鼠大脑室管膜下区放射损伤与相关基因表达
作者：朱广迎 梁克 王德广 蔡伟明
单位：朱广迎(221002 徐州医学院肿瘤研究所放射治疗科)；王德广(221002 徐州医学院肿瘤研究所放射治疗科)；梁克(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科)；蔡伟明(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科)
关键词：脑；放射损伤；基因表达；细胞凋亡
中华放射肿瘤学杂志000115 【摘要】 目的 研究鼠大脑室管膜下区细胞(SEC)放射性损伤的剂量效应关系及其相关基因表达规律。方法 采用10MeV电子线照射昆明鼠全脑制作SEC放射损伤模型,以昆明鼠大脑SEC数、凋亡率和p53，C-jun，C-fos基因表达率为研究指标。结果 ①照射后6h昆明鼠的SEC数开始下降,24，48h达最低值,120h有所恢复;照射剂量越高,SEC数越少; ②照射后6h SEC出现凋亡，24h凋亡率达到高峰(5,10,20Gy组分别为33.2%,33.3%,37.0%)，120h恢复; ③照射后2hSEC的C-fos表达率达高峰,6h明显下降,24h恢复; ④照射后2h C-jun表达率开始上升,6h达高峰(5,10,20Gy照射组分别为14.1%,23.3%和46.5%),48h下降,120h恢复;⑤照射后2h p53表达率明显上升，24h达到高峰(5,10,20Gy组分别为26.5%,40.8%和66.5%)，48h下降,120h基本恢复。结论 放射线诱导SEC的p53，C-jun基因过表达和凋亡是放射性脑损伤的重要发病机制。
, 百拇医药
Radiation damage and correlative gene expression of subependymal cell of Kunming mouse model
ZHU Guangying LIANG Ke WANG Deguang et al
Department of Radiation Oncology, Cancer Institute, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221001,China
【Abstract】 Objective To investigate the correlation between radiation damage and correlative gene expression of subependymal cell(SEC) of the Kunming mice brain after irradiation. Methods Whole brain of the Kunming mice was irradiated with 10MeV electron beams to establish the SEC damage model. The cellularity, apoptotic index and expression rate of p53,C-jun and C-fos of SEC of the mice after irradiation were counted. Results ①The cellularity of SEC began to decrease 6 hour after irradiation, reached its minimum at 24 or 48 hour , began to recover at 120 hour. The decrement of cellularity of SEC had a dose effect relationship. ②the apoptotic index of SEC began to rise 6 hour after irradiation,reached peak at 24 hour, and recovered at 120 hour.The maximum of apoptotic indexes after irradiation with 5Gy,10Gy and 20Gy were 33.2%,33.3%,37.0%(p>0.05) respectively. ③The expression rate of C-fos reached its maximum 2 hour after irradiation,decreased apparently at 6 hour , recovered at 24 hour.④ The expression rate of C-jun began to rise 2 hour after irradiation, reached peak at 6 hour, decreased at 48 hour and recovered at 120 hour. ⑤The expression rate of p53 rose apparently 2 hour after irradiation, reached peak at 24 hour , decreased at 48 hour and recovered at 120 hour. The dynamic changing of p53,C-jun expression was similar to that of the decrement of cellularity of SEC. Conclusion Induction of the expression of p53,C-jun, apoptosis and decrement of cellularity of SEC are important in the pathogenesis of brain damage caused by irradiation.
