维生素C对不同浓度氧环境培养细胞化学发光的影响
作者：薛建华 刘忠权 李政年 常家文
单位：海军医学研究所，上海 200433
关键词：维生素C；化学发光；肺泡巨噬细胞；氧
航天医学与医学工程000111摘要：目的 探讨维生素C(Vit.C)对培养在不同氧浓度气体环境中的家兔肺泡巨噬细胞(AM)受激发光功能的影响。方法 利用一台可以检测细胞发光的恒温装置培养AM，在连续通气条件下用发光仪记录PMA(弗波豆蔻乙酸)激发的AM化学发光水平。结果 培养在0.5%氧环境5h的AM存活率和发光水平分别为暴露前的50%和45%，并随培养介质中添加的Vit.C剂量增加而逐步下降。提高气体氧浓度有利于增强细胞活力，并可部分抵消由Vit.C引起的AM受激发光水平降低。结论 含氧气体有利于培养细胞的受激发光功能和细胞存活；给培养介质添加高浓度Vit.C对AM有明显毒害作用。
中图分类号：R595.1 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1002-0837(2000)01-0045-03
Effect of Ascorbic Acid on Chemiluminescence of Cells Cultivated in Various Concentration of Oxygen
XUE Jian-hua,LIU Zhong-quan,LI Zheng-nian,CHANG Jia-wen
(Naval Medical Research Institute,Shanghai 200433,China)
Abstract:Objective To investigate the effect of Vitamin C(Vit.C) on the stimulated chemiluminescence of rabbit's pulmonary alveolus macrophage(AM) cultivated in various concentration of oxygen.Method The AMs from rabbits were cultured in a thermostat in which luminescence from cells can be examined,then air with various concentrations of oxygen were continuously led in the device and the AM's stimulated chemiluminescence by PMA(phorbol myristate acetate) was measured with a chemiluminometer.Result In the air with 0.5% O2,AM's survival rate and luminescence level were only 50% or 45% of the values before the exposure,and were reducing progressively with increasing dose of Vit.C in the culture medium.To increase the concentration of oxygen in the air was advantageous in enhancing cell's vitality and it can partly counteract the decrease of AM's stimulated chemiluminescence level by adding Vit.C into the culture medium.Conclusion Oxygen in the air is important for cultivated cell's luminescence and survival,and it could lead to grave damage to the cultivated AMs when there is high concentration of Vit.C in the culture medium.
, 百拇医药
Key words:vitamin C;chemiluminescence;pulmonary alveoli macrophage;oxygen
吸入高浓度氧有助于提高组织氧分压，增强细胞ATP合成，使机体保持较高活力，但也有可能因促进脂质过氧化而致氧中毒的危险[1]。已知维生素C(Vit.C)是一种外源性生物抗氧化剂[2]，在消除活性氧自由基，保护组织细胞免受氧化损伤方面具有重要作用。研究表明[3，4]，Vit.C也有通过自身氧化促进癌细胞凋亡和抑制肿瘤生长的临床效用。为了解Vit.C对正常组织细胞是否也有抗氧化或促氧化效应，本文检测了Vit.C对培养在不同浓度氧环境中的家兔肺泡巨噬细胞受激化学发光功能和存活率的影响。
方 法
