慢性丙型肝炎患者血清病毒负荷与肝损伤及干扰素应答的关系
作者：赵西平 王宝菊 沈汉馨 郑昕 汪由坤 杨东亮 郝连杰
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院
关键词：
中华传染病杂志000117 丙型肝炎病毒(HCV)定量检测对于研究病毒致病及机体抗病毒免疫机制，评价和指导抗 病毒治疗具有重要意义。本研究选择一组慢性丙型肝炎干扰素治疗患者对其治疗前后血清HC V含量进行检测，以评价血清病毒负荷与肝组织损伤及干扰素应答的关系。
材料和方法
一、病例及治疗
29例患者均为有输血史且血清抗HCV和HCV RNA阳性，丙氨酸转氨酶(ALT)升高，病史6个月以 上，排除乙型肝炎 及其它已知原因的慢性肝病、失代偿性肝病或肝硬化。男15例，女14例，年龄23～60(平均3 6 .5)岁。给予干扰素(Roferon,罗氏制药有限公司产品)300万或重组复合干扰素(CIFN，AMGEN 公司生 产)900万或1 500万单位肌内注射，每周3次，治疗6个月，停药后随访6个月(24周)。治疗前 行肝穿刺活 组织检查，按Knodell方法[1]计算组织活动度(HAI)，治疗及随访中定期检测血清H CV RNA和ALT。所有检查均经患者知情同意，按以上标准评价治疗结束时的近期疗效及治 疗 结束后随访6个月的远期疗效。生化应答：血清ALT恢复至正常水平；病毒应答：血清HCV RN A滴度<1×104 拷贝/ml；完全应答：同时表现生化和病毒应答。
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二、血清HCV含量检测
采用Ampilsensor荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法[2]，AG-9600荧光定量PCR分析 检测系统和RT- Ampilsensor HCV RNA定量检测试剂盒由美国Biotronic Technologies公司生产，操作按说 明进行。为比较检测结果的可靠性，随机选择一份标本进行多复孔和稀释后检测。
三、统计学分析
采用χ2检验和相关分析。
结果
一、HCV RNA定量检测的重复性和敏感性比较
同一份标本三复孔检测，测值分别为：孔1：284×103,孔2：248×103,孔3：253×10 3 拷贝/ml，孔间差异介于3.3%～7.4%；将该标本作10倍和50倍稀释后检测，结果分别为3 2.5×103和6.12×103拷贝/ml，基本与预计值一致。
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二、血清HCV定量检测结果
见表1。
表1 29例患者治疗前后血清病毒含量检测结果
(拷贝/ml)
≥1
×107
≥1
×106
≥1
×105
≥1
×104
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<1
×104
平均值(×105)
治疗前
4
7
9
9
0
55.13±116.01
治疗停止时
1
1
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4
7
16
5.87±22.36
停药后24周
0
2
5
8
14
1.76±4.80
三、血清病毒含量与肝组织损伤的关系
29例患者血清ALT水平71～841(188.69±1887.72)U/L，肝组织炎症活动度指数(IAI)3～13(6 .82±2.85)，纤维化指数(FI)1～4(2.21±1.49)，总HAI为5～15(9.07±2.85)。将治疗前血 清病 毒含量进行对数转换后分析其与ALT水平、肝组织病理损伤程度结果均无明显相关(P均 >0.05)。
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四、治疗前血清病毒负荷与干扰素应答间的关系
29例接受干扰素治疗的慢性丙型肝炎患者应答状况见表2。治疗前血清病毒含量>106拷 贝 /ml者其近远期的生化、病毒及完全应答率均较病毒含量低于1×106拷贝/ml者低， 但均未 达到统计学意义水平；如以1×105拷贝/ml为界，则停药后24周的病毒及完 全应答率差别达到统计学意义水平，见表2。
讨论
迄今已有数种定量方法用于病毒含量的检测，包括竞争PCR，支链DNA探针检测(bDNA)系统， 结合RT-PCR检测方法等。各种方法检测结果存在一定误差[3]，我们应用Amplisen sor荧光定量PCR方法对一组慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前后血清病毒含量进行检测，同一 份标 本多复孔检测的孔间误差较小(小于3.3%～7.4%)，稀释后的检测结果与预计值也比较吻合， 表明其重复性和敏感性均较好。此外，该方法操作较简便，抽提后全部检测过程可在5小时 左右完成。
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表2 血清HCV含量与干扰素应答 病毒含量
(拷贝/ml)
例数
治疗24周(%)
停药24周(%)
ALT应答
病毒应答
完全应答
ALT应答
病毒应答*
完全应答*
<1×105
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9
9(100.0)
7(77.8)
7(77.8)
8(88.9)
7(77.8)
7(77.8)
>1×105
20
14(70.0)
9(45.0)
9(45.0)
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13(65.0)
7(35.5)
7(3 5.5)
共 计
29
23(79.3)
16(55.2)
16(55.2)
21(72.4)
14(48.3)
14(48.3)
*:P＝0.036
, 百拇医药
我们分析了血清病毒含量与血清ALT水平及肝组织病理损伤程度的关系，未发现它们之间存 在显著相关。此与其他作者报道相符[4]，提示HCV致肝组织损伤的机制与病毒含 量增加无关，特异和非特异抗病毒免疫与HCV致病的关系有待进一步研究。
本组病例中，治疗前血清病毒含量介于104～107拷贝/ml，经24周治疗后病毒含量 显著 下降且大多数患者停药后24周仍维持疗效。分析血清病毒含量与干扰素应答间的关系，我们 发现病毒含量较低者其对干扰素的生化和病毒应答率均较高。我们的结果支持干扰素应答与 病毒含量相关的观点[5,6]。
参考文献
1，Knodell RG, Ishak KG, Black WC, et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology, 1981,1:431-435.