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【Key words】 Brain; Radiation injury; Gene expression; Cell apoptosis
放射性脑损伤是限制脑部放射治疗剂量、降低疗效的重要因素, 而室管膜下区细胞(subependymal cell, SEC)的放射损伤是放射性脑损伤的重要发病原理[1]。作者研究了SEC放射损伤相关基因表达及其与凋亡关系,旨在深入了解放射性脑损伤的发病机制,并为今后利用基因、凋亡调控手段防治放射性脑损伤打下基础。
1 材料与方法
1.1 动物与分组：将100只清洁级雌性昆明鼠(由中国医学科学院肿瘤医院动物室提供,体重14～16g,鼠龄为4～6周)随机分为20，10，5Gy组、空白对照组，每时间点3～5只鼠。
1.2 照射方法与剂量：照射前采用硫喷妥钠(质量浓度为20g/L)麻醉,照射时置于自行制作的塑料托盘上,上面覆以厚约5mm的凡士林袋, 采用飞利浦直线加速器、10MeV电子线照射(源皮距100cm,20cm×20cm限光筒,专用铅模)剂量率2Gy/min,照射前实测确定剂量。
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1.3 取鼠脑实验步骤: 参照姜玉武等[2]的方法,每时间点取3只昆明鼠，麻醉后固定成仰卧位,开胸穿刺左心室(同时剪破右心房),快速滴注生理盐水(室温)150mL,慢速滴注4℃40g/L多聚甲醛(0.1mol/L磷酸缓冲液配制)100mL,然后开颅取出全脑,置于10%甲醛液中,固定备用。
1.4 SEC计数和凋亡细胞计数：将固定标本石蜡包埋后自视交叉嘴侧向尾侧连续切片(片厚6μm,总片数150张)保证室管膜下区在切片范围内；全部切片分组置于载玻片,于60℃烤箱中过夜,常规HE染色,显微镜下选出胼胝体嘴、前联合前及两者的中平面各1张,然后计数每个切片全部SEC。 TUNEL末端标计法检测凋亡细胞试剂盒购自保灵曼公司,严格按说明书操作。参照Shinohara等[3]的方法,凋亡细胞判定标准为: 细胞出现核固缩、核碎裂和(或)TUNEL染色阳性细胞。
1.5 p53，C-jun，C-fos免疫组织化学染色：参照姜玉武等[2]的方法,一抗的稀释倍数均为1:200,每张切片阳性细胞计数均经两个人观察,结果取平均值；表达率为SEC阳性细胞数/SEC总细胞数。
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1.6 统计方法 应用EXCEL软件对实验结果进行χ2检验、F分析[4]。
2 结果
2.1 常规病理观察：病理形态观察发现20Gy照射后3h昆明鼠SEC形态、分布无明显变化,照射后6h可见少量核碎裂细胞,照射后24h细胞数量明显减少,部分细胞核明显固缩,并见核碎片,呈典型凋亡细胞(图1)。10，5Gy组仍可看到典型的凋亡细胞,但细胞数量下降的程度不如20Gy组。
图1 10MeV电子照射后24h，典型凋亡细胞(HE染色×100)
2.2 SEC计数：照射后2，6，24，48，120h各剂量组昆明鼠SEC计数见图2。照射后24h 20，10y，5Gy组、对照组的SEC数分别为216.3±34.4，301.0±12.4，361.3±29.0，461.00±78.9,经统计学处理各组之间差异均有显著性 (P<0.01)；照射后120h各剂量组SEC数有所恢复。
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图2 不同剂量照射后室管膜下区细胞数随时间变化情况
2.3 照射后昆明鼠SEC凋亡率：照射后各剂量组昆明鼠SEC凋亡率见图3。照射后24h各组凋亡率达高峰,虽然凋亡率有随剂量增加而升高的趋势,但经统计学处理各组间差异无显著性 (P>0.05)。
图3 不同剂量照射后室管膜下区细胞凋亡率随时间变化情况
2.4 小鼠SEC的C-fos阳性率：照射后2h各剂量组SEC的C-fos表达率均达峰值,20，10，5Gy组分别为30.5%，21.3%和12.0%；6h已有明显下降,24h恢复到对照组水平(见图4)。
图4 不同剂量照射后室管膜下区细胞FC-fos阳性率随时间变化情况
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2.5 小鼠SEC的C-jun阳性率：照射后2h C-jun表达率开始上升,6h达高峰, 5，10，20Gy组分别为14.1%，23.3%和46.5%；48h下降,120h恢复到对照水平(见图5)。
图5 不同剂量照射后室管膜下区细胞C-jun阳性率随时间变化情况
2.6 小鼠SEC的p53表达率：照射后2h各剂量组SEC的p53表达率明显上升，24h达到高峰，5，10，20Gy组分别为26.5%，40.8%和66.5%；48h下降,120h基本恢复到对照水平(见图6)。
图6 不同剂量照射后室管膜下区细胞p53阳性率随时间变化情况
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值得注意的是,SEC的p53阳性率达到高峰的时间与细胞数下降至最低值的时间基本一致。