主要试剂 Vit.C(上海新兴化工试剂研究所)含量大于99.5%；DMEM培养剂(Life Technologies Inc.,USA)；鲁米诺(luminol)和PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)(Sigma),临用前分别配成浓度为25 μg/ml和5.9 μg/ml pH=7.4的磷酸缓冲溶液；O2(99.07%)、N2(99.5%)和空气钢瓶气(上海第5钢铁厂)。
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主要设备 SHG-1型生物化学发光检测仪(上海市检测仪器厂)；测定细胞发光的恒温通气培养装置(自制)[5]。
肺泡巨噬细胞(AM) 新西兰种家兔，体重2～2.5 kg，戊巴比妥钠麻醉，生理盐水气管灌注法洗集AM，离心洗涤2次，镜检计数后制成含106/ml AM的DMEM悬液，用台盼兰染料排除法检查AM存活率，大于95%为可用。
通气培养 将AM悬液定量分装于一组浸泡在培养盒水浴(37℃)中的平底(玻璃)培养皿内(总体积1.2 ml)，将培养盒加盖密闭，放测光装置进行37℃避光恒温培养；在培养过程中使含氧钢瓶气从盒盖通气口连续流经培养盒，染毒细胞，流速100 ml/min。
发光检测 测光装置与发光仪联通(详细构造原理见另文)[5]，其内有光电倍增管，可通过恒温箱底和培养盒底的透光窗口直接接收培养皿内AM的发光，并将光信号输给发光仪自动计数显示和打印记录。实测时，通常先测培养皿自发光本底(每次计数20 s)，然后用注射器穿过培养盒盖上的密封硅胶填，向培养皿加注0.25 ml鲁米诺和0.25 ml PMA，计数AM激发发光，此后每隔180 s计数一次，每次20 s，共8次。结果用8次测定之和(峰积)的cpm(每分钟计数)值表示。
, 百拇医药
除测定AM发光的培养皿外，其余培养皿在通气结束后取出，用台盼兰染料排除法镜检细胞存活率。
结 果
PMA激发的AM发光初值
检测误差 5只各含0.7 ml DMEM和0.5 ml AM悬液的培养皿复份，按本实验方法测定的本底自发光、鲁米诺化学发光和PMA激发发光(峰积值)的组内变差(CV值)分别为12.8%、10.0%和8.8%。
家兔AM激发光初值 家兔离体AM在气体暴露前(已接触空气2 h)测定的PMA激发光参数见表1。
由表1可见，除本底发光外，其余发光参数的变差系数均大于40%，说明不同家兔的AM受激发光能力具有较大个体差异。
Vit.C对氧暴露AM受激发光的影响
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为消除家兔AM发光个体差异的影响，本实验测定的AM受激发光峰积值均用相对于暴露前初值的百分率表示(表2)。
由表2可见：离体培养AM的激发光平均水平随孵育介质中Vit.C剂量增加而下降，但随暴露气体氧浓度增加而增强，浓度小于50.5%时，无Vit.C样品暴露5 h的相对发光强度与氧浓度间具有线性关系(γ=0.9828)。高于空气水平的氧浓度在5 h内有助于保持和增强培养AM之激发光功能；提高暴露氧浓度可以部分抵消由Vit.C引起的发光下降。
Vit.C对氧暴露AM存活率的影响
由表3可见：(1)提高暴露气体氧浓度有利于AM的存活。在99.5%N2中暴露5 h的AM存活率比暴露前下降了42%，而培养在氧浓度高于空气的气体中5 h，AM存活率仅下降10%；(2)Vit.C能促进含氧气体中的培养AM死亡(剂量为3.0 mmol/L的Vit.C使细胞存活率平均比无Vit.C样品降低31.7%)，但对无氧(99.5%N2)培养AM的存活率影响不大，低剂量时甚至还有所提高(P<0.05)。
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表1 家兔AM的PMA激发光初值(n=51)
Table 1 Rabbit AM's initial chemiluminescence values under PMA acceleration (n=51) luminescence(cpm)
±s
CV(%)
background luminescence
137±21
15.3
chemiluminescence
155±65
, 百拇医药
41.9
stimulated chemiluminescence
the peak value
1689±848
50.2
the peak time
5.9±2.8
47.5
the peak area
10165±5792
57.0
, 百拇医药
表2 Vit.C对不同氧浓度暴露5 h的AM激发光反应的影响(%，±s)
Table 2 Effect of Vit.C on chemiluminescence of the stimulated AM under exposing to virous concentration
of oxygen for 5 h(%,±s) concentration of O2(%)
n
Vit.C(mmol/L)
0
, 百拇医药
0.03
0.3
3.0
0.5(99.5% N2)
6
45.5±9.7
44.7±3.7
22.3±10.9
2.5±1.6
19.8
5
70.0±6.7
, 百拇医药
69.4±7.1