, http://www.100md.com
2，Wang CN, Wu K, Wang HT. Quantitative PCR using the Amplisensor assay. In PCR primer. A laboratory manual. ed. Dieffenbarch CW and Dvekster GS. Cold Spr ing Harbor, NY, 1995.193-202.
3，Shiratori Y, Kato N, Yokosuka O, et al. Quantitative assays for hepatitis C v irus in serum as predictors of the long-term response to interferon. J Hepatolo gy, 1997,27:437-444.
4，McGuinness PH, Bishop GA, Painter DM, et al. Intrahepatic hepatitis C RNA lev els do not correlate with degree of liver injury in patients with chronic hepati tis C. Hepatology, 1996,23:676-687.
, 百拇医药
5，Yamada G, Takatani M, Kishi F, et al. Efficacy of interferon alfa therapy in chronic hepatitis C patients depends primarily on hepatitis C virus RNA level. H epatology, 1995,22:1351-1354.
6，Keeffe EB, Hollinger FB. Therapy of hepatitis C: consensus interferon trials and the consensus interferon study group. Hepatology, 1997,26(3 Suppl 1):101S-1 04S.
收稿日期：1999-02-10, 百拇医药
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院
关键词：
中华传染病杂志000117 丙型肝炎病毒(HCV)定量检测对于研究病毒致病及机体抗病毒免疫机制，评价和指导抗 病毒治疗具有重要意义。本研究选择一组慢性丙型肝炎干扰素治疗患者对其治疗前后血清HC V含量进行检测，以评价血清病毒负荷与肝组织损伤及干扰素应答的关系。
材料和方法
一、病例及治疗
29例患者均为有输血史且血清抗HCV和HCV RNA阳性，丙氨酸转氨酶(ALT)升高，病史6个月以 上，排除乙型肝炎 及其它已知原因的慢性肝病、失代偿性肝病或肝硬化。男15例，女14例，年龄23～60(平均3 6 .5)岁。给予干扰素(Roferon,罗氏制药有限公司产品)300万或重组复合干扰素(CIFN，AMGEN 公司生 产)900万或1 500万单位肌内注射，每周3次，治疗6个月，停药后随访6个月(24周)。治疗前 行肝穿刺活 组织检查，按Knodell方法[1]计算组织活动度(HAI)，治疗及随访中定期检测血清H CV RNA和ALT。所有检查均经患者知情同意，按以上标准评价治疗结束时的近期疗效及治 疗 结束后随访6个月的远期疗效。生化应答：血清ALT恢复至正常水平；病毒应答：血清HCV RN A滴度<1×104 拷贝/ml；完全应答：同时表现生化和病毒应答。
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二、血清HCV含量检测
采用Ampilsensor荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法[2]，AG-9600荧光定量PCR分析 检测系统和RT- Ampilsensor HCV RNA定量检测试剂盒由美国Biotronic Technologies公司生产，操作按说 明进行。为比较检测结果的可靠性，随机选择一份标本进行多复孔和稀释后检测。
三、统计学分析
采用χ2检验和相关分析。
结果
一、HCV RNA定量检测的重复性和敏感性比较
同一份标本三复孔检测，测值分别为：孔1：284×103,孔2：248×103,孔3：253×10 3 拷贝/ml，孔间差异介于3.3%～7.4%；将该标本作10倍和50倍稀释后检测，结果分别为3 2.5×103和6.12×103拷贝/ml，基本与预计值一致。
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二、血清HCV定量检测结果
见表1。
表1 29例患者治疗前后血清病毒含量检测结果
(拷贝/ml)
≥1
×107
≥1
×106
≥1
×105
≥1
×104
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<1
×104
平均值(×105)
治疗前
4
7
9
9
0
55.13±116.01
治疗停止时
1
1
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4
7
16
5.87±22.36
停药后24周
0
2
5
8
14
1.76±4.80
三、血清病毒含量与肝组织损伤的关系