3 讨论
目前认为放射性脑损伤的发病机制与血管内皮细胞损伤和胶质细胞损伤有关，室管膜下区的细胞发育成熟之后可迁徙至大脑半球的深部并演变成为胶质细胞，维持正常髓鞘的形态与功能[5]。如果SEC受到损伤，大脑半球的深部的胶质细胞得不到补充则可导致脱髓鞘、坏死[6]。凋亡是一种与许多疾病有关的主动性死亡, 诱导凋亡也是放射线治疗肿瘤和引起正常组织损伤的重要原理，但是照射后细胞死亡的形式至少分凋亡和分裂死亡两种。照射后SEC数不仅取决于细胞凋亡率，还取决于细胞死亡和增殖的动态平衡，这正是本研究结果中照射后24，48h SEC数与凋亡率不一致的原因。Shinohara等[3]研究结果显示, 150kV X射线照射Fisher 344大鼠大脑后6h SEC凋亡率达到高峰, 15Gy照射后凋亡率的峰值为27%，照射后24h凋亡率明显下降。本研究采用电子线照射昆明鼠全脑后24h凋亡率达到高峰，推测结果不一致的原因是X射线、电子线相对生物效应不同。
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由于诱导凋亡的因素复杂,凋亡过程信号传导又涉及多种基因。目前对放射线诱导的神经细胞凋亡相关基因尚无一致意见,一般认为C-fos，C-jun，p53均为凋亡相关基因[7，8]。jun-fos异源二聚体是转录因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)的主要成份,与DNA同源序列TGAC/GTCA结合,影响细胞的生存。本研究发现昆明鼠SEC的C-fos表达高峰时间明显早于凋亡高峰时间,说明C-fos没有直接参与其凋亡过程。C-jun表达高峰略早于SEC凋亡率高峰出现时间,提示C-jun参与SEC凋亡的早期过程。在细胞对DNA损伤的反应中p53的作用十分重要,p53蛋白被诱导产生之后,促进细胞周期素抑制物p21的合成,继而抑制细胞周期素依赖的激酶cdk34,导致细胞周期阻滞,以利DNA的修复,当不能修复时引起细胞凋亡[8]。本研究结果显示照射后p53表达的动态变化与细胞数下降至最低值的时间基本一致，说明p53参与放射线诱导的SEC损伤。
总之,本研究证明放射线诱导的p53，C-jun基因过表达和SEC损伤可能是放射性脑损伤重要发病机制。
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(本文图1见对封2页)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500043)；中国医学科学院基金资助项目(952057)
参考文献
[1] Hopewell JW,Cabanagh JB. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br J Radiol， 1972,45(534): 461-465.
[2] 姜玉武,张国荣,吴希如.惊厥易感大鼠听源性惊厥后脑内C-fos蛋白表达.北京医科大学学报，1998,30(4):307-309.
[3] Shinohara C, Gobbel GT, Lamborn KR，et al.Apoptosis in subependyma of young adult rat after single and fractionated doses X-ray. Cancer Res，1997，57 (13): 2694-2702.
, http://www.100md.com
[4] 金丕焕，主编.医用统计方法.上海:上海医科大学出版社,1993.167-190.
[5] Lewis PD. The fate of the subendymal cell in the adult rat brain,with a note on the origin of microglia. Brain，1969,91(4):721-736.
[6] Burger PC,Boyko OB.The pathology of central nervous system radiation injury.In：Gutin PH,Leibel SA,Sheline GE，eds. Radiation injury to the nervous system.New York: Raven Press,1991.191-208.
[7] Ferrer I,Olive M,Blanco R, et al.Selective C-jun overexpression is associated with ionizing radiation-induced apoptosis in the developing cerebellum of the rat.Molecular Brain Res，1996,38(1):91-100.
[8] 朱广迎,蔡伟明,徐国镇.腺病毒载体转染p53基因提高肿瘤放射敏感性的实验研究进展.中华放射肿瘤学杂志，1999,8(2):125-126.
