非甲庚型肝炎患者TT病毒感染的检测及序列分析
作者：何忠平 周育森 戴旺苏 李蕴铷 徐克沂 徐道振 王海涛
单位：何忠平 戴旺苏 李蕴铷 徐克沂 徐道振(100011 北京地坛医院)；周育森 王海涛(军事医学科学院微生物流行病学研究所)
关键词：
中华传染病杂志000119 在急慢性输血后肝炎、散发性肝炎及爆发性肝炎中，有相当比例的患者用现有甲、乙、 丙、丁、戊、庚型肝炎实验室诊断方法尚不能分型，在排除已知的致病因素外，仍有3.50～1 5%的肝炎病人病因不明。通常将这些不明原因的肝炎称之为非甲-庚型肝炎。1997年日本学 者报道发现一种新的肝炎病毒，并命名为TT病毒(TTV)[1] 。我们根据日本报道的TTV基因序列，建立套式-聚合酶链反应(nested-PCR)方法，在我 国北京地区非甲-庚型肝炎患者中检测出TTV基因，并进行了序列分析，现将结果报道如下 。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、标本来源及试剂
45例血清样本采自北京地坛医院1997年3月至1998年3月诊断为急慢性非甲-庚型肝炎患者， 均 为2次甲、乙、丙、丁、戊型(ABBOTT公司，EIA方法)和EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)抗 体阴性，乙、丙、庚型 聚合酶链反应(PCR)检测阴性，丙氨酸转氨酶(ALT)异常(>40 U，赖氏法)，并排除自身免疫 性疾病，药物性 肝炎，酒精性肝炎，阻塞性黄疸等。Taq酶、dNTPs和T4 DNA连接酶购自华美公司，T载体、X L1-Blue菌为美国Invitrogen公司产品。STG试剂盒购自Biotronic公司,QIAprep Miniprep 质粒提取试剂为QIAgen公司产品。
二、DNA的提取及PCR方法
用STG法，取5.0 μl血清，加62.5 μl STG缓冲液，混匀，100°C变性5 min，13 000 g离 心10 min，挑除变性蛋白，加90 μl异丙醇沉淀，室温离心，沉淀物干燥后用无菌水10 μl 溶解。参考日本株(AB008394)TTV基因序列设计2对引物，引物序列分别为：P1：5′-CACCA GGAGCATATACAGA-3′;P2∶5′-TCTTCTTGCTGGTGAAA-3′;P3：5′-ACAGACAGAGGAGAAGG C-3′;P4∶5′-AACAGGCACATACTACT-3′。其中P1/P2为外引物，P3/P4为内引物。第一 轮P CR反应条件：取模板4 μl、10×PCR buffer 3 μl、dNTPs 0.8 μmol/L、P1/P2 0.1 μm ol/L,30 μl反应体积，94°C预变性180 s，94°C 40s，55°C 40s，72°C 45s，扩增 30个 循环。取第一次PCR产物2 μl作模板、10×PCR buffer 3 μl、P3/P4 0.1 μmol/L、dNTPs 0.8 μmol/L,30 μl反应体积进行第二次扩增，循环条件为：94°C预变性180 s，94°C 40s,55°C 40s,72°C 40s,扩增30个循环。取2次PCR产物10 μl用2%的琼脂糖凝胶电泳， EB染色，紫外灯下观察结果，第二次PCR扩增片段为309 bp。每次PCR均设阳性及阴性对照。
, 百拇医药
三、克隆、测序及序列分析
PCR产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后，直接与T载体连接，转化XL1-Blue宿主菌。挑取 白色菌落用PCR鉴定，对阳性菌落接种培养，提取质粒，采用Sanger末端终止法，于AB377型 自动测序仪进行双链测序。DNA序列资料采用CLUSTWAL和BLAST软件程序进行分析。
结果
一、非甲-庚型肝炎TTV感染的PCR检测
用nested-PCR方法检测45例非甲-庚型肝炎患者血清标本，检出13例(28.9%) 为TTV DNA阳性。
二、非甲-庚型肝炎患者TTV部分核酸序列分析
将2例非甲-庚型肝炎患者血清标本中分离出309 bp的病毒基因片段进行克隆后测序分析， 该 序列与日本株(AB008394)相对应位置核苷酸同源性均在98%。其中1例已注册到GenBank上， 序列号码为AF082743。
, http://www.100md.com
讨论
在非甲-庚型肝炎中70%以上病例病因不明，在我国约有8%～12%的肝炎患者为非甲-庚型 肝 炎。上述资料表明还可能存在甲-庚型以外的肝炎病毒[1,2]。1997年底，日本学 者发现一种单链DNA病毒，研究表明与转氨酶异常有密切关系，并认为是一种新的肝炎病毒 [3]。我们参照日本公布的序列设计了几套检测引物，建立了检测病毒基因的nest ed-PCR方法，开展临床TTV感染的临床流行病学研究。
TTV与已知动物单链DNA病毒相似的有圆环副链DNA病毒(圆环病毒科如鸡贫血病毒)，线状细 小病毒科(如人细小病毒B19，腺联病毒AAV)，从已知资料来看TTV更像细小病毒科。TTV与输 血后肝炎相关，TTV DNA在暴发性肝炎检出率明显高于无症状献血员。有关TTV分类及导致 肝炎及肝脏中复制情况有待于进一步研究[4]。