29例患者血清ALT水平71～841(188.69±1887.72)U/L，肝组织炎症活动度指数(IAI)3～13(6 .82±2.85)，纤维化指数(FI)1～4(2.21±1.49)，总HAI为5～15(9.07±2.85)。将治疗前血 清病 毒含量进行对数转换后分析其与ALT水平、肝组织病理损伤程度结果均无明显相关(P均 >0.05)。
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四、治疗前血清病毒负荷与干扰素应答间的关系
29例接受干扰素治疗的慢性丙型肝炎患者应答状况见表2。治疗前血清病毒含量>106拷 贝 /ml者其近远期的生化、病毒及完全应答率均较病毒含量低于1×106拷贝/ml者低， 但均未 达到统计学意义水平；如以1×105拷贝/ml为界，则停药后24周的病毒及完 全应答率差别达到统计学意义水平，见表2。
讨论
迄今已有数种定量方法用于病毒含量的检测，包括竞争PCR，支链DNA探针检测(bDNA)系统， 结合RT-PCR检测方法等。各种方法检测结果存在一定误差[3]，我们应用Amplisen sor荧光定量PCR方法对一组慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前后血清病毒含量进行检测，同一 份标 本多复孔检测的孔间误差较小(小于3.3%～7.4%)，稀释后的检测结果与预计值也比较吻合， 表明其重复性和敏感性均较好。此外，该方法操作较简便，抽提后全部检测过程可在5小时 左右完成。
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表2 血清HCV含量与干扰素应答 病毒含量
(拷贝/ml)
例数
治疗24周(%)
停药24周(%)
ALT应答
病毒应答
完全应答
ALT应答
病毒应答*
完全应答*
<1×105
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9
9(100.0)
7(77.8)
7(77.8)
8(88.9)
7(77.8)
7(77.8)
>1×105
20
14(70.0)
9(45.0)
9(45.0)
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13(65.0)
7(35.5)
7(3 5.5)
共 计
29
23(79.3)
16(55.2)
16(55.2)
21(72.4)
14(48.3)
14(48.3)
*:P＝0.036
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我们分析了血清病毒含量与血清ALT水平及肝组织病理损伤程度的关系，未发现它们之间存 在显著相关。此与其他作者报道相符[4]，提示HCV致肝组织损伤的机制与病毒含 量增加无关，特异和非特异抗病毒免疫与HCV致病的关系有待进一步研究。
本组病例中，治疗前血清病毒含量介于104～107拷贝/ml，经24周治疗后病毒含量 显著 下降且大多数患者停药后24周仍维持疗效。分析血清病毒含量与干扰素应答间的关系，我们 发现病毒含量较低者其对干扰素的生化和病毒应答率均较高。我们的结果支持干扰素应答与 病毒含量相关的观点[5,6]。
参考文献
1，Knodell RG, Ishak KG, Black WC, et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology, 1981,1:431-435.
, http://www.100md.com
2，Wang CN, Wu K, Wang HT. Quantitative PCR using the Amplisensor assay. In PCR primer. A laboratory manual. ed. Dieffenbarch CW and Dvekster GS. Cold Spr ing Harbor, NY, 1995.193-202.
3，Shiratori Y, Kato N, Yokosuka O, et al. Quantitative assays for hepatitis C v irus in serum as predictors of the long-term response to interferon. J Hepatolo gy, 1997,27:437-444.
4，McGuinness PH, Bishop GA, Painter DM, et al. Intrahepatic hepatitis C RNA lev els do not correlate with degree of liver injury in patients with chronic hepati tis C. Hepatology, 1996,23:676-687.
, 百拇医药
5，Yamada G, Takatani M, Kishi F, et al. Efficacy of interferon alfa therapy in chronic hepatitis C patients depends primarily on hepatitis C virus RNA level. H epatology, 1995,22:1351-1354.
6，Keeffe EB, Hollinger FB. Therapy of hepatitis C: consensus interferon trials and the consensus interferon study group. Hepatology, 1997,26(3 Suppl 1):101S-1 04S.
收稿日期：1999-02-10, 百拇医药