报000112摘 要：目的：探讨ET-1 在ARF发病机制中的作用。方法：甘油肌注法复制成大鼠ARF模型，免疫电镜技术动态观察ET-1 在超微水平的分布与变化。结果：ARF大鼠肾小管上皮及其线粒体中ET-1 含量明显增加，且与肾组织病变程度呈正相关。结论：肾小管上皮细胞中ET-1 持续增多是导致肾小管坏死的重要原因，提示ET-1 与ARF发病机制中有重要联系。
中图号：R392.3 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0036-38
, 百拇医药
Observation of immunohistochemistry and immunoelectron-microscopy
of ET-1 in acute renal failure
WANG Xiao-hong,LIANG Yan-jie,LU Jiang-yang,LI Ling,YANG Yi
(Department of Pathology, PLA 304th Hospital, Beijing 100037,China)
Abstract：Objective：To explore the effects of Endothelin-1 (ET-1) on acute renal failure (ARF).Methods：A model of ARF was done by injecting glycerol into the muscle of Wistar rats. We utilized immnohistochemistry and immunoelectronmicroscopy method at ultrastructure level in observation of the distribution and content of ET-1 in kidney of ARF rats.Results：ET-1 content in ARF rats was increased, most of ET-1 particles were distributed with plasma and mitochondria of renal tubular epithelial cells and at same time there were serious pathology changes. Conclusion：The maintain increase of ET-1 content is an important cause of renal tubular necrosis in ARF. It is suggested that ET-1 take part in the mechanism of ARF.
, 百拇医药
Key words：acute renal failure;immunoelectronmicroscopy; endothelin-1▲
内皮素(endothelin-1， ET-1)在急性肾功能衰竭(acute renal failure, ARF)发病机制中的作用，近年来已受到重视。但迄今在ARF的研究中尚未见有关ET-1 在亚细胞水平定位及定量分析的报告。笔者用肌注甘油复制大鼠ARF模型，在超微水平动态观察了肾组织中ET-1 的分布与含量变化，对ET-1 在ARF发病中的作用做了进一步的探讨。
1 材料和方法
1.1 分组 雄性健康Wistar大鼠80只，体重180～250g。①实验组64只，1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d各8只，共8组。②对照组16只，盐水与正常对照组各8只。
, 百拇医药 1.2 实验 实验鼠伤前禁水16h，将医用甘油与生理盐水等量混合液无菌肌注左后肢内侧(1ml/100g体重)。同法注射等量生理盐水作对照。正常对照组不作注射。各组按时相收集尿液做ET-1检测，并于左心室抽血作肾功能及ET-1检查，然后断头处死。取右肾即刻液氮保存，做肾组织匀浆ET-1放免检测。每组大鼠取左肾皮质做光镜、电镜制片及免疫组化标记。电镜免疫胶体金标记步骤：①8%高碘酸钠溶液腐蚀15min；②双蒸水浸洗5min，0.5mol/LTBS(pH7.4，含0.5%TritonX-100)浸洗10min；③3%卵蛋白封闭15min；④兔抗大鼠ET-1抗血清(北京医科大学心肺内分泌研究室提供)1∶200，4℃20h，加室温2h孵育；替代对照样品用0.05mol/LTBS液取代一抗。⑤0.05mol/LTBS和0.02mol/LTBS液(pH7.5，含0.1%PSA)分别浸洗5min；⑥3%卵蛋白再次封闭15min；⑦胶体金标记葡萄球菌蛋白A，(PAG，军事医学科学院基础所提供)10nm，1∶10，37℃1h；⑧0.02mol/LTBS浸洗10min，0.05mol/LTBS与双蒸水各浸洗5min；⑨醋酸铀染色10min，枸橼酸铅染色5min；10JEM-1200EX电镜观察，计数各组每4万倍视野胶体金颗粒数。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 肾功能改变 见表1。
表1 肾功能改变(
±s，C/mmol.L-1)实 验 组
对 照 组
1h
3h
6h
12h
24h
48h
, 百拇医药
72h
7d
盐水
正常
BCr
86.85**
±11.62
154.41**
±13.45
163.99**
±16.28
182.48**
, 百拇医药
±13.14
210.44**
±16.12##
195.08**
±19.45
190.46**
±17.79**
53.19
±21.27
50.11
±11.30
, 百拇医药
48.33
±14.10
BBuN
10.80**
±1.02
19.93**
±0.93
20.63**
±0.73
21.63**
±0.79
, 百拇医药 24.07**
±1.08##
21.78**
±1.29
21.29**
±1.13
7.72
±0.75
5.33
±0.90
5.21
±0.82
, http://www.100md.com
与正常对照组比较*P<0.05，**P<0.01；
与盐水对照组比较△P<0.05，△△P<0.01
2.2 放免测定内皮素含量 见表2。
表2 放免测定内皮素含量(
±s)实 验 组
正常对照组
1h
3h
24h
, 百拇医药
72h
7d