, 百拇医药 本组研究在45例ALT异常非甲-庚型肝炎患者中检出13例TTV，检出率为28.9%。结果表明， 在非甲- 庚型肝炎患者中，非TT病毒感染。为确认PCR所扩增出的基因片段的特异性，我们对2例PCR 扩增产物进行克隆测序，结果与日本株的同源性在98%以上，证明是同一病毒不同分离株基 因序列[5]。2例非甲-庚型肝炎患者TTV部分序列间同源性很高，这2株TTV基因之 间变异不大。对13例TTV感染者临床资料进行分析：(1) 从感染途径看，仅有2例患者存在输 血史，其他并无输血及血制品、吸毒以及不洁注射史，提示存在非血源性的感染传播途径， 13例非甲-庚型肝炎患者中排除甲-庚型肝炎病毒、EBV、CMV感染，提示TTV可能是一新的 肝炎致病因子；(2) 从临床过程看，9例以急性肝炎首次发病，其临床症状、肝功能损害程 度及病程与单纯急性甲型肝炎或戊型肝炎类似，其中有1例重型肝炎和1例慢性肝硬化患者。 有关其致病性及与其他病毒性肝炎重叠感染是否加重病情有待于进一步研究。
参考文献
, http://www.100md.com
1，Leary TP, Muerhoff AS, Simons JN, et al. Sequence and genomic organiz ation of GBV-C:a novel member of the flaviviridae associated with human non-A -E hepatitis. J Med Virol,1996,48:60-67.
2，Linnen J, Jr Wages J, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease as sociation of hepatitis G virus: a transfusion-transmissble agent. Science, 1996 ,271:505-508.
3，Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiolo gy. Biochem Biophys Res Commun,1997,241:92-97.
4，Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology research,1998,10:1-16.
5，周育森，何忠平，董京芳，等.中国人TTV部分基因的克隆及序列测定.军事医学科学院院 刊，1998；22：81-83.
收稿日期：1999-03-26, http://www.100md.com
单位：何忠平 戴旺苏 李蕴铷 徐克沂 徐道振(100011 北京地坛医院)；周育森 王海涛(军事医学科学院微生物流行病学研究所)
关键词：
中华传染病杂志000119 在急慢性输血后肝炎、散发性肝炎及爆发性肝炎中，有相当比例的患者用现有甲、乙、 丙、丁、戊、庚型肝炎实验室诊断方法尚不能分型，在排除已知的致病因素外，仍有3.50～1 5%的肝炎病人病因不明。通常将这些不明原因的肝炎称之为非甲-庚型肝炎。1997年日本学 者报道发现一种新的肝炎病毒，并命名为TT病毒(TTV)[1] 。我们根据日本报道的TTV基因序列，建立套式-聚合酶链反应(nested-PCR)方法，在我 国北京地区非甲-庚型肝炎患者中检测出TTV基因，并进行了序列分析，现将结果报道如下 。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、标本来源及试剂
45例血清样本采自北京地坛医院1997年3月至1998年3月诊断为急慢性非甲-庚型肝炎患者， 均 为2次甲、乙、丙、丁、戊型(ABBOTT公司，EIA方法)和EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)抗 体阴性，乙、丙、庚型 聚合酶链反应(PCR)检测阴性，丙氨酸转氨酶(ALT)异常(>40 U，赖氏法)，并排除自身免疫 性疾病，药物性 肝炎，酒精性肝炎，阻塞性黄疸等。Taq酶、dNTPs和T4 DNA连接酶购自华美公司，T载体、X L1-Blue菌为美国Invitrogen公司产品。STG试剂盒购自Biotronic公司,QIAprep Miniprep 质粒提取试剂为QIAgen公司产品。
二、DNA的提取及PCR方法
用STG法，取5.0 μl血清，加62.5 μl STG缓冲液，混匀，100°C变性5 min，13 000 g离 心10 min，挑除变性蛋白，加90 μl异丙醇沉淀，室温离心，沉淀物干燥后用无菌水10 μl 溶解。参考日本株(AB008394)TTV基因序列设计2对引物，引物序列分别为：P1：5′-CACCA GGAGCATATACAGA-3′;P2∶5′-TCTTCTTGCTGGTGAAA-3′;P3：5′-ACAGACAGAGGAGAAGG C-3′;P4∶5′-AACAGGCACATACTACT-3′。其中P1/P2为外引物，P3/P4为内引物。第一 轮P CR反应条件：取模板4 μl、10×PCR buffer 3 μl、dNTPs 0.8 μmol/L、P1/P2 0.1 μm ol/L,30 μl反应体积，94°C预变性180 s，94°C 40s，55°C 40s，72°C 45s，扩增 30个 循环。取第一次PCR产物2 μl作模板、10×PCR buffer 3 μl、P3/P4 0.1 μmol/L、dNTPs 0.8 μmol/L,30 μl反应体积进行第二次扩增，循环条件为：94°C预变性180 s，94°C 40s,55°C 40s,72°C 40s,扩增30个循环。取2次PCR产物10 μl用2%的琼脂糖凝胶电泳， EB染色，紫外灯下观察结果，第二次PCR扩增片段为309 bp。每次PCR均设阳性及阴性对照。