62.4±7.0
11.5±6.3
20.8
4
87.9±2.5
74.2±11.5
52.8±6.8
21.1±8.7
50.5
5
156.9±5.7
, 百拇医药
141.1±4.5
-
13.0±10.7
99.1
7
117.4±8.5
113.7±5.3
107.9±13.4
33.7±4.0
Note:The values in the table were the relative percentage of inminessence peak area to before exposure 表3 Vit.C对不同氧浓度暴露5 h的AM存活率的影响(%，±s)
, 百拇医药
Table 3 Effect of Vit.C on the survival ratio of cultivating AMs under exposing to various concentration
of oxygen fore 5 h(%，±s) concentration of O2(%)
n
Vit.C(mmol/L)
0
0.03
0.3
3.0
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0.5(99.5% N2)
6
50.2±6.1
63.4±9.6*
57.5±10.3*
45.4±7.9
19.8
5
85.6±5.3
75.6±7.1
71.2±3.2*
, 百拇医药
69.3±4.0*
20.8
4
90.5±99
92.9±5.5
76.9±4.9
64.7±4.7*
50.5
5
88.6±10.1
91.2±7.6
-
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37.2±12.7**
99.1
7
92.4±10.5
93.7±3.6
88.0±11.8*
59.2±8.6**
Note：*P<0.05,**P<0.01,as compared with the sample without Vit.C,pair t test讨 论
PMA激发的AM化学发光反映了细胞受激呼吸爆发释放活性氧自由基的能力，释放活性氧自由基是吞噬细胞行使杀菌功能的基础，所以测定AM激发光水平可以从一个方面反映细胞的非特异性免疫功能状态。本研究结果表明，提高培养气体氧浓度，在5 h内未见细胞发生氧中毒，相反使AM的激发光水平有所增加，说明高氧环境有助于细胞呼吸释放活性氧自由基，在短期(数小时)内可以增强肺泡细胞的防御活性，长时间接触高浓度氧则对肺细胞未必有利[6]。此外本研究测得在0.5%氧环境中培养5 h的AM激发光活性和存活率比暴露前下降50%，说明缺氧不仅不利于细胞发挥功能，也不利于细胞存活，其原因显然与细胞不能进行有氧代谢有关。
, 百拇医药
本研究证明，Vit.C对培养细胞具有明显毒性。高浓度Vit.C不仅抑制AM的激发发光，也能加速含氧气体培养细胞死亡，但它对无氧培养细胞存活率影响不大，而且增加培养气氧浓度可部分抵消Vit.C的细胞毒效应。我们认为此种现象与Vit.C的性质和分子氧的细胞学作用有关。早先的研究报道[7]，还原态Vit.C在pH>4.2的介质中，可通过供给电子消除存在于介质中的自由基或使过渡金属离子发生还原，自身则被氧化为抗坏血酸自由基。本研究的培养介质pH为7.4，因此它有作为抗氧化剂消除AM受激呼吸释放活性氧自由基的条件。但在无氧条件下，因细胞释放氧自由基的量少，Vit.C的存在使介质自由基进一步减少，所以可见无氧培养AM的受激发光随Vit.C增加而迅速降低。另一方面，介质中被Vit.C还原的微量过渡金属离子可通过Fenton反应催化各种来源的O2-和H2O2生成OH.，启动脂质过氧化链锁反应而致细胞死亡(抗坏血酸自由基也可能诱导细胞凋亡[3])，然而脂质过氧化反应必需有氧分子参与，所以Vit.C能加速有氧培养细胞死亡而对无氧培养细胞存活率不产生太大影响。但总的来说，高浓度氧在短期内对细胞的存活和功能是有利的，因而可部分抵偿Vit.C之细胞毒效应。
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[参考文献]
[1]房广才.临床高压氧医学[M].北京：华文出版社，1995：142～149
[2]陈 瑗，周 玫.自由基医学[M].北京：人民军医出版社，1991：55～60
[3]Shiklar G,Schwartz JL.Ascorbic acid and cancer[J].Subcell Biochem,1996,25:233～247
[4]Berkley GE(陈养正译).营养抗癌[M].北京：科学出版社，1985：30～38
[5]LI Zhengnian,XUE Jjianhua,LIU Zhongquan et al.A equipment to determine luminescence of culturing cell by gas contamination[J].Chinese J of Lumin,1998，19(supp)：162～165
, 百拇医药
李政年，薛建华，刘忠权等.一种检测气体染毒培养细胞发光的装置[J].发光学报，1998，19(增刊)：162～165