血浆ET-1
(pg/ml)
163.95**
±15.57
146.06**
±14.36
138.63**
±15.26
105.50*
, 百拇医药
±13.38
123.11
±16.38
125.25
±14.56
尿ET-1
(pg/24h)
—
—
1450.71**
±58.67
694.58**
, http://www.100md.com
±33.13
607.63
±40.73
618.16
±39.62
肾组织ET-1
(pg/mg)
17.26**
±2.17
39.36**
±3.17
6.99**
, http://www.100md.com
±2.82
7.10
±2.71
5.12
±1.80
6.41
±1.73
与正常对照组比较*P<0.05；**P<0.01
2.3 病理形态学观察
2.3.1 实验鼠伤后1～2h，肾小管上皮呈浊肿、透明变性及空泡变性。电镜见肾小球足细胞水肿。24～48h，肾小管呈明显的斑片状或条带状坏死，管腔内多量肌红蛋白管型，残存的肾小管代偿扩张；电镜见毛细血管内皮饮泡增多，足细胞胞体增大、足突融合。72h～7d，病变减轻，肾小管坏死区出现钙化灶，并见肾小管再生现象。
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2.3.2 光镜ET-1免疫组化染色 对照组肾组织中ET-1主要分布在远曲小管和集合管上皮细胞，呈棕黄色颗粒状；近曲小管上皮可见的少量淡黄色细颗粒；部分肾小球系膜细胞和球囊上皮细胞胞浆中亦见稀疏的棕黄色颗粒；少数肾间质血管内皮细胞及血管壁平滑肌中也含有棕黄色颗粒。实验组ET-1的含量变化主要表现在肾小管上皮。伤后1～12h组(早期)，远曲小管和集合管上皮ET-1呈强阳性反应，而近曲小管上皮则呈弱阳性反应；伤后24～48h组(中期)，远曲小管、集合管、近曲小管上皮ET-1均呈强阳性反应；72h～7d组(后期)，远曲小管和集合管上皮ET-1阳性反应减弱，近曲小管上皮反应强度接近正常组。
2.3.3 电镜ET-1免疫胶体金标记 见表3。
表3 免疫胶体金颗粒数(
±s)实 验 组
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正 常
对照组
3h
24h
72h
7d
远曲小管
上皮细胞
23.72**
±6.11
21.92**
±7.21
, 百拇医药 19.30*
±5.44
16.62
±8.30
17.90
±5.07
近曲小管
上皮细胞
16.66**
±5.133
18.82**
±6.89
, http://www.100md.com
17.10*
±7.66
13.19
±9.98
14.30
±6.88
对照组见高电子密度的内皮素-胶体金颗粒成簇或单个散在分布于肾小管上皮、肾小球毛细血管内皮、系膜细胞、足细胞及肾小球囊上皮细胞中。其中远曲小管和集合管含量最多，近曲小管含量较少。金颗粒主要分布于胞浆及线粒体基质内，也见于高尔基复合体和部分溶酶体中，在细胞核内也见较多金颗粒分布在异染色质与核仁上。实验早、中期，远曲小管与集合管上皮及其线粒体基质内金颗粒数均明显增多(附图)；实验中期，近曲小管上皮中金颗粒数也明显增多。
, 百拇医药
附图 伤后3h组
肿胀的远曲小管上皮细胞线粒体中见较多成簇分布的致密金颗粒沉积 EM-PAG×3000
3 讨 论
ET-1是1998年日本学者发现的一种新的血管活性肽，具有强大的缩血管作用[1]。最初认为ET-1是由内皮细胞合成和释放的，但随后大量的实验证明，ET-1还可由非内皮细胞产生。原位杂交技术及免疫组化技术证明：肾小管上皮为分泌具有免疫活性ET-1的另一来源[2]。
作者曾报道甘油致大鼠ARF模型及内皮素在ARF发病中的作用[3]。电镜免疫组化研究进一步显示，标记有ET-1的胶体金颗粒多定位于细胞线粒体和细胞核中，表明ET-1的分布与Ca2+的分布特点有一定关系；而细胞核内所显示的ET-1，是ET-1在核内翻译和转录的结果[4，5]。在实验早、中期肾远曲小管与集合管中ET-1含量增加，尤以早期的3h组为著，表明肾组织遭受缺血等因素作用之初，就需要大量的ET-1参与血浆ET-1水平的调节并维持肾循环功能。提示远曲小管和集合管可能是肾内合成、分泌ET-1的重要场所；实验中期近曲小管上皮ET-1含量也有增加，这可能是近曲小管对滤液中ET-1的重吸收造成的。我们认为ET-1在ARF发病中的作用机制表现在以下两个方面：①间接作用：当肌注甘油致使大鼠股部肌肉变性坏死并造成大量血浆外渗形成水肿时，全身循环血量包括肾血流量减少，而这种缺血性改变又反射性地促使ET-1合成、分泌增加，ET-1大量入血引起血管收缩以维持循环血量。但是在致伤因素未除、又未做积极治疗的情况下，血浆中高浓度的ET-1对血管，尤其是对肾血管的持续收缩作用，势必会进一步加重肾组织缺血，造成更严重的病理改变与肾功能障碍。本实验继1h组血浆ET-1达到高峰值后，所有肾功能与形态学改变都明显的加重。提示ET-1通过收缩血管使肾组织低灌流造成损伤。②直接作用：ET-1一般是通过Ca2+的介导对细胞发生作用的。血浆ET-1可促使细胞外Ca2+内流，细胞浆中较高浓度的ET-1又驱使并协同大量Ca2+进入线粒体，即：超量的ET-1可导致线粒体钙过载，进而引起线粒体肿胀、变性和细胞坏死、钙化[6～8]。当血浆与肾小管滤液中ET-1浓度过度增高时，可促使大量细胞外钙离子伴随ET-1进入肾小管上皮，加之肾小管上皮本身合成或重吸收大量的ET-1，就会引起细胞及其线粒体钙过载。结果表明肾小管上皮细胞中ET-1含量增多，是导致肾小管上皮坏死的重要原因。■
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基金项目：“八五”军队科研基金项目(91Z005)；
作者简介：王晓虹，女，1949-03-06生，湖北阳新县，1994年军医进修学院硕士毕业，病理科副主任医师，科室副主任；发表论文23篇。电话：(010)66867438
参考文献：
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[3]王晓虹，梁延杰，陆江阳等.内皮素在急性肾功能衰竭发病中的作用[J].解放军医学杂志，1999，24：43-45.
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收稿日期：1999-07-12
改回日期：1999-08-10, 百拇医药