, 百拇医药
三、克隆、测序及序列分析
PCR产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后，直接与T载体连接，转化XL1-Blue宿主菌。挑取 白色菌落用PCR鉴定，对阳性菌落接种培养，提取质粒，采用Sanger末端终止法，于AB377型 自动测序仪进行双链测序。DNA序列资料采用CLUSTWAL和BLAST软件程序进行分析。
结果
一、非甲-庚型肝炎TTV感染的PCR检测
用nested-PCR方法检测45例非甲-庚型肝炎患者血清标本，检出13例(28.9%) 为TTV DNA阳性。
二、非甲-庚型肝炎患者TTV部分核酸序列分析
将2例非甲-庚型肝炎患者血清标本中分离出309 bp的病毒基因片段进行克隆后测序分析， 该 序列与日本株(AB008394)相对应位置核苷酸同源性均在98%。其中1例已注册到GenBank上， 序列号码为AF082743。
, http://www.100md.com
讨论
在非甲-庚型肝炎中70%以上病例病因不明，在我国约有8%～12%的肝炎患者为非甲-庚型 肝 炎。上述资料表明还可能存在甲-庚型以外的肝炎病毒[1,2]。1997年底，日本学 者发现一种单链DNA病毒，研究表明与转氨酶异常有密切关系，并认为是一种新的肝炎病毒 [3]。我们参照日本公布的序列设计了几套检测引物，建立了检测病毒基因的nest ed-PCR方法，开展临床TTV感染的临床流行病学研究。
TTV与已知动物单链DNA病毒相似的有圆环副链DNA病毒(圆环病毒科如鸡贫血病毒)，线状细 小病毒科(如人细小病毒B19，腺联病毒AAV)，从已知资料来看TTV更像细小病毒科。TTV与输 血后肝炎相关，TTV DNA在暴发性肝炎检出率明显高于无症状献血员。有关TTV分类及导致 肝炎及肝脏中复制情况有待于进一步研究[4]。
, 百拇医药 本组研究在45例ALT异常非甲-庚型肝炎患者中检出13例TTV，检出率为28.9%。结果表明， 在非甲- 庚型肝炎患者中，非TT病毒感染。为确认PCR所扩增出的基因片段的特异性，我们对2例PCR 扩增产物进行克隆测序，结果与日本株的同源性在98%以上，证明是同一病毒不同分离株基 因序列[5]。2例非甲-庚型肝炎患者TTV部分序列间同源性很高，这2株TTV基因之 间变异不大。对13例TTV感染者临床资料进行分析：(1) 从感染途径看，仅有2例患者存在输 血史，其他并无输血及血制品、吸毒以及不洁注射史，提示存在非血源性的感染传播途径， 13例非甲-庚型肝炎患者中排除甲-庚型肝炎病毒、EBV、CMV感染，提示TTV可能是一新的 肝炎致病因子；(2) 从临床过程看，9例以急性肝炎首次发病，其临床症状、肝功能损害程 度及病程与单纯急性甲型肝炎或戊型肝炎类似，其中有1例重型肝炎和1例慢性肝硬化患者。 有关其致病性及与其他病毒性肝炎重叠感染是否加重病情有待于进一步研究。
参考文献
, http://www.100md.com
1，Leary TP, Muerhoff AS, Simons JN, et al. Sequence and genomic organiz ation of GBV-C:a novel member of the flaviviridae associated with human non-A -E hepatitis. J Med Virol,1996,48:60-67.
2，Linnen J, Jr Wages J, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease as sociation of hepatitis G virus: a transfusion-transmissble agent. Science, 1996 ,271:505-508.
3，Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiolo gy. Biochem Biophys Res Commun,1997,241:92-97.
4，Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology research,1998,10:1-16.
5，周育森，何忠平，董京芳，等.中国人TTV部分基因的克隆及序列测定.军事医学科学院院 刊，1998；22：81-83.
收稿日期：1999-03-26, http://www.100md.com