[6]ZHANG Ruguo,WANG Chengmin,FU Hongwei.Effects of simulated weightlessness and high concentration oxygen on lungs in rats[J].Space Medicine & Medical Engineering,1995,8(4):235～238
张汝果，王承民，付宏伟.模拟失重条件下高浓度氧对大鼠肺脏的影响[J].航天医学与医学工程,1995,8(4):235～238
[7]Favier AE,Cadet J,Kalyanraman B et al.Analysis of Free Radicals in Biological Systems[M].Basel(Switzerland):Birkhauser Verlag,1995:145～164
收稿日期：1999-03-15, 百拇医药
单位：海军医学研究所，上海 200433
关键词：维生素C；化学发光；肺泡巨噬细胞；氧
航天医学与医学工程000111摘要：目的 探讨维生素C(Vit.C)对培养在不同氧浓度气体环境中的家兔肺泡巨噬细胞(AM)受激发光功能的影响。方法 利用一台可以检测细胞发光的恒温装置培养AM，在连续通气条件下用发光仪记录PMA(弗波豆蔻乙酸)激发的AM化学发光水平。结果 培养在0.5%氧环境5h的AM存活率和发光水平分别为暴露前的50%和45%，并随培养介质中添加的Vit.C剂量增加而逐步下降。提高气体氧浓度有利于增强细胞活力，并可部分抵消由Vit.C引起的AM受激发光水平降低。结论 含氧气体有利于培养细胞的受激发光功能和细胞存活；给培养介质添加高浓度Vit.C对AM有明显毒害作用。
中图分类号：R595.1 文献标识码：A
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文章编号：1002-0837(2000)01-0045-03
Effect of Ascorbic Acid on Chemiluminescence of Cells Cultivated in Various Concentration of Oxygen
XUE Jian-hua,LIU Zhong-quan,LI Zheng-nian,CHANG Jia-wen
(Naval Medical Research Institute,Shanghai 200433,China)
Abstract:Objective To investigate the effect of Vitamin C(Vit.C) on the stimulated chemiluminescence of rabbit's pulmonary alveolus macrophage(AM) cultivated in various concentration of oxygen.Method The AMs from rabbits were cultured in a thermostat in which luminescence from cells can be examined,then air with various concentrations of oxygen were continuously led in the device and the AM's stimulated chemiluminescence by PMA(phorbol myristate acetate) was measured with a chemiluminometer.Result In the air with 0.5% O2,AM's survival rate and luminescence level were only 50% or 45% of the values before the exposure,and were reducing progressively with increasing dose of Vit.C in the culture medium.To increase the concentration of oxygen in the air was advantageous in enhancing cell's vitality and it can partly counteract the decrease of AM's stimulated chemiluminescence level by adding Vit.C into the culture medium.Conclusion Oxygen in the air is important for cultivated cell's luminescence and survival,and it could lead to grave damage to the cultivated AMs when there is high concentration of Vit.C in the culture medium.