(收稿日期：1999-08-25), http://www.100md.com
单位：朱广迎(221002 徐州医学院肿瘤研究所放射治疗科)；王德广(221002 徐州医学院肿瘤研究所放射治疗科)；梁克(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科)；蔡伟明(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科)
关键词：脑；放射损伤；基因表达；细胞凋亡
中华放射肿瘤学杂志000115 【摘要】 目的 研究鼠大脑室管膜下区细胞(SEC)放射性损伤的剂量效应关系及其相关基因表达规律。方法 采用10MeV电子线照射昆明鼠全脑制作SEC放射损伤模型,以昆明鼠大脑SEC数、凋亡率和p53，C-jun，C-fos基因表达率为研究指标。结果 ①照射后6h昆明鼠的SEC数开始下降,24，48h达最低值,120h有所恢复;照射剂量越高,SEC数越少; ②照射后6h SEC出现凋亡，24h凋亡率达到高峰(5,10,20Gy组分别为33.2%,33.3%,37.0%)，120h恢复; ③照射后2hSEC的C-fos表达率达高峰,6h明显下降,24h恢复; ④照射后2h C-jun表达率开始上升,6h达高峰(5,10,20Gy照射组分别为14.1%,23.3%和46.5%),48h下降,120h恢复;⑤照射后2h p53表达率明显上升，24h达到高峰(5,10,20Gy组分别为26.5%,40.8%和66.5%)，48h下降,120h基本恢复。结论 放射线诱导SEC的p53，C-jun基因过表达和凋亡是放射性脑损伤的重要发病机制。
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Radiation damage and correlative gene expression of subependymal cell of Kunming mouse model
ZHU Guangying LIANG Ke WANG Deguang et al
Department of Radiation Oncology, Cancer Institute, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221001,China
【Abstract】 Objective To investigate the correlation between radiation damage and correlative gene expression of subependymal cell(SEC) of the Kunming mice brain after irradiation. Methods Whole brain of the Kunming mice was irradiated with 10MeV electron beams to establish the SEC damage model. The cellularity, apoptotic index and expression rate of p53,C-jun and C-fos of SEC of the mice after irradiation were counted. Results ①The cellularity of SEC began to decrease 6 hour after irradiation, reached its minimum at 24 or 48 hour , began to recover at 120 hour. The decrement of cellularity of SEC had a dose effect relationship. ②the apoptotic index of SEC began to rise 6 hour after irradiation,reached peak at 24 hour, and recovered at 120 hour.The maximum of apoptotic indexes after irradiation with 5Gy,10Gy and 20Gy were 33.2%,33.3%,37.0%(p>0.05) respectively. ③The expression rate of C-fos reached its maximum 2 hour after irradiation,decreased apparently at 6 hour , recovered at 24 hour.④ The expression rate of C-jun began to rise 2 hour after irradiation, reached peak at 6 hour, decreased at 48 hour and recovered at 120 hour. ⑤The expression rate of p53 rose apparently 2 hour after irradiation, reached peak at 24 hour , decreased at 48 hour and recovered at 120 hour. The dynamic changing of p53,C-jun expression was similar to that of the decrement of cellularity of SEC. Conclusion Induction of the expression of p53,C-jun, apoptosis and decrement of cellularity of SEC are important in the pathogenesis of brain damage caused by irradiation.