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Key words:vitamin C;chemiluminescence;pulmonary alveoli macrophage;oxygen
吸入高浓度氧有助于提高组织氧分压，增强细胞ATP合成，使机体保持较高活力，但也有可能因促进脂质过氧化而致氧中毒的危险[1]。已知维生素C(Vit.C)是一种外源性生物抗氧化剂[2]，在消除活性氧自由基，保护组织细胞免受氧化损伤方面具有重要作用。研究表明[3，4]，Vit.C也有通过自身氧化促进癌细胞凋亡和抑制肿瘤生长的临床效用。为了解Vit.C对正常组织细胞是否也有抗氧化或促氧化效应，本文检测了Vit.C对培养在不同浓度氧环境中的家兔肺泡巨噬细胞受激化学发光功能和存活率的影响。
方 法
主要试剂 Vit.C(上海新兴化工试剂研究所)含量大于99.5%；DMEM培养剂(Life Technologies Inc.,USA)；鲁米诺(luminol)和PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)(Sigma),临用前分别配成浓度为25 μg/ml和5.9 μg/ml pH=7.4的磷酸缓冲溶液；O2(99.07%)、N2(99.5%)和空气钢瓶气(上海第5钢铁厂)。
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主要设备 SHG-1型生物化学发光检测仪(上海市检测仪器厂)；测定细胞发光的恒温通气培养装置(自制)[5]。
肺泡巨噬细胞(AM) 新西兰种家兔，体重2～2.5 kg，戊巴比妥钠麻醉，生理盐水气管灌注法洗集AM，离心洗涤2次，镜检计数后制成含106/ml AM的DMEM悬液，用台盼兰染料排除法检查AM存活率，大于95%为可用。
通气培养 将AM悬液定量分装于一组浸泡在培养盒水浴(37℃)中的平底(玻璃)培养皿内(总体积1.2 ml)，将培养盒加盖密闭，放测光装置进行37℃避光恒温培养；在培养过程中使含氧钢瓶气从盒盖通气口连续流经培养盒，染毒细胞，流速100 ml/min。
发光检测 测光装置与发光仪联通(详细构造原理见另文)[5]，其内有光电倍增管，可通过恒温箱底和培养盒底的透光窗口直接接收培养皿内AM的发光，并将光信号输给发光仪自动计数显示和打印记录。实测时，通常先测培养皿自发光本底(每次计数20 s)，然后用注射器穿过培养盒盖上的密封硅胶填，向培养皿加注0.25 ml鲁米诺和0.25 ml PMA，计数AM激发发光，此后每隔180 s计数一次，每次20 s，共8次。结果用8次测定之和(峰积)的cpm(每分钟计数)值表示。
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除测定AM发光的培养皿外，其余培养皿在通气结束后取出，用台盼兰染料排除法镜检细胞存活率。
结 果
PMA激发的AM发光初值
检测误差 5只各含0.7 ml DMEM和0.5 ml AM悬液的培养皿复份，按本实验方法测定的本底自发光、鲁米诺化学发光和PMA激发发光(峰积值)的组内变差(CV值)分别为12.8%、10.0%和8.8%。
家兔AM激发光初值 家兔离体AM在气体暴露前(已接触空气2 h)测定的PMA激发光参数见表1。
由表1可见，除本底发光外，其余发光参数的变差系数均大于40%，说明不同家兔的AM受激发光能力具有较大个体差异。
Vit.C对氧暴露AM受激发光的影响
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为消除家兔AM发光个体差异的影响，本实验测定的AM受激发光峰积值均用相对于暴露前初值的百分率表示(表2)。
由表2可见：离体培养AM的激发光平均水平随孵育介质中Vit.C剂量增加而下降，但随暴露气体氧浓度增加而增强，浓度小于50.5%时，无Vit.C样品暴露5 h的相对发光强度与氧浓度间具有线性关系(γ=0.9828)。高于空气水平的氧浓度在5 h内有助于保持和增强培养AM之激发光功能；提高暴露氧浓度可以部分抵消由Vit.C引起的发光下降。
Vit.C对氧暴露AM存活率的影响
由表3可见：(1)提高暴露气体氧浓度有利于AM的存活。在99.5%N2中暴露5 h的AM存活率比暴露前下降了42%，而培养在氧浓度高于空气的气体中5 h，AM存活率仅下降10%；(2)Vit.C能促进含氧气体中的培养AM死亡(剂量为3.0 mmol/L的Vit.C使细胞存活率平均比无Vit.C样品降低31.7%)，但对无氧(99.5%N2)培养AM的存活率影响不大，低剂量时甚至还有所提高(P<0.05)。
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表1 家兔AM的PMA激发光初值(n=51)
Table 1 Rabbit AM's initial chemiluminescence values under PMA acceleration (n=51) luminescence(cpm)
±sCV(%)
background luminescence
137±21
15.3
chemiluminescence
155±65
, 百拇医药
41.9
stimulated chemiluminescence
the peak value
1689±848
50.2
the peak time
5.9±2.8
47.5
the peak area
10165±5792
57.0
, 百拇医药
表2 Vit.C对不同氧浓度暴露5 h的AM激发光反应的影响(%，
±s)Table 2 Effect of Vit.C on chemiluminescence of the stimulated AM under exposing to virous concentration
of oxygen for 5 h(%,
±s) concentration of O2(%)n
Vit.C(mmol/L)
0
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0.03
0.3
3.0
0.5(99.5% N2)
6
45.5±9.7
44.7±3.7
22.3±10.9
2.5±1.6
19.8
5
70.0±6.7
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69.4±7.1
62.4±7.0
11.5±6.3
20.8
4
87.9±2.5
74.2±11.5
52.8±6.8
21.1±8.7
50.5
5
156.9±5.7
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141.1±4.5
-
13.0±10.7
99.1
7
117.4±8.5
113.7±5.3
107.9±13.4
33.7±4.0
Note:The values in the table were the relative percentage of inminessence peak area to before exposure 表3 Vit.C对不同氧浓度暴露5 h的AM存活率的影响(%，
±s), 百拇医药
Table 3 Effect of Vit.C on the survival ratio of cultivating AMs under exposing to various concentration
of oxygen fore 5 h(%，
±s) concentration of O2(%)n
Vit.C(mmol/L)
0
0.03
0.3
3.0
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0.5(99.5% N2)
6
50.2±6.1
63.4±9.6*
57.5±10.3*
45.4±7.9
19.8
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75.6±7.1
71.2±3.2*
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20.8
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92.9±5.5
76.9±4.9
64.7±4.7*
50.5
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91.2±7.6
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37.2±12.7**
99.1
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92.4±10.5
93.7±3.6
88.0±11.8*
59.2±8.6**
Note：*P<0.05,**P<0.01,as compared with the sample without Vit.C,pair t test讨 论
PMA激发的AM化学发光反映了细胞受激呼吸爆发释放活性氧自由基的能力，释放活性氧自由基是吞噬细胞行使杀菌功能的基础，所以测定AM激发光水平可以从一个方面反映细胞的非特异性免疫功能状态。本研究结果表明，提高培养气体氧浓度，在5 h内未见细胞发生氧中毒，相反使AM的激发光水平有所增加，说明高氧环境有助于细胞呼吸释放活性氧自由基，在短期(数小时)内可以增强肺泡细胞的防御活性，长时间接触高浓度氧则对肺细胞未必有利[6]。此外本研究测得在0.5%氧环境中培养5 h的AM激发光活性和存活率比暴露前下降50%，说明缺氧不仅不利于细胞发挥功能，也不利于细胞存活，其原因显然与细胞不能进行有氧代谢有关。
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本研究证明，Vit.C对培养细胞具有明显毒性。高浓度Vit.C不仅抑制AM的激发发光，也能加速含氧气体培养细胞死亡，但它对无氧培养细胞存活率影响不大，而且增加培养气氧浓度可部分抵消Vit.C的细胞毒效应。我们认为此种现象与Vit.C的性质和分子氧的细胞学作用有关。早先的研究报道[7]，还原态Vit.C在pH>4.2的介质中，可通过供给电子消除存在于介质中的自由基或使过渡金属离子发生还原，自身则被氧化为抗坏血酸自由基。本研究的培养介质pH为7.4，因此它有作为抗氧化剂消除AM受激呼吸释放活性氧自由基的条件。但在无氧条件下，因细胞释放氧自由基的量少，Vit.C的存在使介质自由基进一步减少，所以可见无氧培养AM的受激发光随Vit.C增加而迅速降低。另一方面，介质中被Vit.C还原的微量过渡金属离子可通过Fenton反应催化各种来源的O2-和H2O2生成OH.，启动脂质过氧化链锁反应而致细胞死亡(抗坏血酸自由基也可能诱导细胞凋亡[3])，然而脂质过氧化反应必需有氧分子参与，所以Vit.C能加速有氧培养细胞死亡而对无氧培养细胞存活率不产生太大影响。但总的来说，高浓度氧在短期内对细胞的存活和功能是有利的，因而可部分抵偿Vit.C之细胞毒效应。
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[参考文献]
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[3]Shiklar G,Schwartz JL.Ascorbic acid and cancer[J].Subcell Biochem,1996,25:233～247
[4]Berkley GE(陈养正译).营养抗癌[M].北京：科学出版社，1985：30～38
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李政年，薛建华，刘忠权等.一种检测气体染毒培养细胞发光的装置[J].发光学报，1998，19(增刊)：162～165
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收稿日期：1999-03-15, 百拇医药