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【Key words】 Brain; Radiation injury; Gene expression; Cell apoptosis
放射性脑损伤是限制脑部放射治疗剂量、降低疗效的重要因素, 而室管膜下区细胞(subependymal cell, SEC)的放射损伤是放射性脑损伤的重要发病原理[1]。作者研究了SEC放射损伤相关基因表达及其与凋亡关系,旨在深入了解放射性脑损伤的发病机制,并为今后利用基因、凋亡调控手段防治放射性脑损伤打下基础。
1 材料与方法
1.1 动物与分组：将100只清洁级雌性昆明鼠(由中国医学科学院肿瘤医院动物室提供,体重14～16g,鼠龄为4～6周)随机分为20，10，5Gy组、空白对照组，每时间点3～5只鼠。
1.2 照射方法与剂量：照射前采用硫喷妥钠(质量浓度为20g/L)麻醉,照射时置于自行制作的塑料托盘上,上面覆以厚约5mm的凡士林袋, 采用飞利浦直线加速器、10MeV电子线照射(源皮距100cm,20cm×20cm限光筒,专用铅模)剂量率2Gy/min,照射前实测确定剂量。
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1.3 取鼠脑实验步骤: 参照姜玉武等[2]的方法,每时间点取3只昆明鼠，麻醉后固定成仰卧位,开胸穿刺左心室(同时剪破右心房),快速滴注生理盐水(室温)150mL,慢速滴注4℃40g/L多聚甲醛(0.1mol/L磷酸缓冲液配制)100mL,然后开颅取出全脑,置于10%甲醛液中,固定备用。
1.4 SEC计数和凋亡细胞计数：将固定标本石蜡包埋后自视交叉嘴侧向尾侧连续切片(片厚6μm,总片数150张)保证室管膜下区在切片范围内；全部切片分组置于载玻片,于60℃烤箱中过夜,常规HE染色,显微镜下选出胼胝体嘴、前联合前及两者的中平面各1张,然后计数每个切片全部SEC。 TUNEL末端标计法检测凋亡细胞试剂盒购自保灵曼公司,严格按说明书操作。参照Shinohara等[3]的方法,凋亡细胞判定标准为: 细胞出现核固缩、核碎裂和(或)TUNEL染色阳性细胞。
1.5 p53，C-jun，C-fos免疫组织化学染色：参照姜玉武等[2]的方法,一抗的稀释倍数均为1:200,每张切片阳性细胞计数均经两个人观察,结果取平均值；表达率为SEC阳性细胞数/SEC总细胞数。
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1.6 统计方法 应用EXCEL软件对实验结果进行χ2检验、F分析[4]。
2 结果
2.1 常规病理观察：病理形态观察发现20Gy照射后3h昆明鼠SEC形态、分布无明显变化,照射后6h可见少量核碎裂细胞,照射后24h细胞数量明显减少,部分细胞核明显固缩,并见核碎片,呈典型凋亡细胞(图1)。10，5Gy组仍可看到典型的凋亡细胞,但细胞数量下降的程度不如20Gy组。
图1 10MeV电子照射后24h，典型凋亡细胞(HE染色×100)
2.2 SEC计数：照射后2，6，24，48，120h各剂量组昆明鼠SEC计数见图2。照射后24h 20，10y，5Gy组、对照组的SEC数分别为216.3±34.4，301.0±12.4，361.3±29.0，461.00±78.9,经统计学处理各组之间差异均有显著性 (P<0.01)；照射后120h各剂量组SEC数有所恢复。
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图2 不同剂量照射后室管膜下区细胞数随时间变化情况
2.3 照射后昆明鼠SEC凋亡率：照射后各剂量组昆明鼠SEC凋亡率见图3。照射后24h各组凋亡率达高峰,虽然凋亡率有随剂量增加而升高的趋势,但经统计学处理各组间差异无显著性 (P>0.05)。
图3 不同剂量照射后室管膜下区细胞凋亡率随时间变化情况
2.4 小鼠SEC的C-fos阳性率：照射后2h各剂量组SEC的C-fos表达率均达峰值,20，10，5Gy组分别为30.5%，21.3%和12.0%；6h已有明显下降,24h恢复到对照组水平(见图4)。
图4 不同剂量照射后室管膜下区细胞FC-fos阳性率随时间变化情况
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2.5 小鼠SEC的C-jun阳性率：照射后2h C-jun表达率开始上升,6h达高峰, 5，10，20Gy组分别为14.1%，23.3%和46.5%；48h下降,120h恢复到对照水平(见图5)。
图5 不同剂量照射后室管膜下区细胞C-jun阳性率随时间变化情况
2.6 小鼠SEC的p53表达率：照射后2h各剂量组SEC的p53表达率明显上升，24h达到高峰，5，10，20Gy组分别为26.5%，40.8%和66.5%；48h下降,120h基本恢复到对照水平(见图6)。
图6 不同剂量照射后室管膜下区细胞p53阳性率随时间变化情况
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值得注意的是,SEC的p53阳性率达到高峰的时间与细胞数下降至最低值的时间基本一致。
3 讨论
目前认为放射性脑损伤的发病机制与血管内皮细胞损伤和胶质细胞损伤有关，室管膜下区的细胞发育成熟之后可迁徙至大脑半球的深部并演变成为胶质细胞，维持正常髓鞘的形态与功能[5]。如果SEC受到损伤，大脑半球的深部的胶质细胞得不到补充则可导致脱髓鞘、坏死[6]。凋亡是一种与许多疾病有关的主动性死亡, 诱导凋亡也是放射线治疗肿瘤和引起正常组织损伤的重要原理，但是照射后细胞死亡的形式至少分凋亡和分裂死亡两种。照射后SEC数不仅取决于细胞凋亡率，还取决于细胞死亡和增殖的动态平衡，这正是本研究结果中照射后24，48h SEC数与凋亡率不一致的原因。Shinohara等[3]研究结果显示, 150kV X射线照射Fisher 344大鼠大脑后6h SEC凋亡率达到高峰, 15Gy照射后凋亡率的峰值为27%，照射后24h凋亡率明显下降。本研究采用电子线照射昆明鼠全脑后24h凋亡率达到高峰，推测结果不一致的原因是X射线、电子线相对生物效应不同。
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由于诱导凋亡的因素复杂,凋亡过程信号传导又涉及多种基因。目前对放射线诱导的神经细胞凋亡相关基因尚无一致意见,一般认为C-fos，C-jun，p53均为凋亡相关基因[7，8]。jun-fos异源二聚体是转录因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)的主要成份,与DNA同源序列TGAC/GTCA结合,影响细胞的生存。本研究发现昆明鼠SEC的C-fos表达高峰时间明显早于凋亡高峰时间,说明C-fos没有直接参与其凋亡过程。C-jun表达高峰略早于SEC凋亡率高峰出现时间,提示C-jun参与SEC凋亡的早期过程。在细胞对DNA损伤的反应中p53的作用十分重要,p53蛋白被诱导产生之后,促进细胞周期素抑制物p21的合成,继而抑制细胞周期素依赖的激酶cdk34,导致细胞周期阻滞,以利DNA的修复,当不能修复时引起细胞凋亡[8]。本研究结果显示照射后p53表达的动态变化与细胞数下降至最低值的时间基本一致，说明p53参与放射线诱导的SEC损伤。
总之,本研究证明放射线诱导的p53，C-jun基因过表达和SEC损伤可能是放射性脑损伤重要发病机制。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500043)；中国医学科学院基金资助项目(952057)
参考文献
[1] Hopewell JW,Cabanagh JB. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br J Radiol， 1972,45(534): 461-465.
[2] 姜玉武,张国荣,吴希如.惊厥易感大鼠听源性惊厥后脑内C-fos蛋白表达.北京医科大学学报，1998,30(4):307-309.
[3] Shinohara C, Gobbel GT, Lamborn KR，et al.Apoptosis in subependyma of young adult rat after single and fractionated doses X-ray. Cancer Res，1997，57 (13): 2694-2702.
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[4] 金丕焕，主编.医用统计方法.上海:上海医科大学出版社,1993.167-190.
[5] Lewis PD. The fate of the subendymal cell in the adult rat brain,with a note on the origin of microglia. Brain，1969,91(4):721-736.
[6] Burger PC,Boyko OB.The pathology of central nervous system radiation injury.In：Gutin PH,Leibel SA,Sheline GE，eds. Radiation injury to the nervous system.New York: Raven Press,1991.191-208.
[7] Ferrer I,Olive M,Blanco R, et al.Selective C-jun overexpression is associated with ionizing radiation-induced apoptosis in the developing cerebellum of the rat.Molecular Brain Res，1996,38(1):91-100.
[8] 朱广迎,蔡伟明,徐国镇.腺病毒载体转染p53基因提高肿瘤放射敏感性的实验研究进展.中华放射肿瘤学杂志，1999,8(2):125-126.
(收稿日期：1999-08-25), http://www.100md.com