重型乙型肝炎肝内细胞间粘附分子-1mRNA的表达
作者：张绪清 顾长海 张瑞 王宇明
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军传染病专科中心
关键词：细胞间粘附分子-1；乙型肝炎
中华传染病杂志000107【摘要】目的 探讨细胞间粘附分子-1(ICAM-1) mRNA在重型乙型肝炎肝内的表达水平及其意义。方法 用原位杂交技术检测11例非肝病对照者，5例慢性无症状HBsAg携带者(AsC)、15例慢性乙型 肝炎和30例重型乙型肝炎患者肝内ICAM-1 mRNA原位表达。结果 非肝病者和AsC肝细胞无ICAM-1 mRNA表达；重型乙型肝炎患者肝细胞ICAM-1 mRNA表达明 显增强，其表达水平显著高于慢性乙型肝炎。结论 ICAM-1在重型乙型肝炎肝坏死中起重要作用。
Hepatic expression of intercellular adhesion molecule-1 mRN A in severe viral hepatitis B
, 百拇医药
ZHANG Xuqing GU Changhai ZHANG Rui et al.
(Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital,The Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
【Abstract】Objective To study hepatic expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) mRNA and its role in the pathogenesis of severe viral hepatitis B. Methods Hepatic expression of ICMA-1 mRNA was studied in 11 individuals without liver d iseases, 5 chronic asymptomatic HBsAg carriers (AsC), 15 patients with chronic h epatitis B and 30 patients with severe hepatitis B by in situ hybridization. Results No ICAM-1 mRNA expression was found in the hepatocytes on the specimens from in dividuals without liver diseases and AsC. Enhanced expression of ICAM-1 mRNA was observe d on the hepatocytes in the patients with severe hepatitis B, and it was stronge r than that in the patients with chronic hepatitis B. Conclusion IC AM-1 plays an important role in the mechanism respons ible for liver necrosis in the patients with severe viral hepatitis B.
, 百拇医药
【Key words】Intercellular adhesion molecule-1; H epatitis B
细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)属免疫球蛋白 超家 族成员，其配体是淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated antigen- 1,LFA-1)[1]。近年研究表明ICAM-1/LFA-1介导的细胞粘附在慢性乙型肝炎免疫 发病机制中起重要作用[2]，但有关重型乙型肝炎肝内ICAM-1表达的研究较少。我 们旨在探讨重型乙型肝炎患者肝内ICAM-1 mRNA表达水平及其意义。
材料与方法
一、对象
50例乙型肝炎病毒(HBV)感染者均为我院1996～1998年的住院患者，男41例，女9例，平均年 龄34.6岁，其中 慢性无症状HBsAg携带者(AsC)5例、轻度慢性肝炎15例、急性重型肝炎2例、亚急性重 型肝炎6例、慢性重型肝炎22例，诊断均符合1995年全国传染病与寄生虫病学 术会议修订的病毒性肝炎防治方案的标准。对照组11例均为意外事故死亡者，血清HBsAg、 丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、HBV DNA、HCV RNA均阴性，常规病理检查显示均为正常肝 组织。
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二、试剂
两条寡核苷酸(ODN)由中国科学院上海生物化学研究所合成，其中一条ODN1序列为5′-GG GACCCATAGC GAGGCTGAGGTTGCAA-3′，与ICAM-1 mRNA 5′末端翻译起始位点序列(nt63～81)互补，另 一条ODN2序列与ODN1互补；ODN3′末端地高辛(DIG)标记试剂盒，碱性磷酸标记的抗地 高辛抗体(抗-DIG-AP)和NBT/BCIP显色液由德国宝灵曼公司提供；杂交液含50%去离子甲酰 胺、5×SSC、5×Denhardt's液、0.25%SDS、100 μg/ml变性鲑精DNA和10%硫酸葡聚糖。
三、方法
(一) 标本保存及切片制备 每例肝组织分成2份，1份用10%甲醛溶液固定制成石蜡切片作常 规病理检查；另1份用去RNA酶的过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(PLP)溶液固定、去RNA酶的8. 5%蔗糖/PBS溶液漂洗后置液氮中保存，并制成5 μm厚的冰冻切片。
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(二) 制备DIG标记的ICAM-1寡核苷酸探针 按试剂盒说明书提供的方法对ODN1 和ODN2进行3′末端标记，各获得100 pmol(1 400 ng)的探针，其中DIG标记的ODN 1为检测ICAM-1 mRNA的探针。
(三) 原位杂交检测肝组织ICAM mRNA 为避免肝组织的mRNA被降解，实验过程中的全部试剂 均用去RNA酶的DEPC水配制，全部器材均经去RNA酶处理。按照《非放射性杂交技术》介绍的 方法，稍加修改后进行，主要步骤如下：(1) 肝组织冰冻切片自然风干后，4%多聚甲醛/PBS 溶液固定15 min，蛋白酶K(5 μg/ml)消化15 min，0.1 mol甘氨酸/PBS处理5 min，4%多聚 甲醛/PBS溶液固定10 min，PBS溶液漂洗5 min×3次，2×SSC溶液漂洗15 min;(2) 将杂交液 在100°C加温10 min，将制备的探针用杂交液稀释20倍，将含有ICAM-1探针的杂交液 滴加 在切片上，放入湿盒37°C杂交24 h；(3) 系列SSC溶液漂洗；(4) 用封闭试剂封闭后加 入抗 -DIG-AP,4°C 16 h;(5) 用1号(100 min Tris-HCl, pH 7.5, 150 mol NaCl)和3号(100 mol Tris-HCl, pH 9.5, 100 mol NaCl, 50 mmol MgCl2) DIG缓冲液漂洗后加NBT/BCIP 溶 液显色，光镜下见紫色颗粒为阳性，肝细胞ICAM-1 mRNA表达强度分级参照Chu等提出 的标 准：肝细胞不着色为-，肝细胞着色<10%为+，10%～50%为++,>50%为+++。对照设置：不 加探针为阴性对照，加DIG标记的ODN2为特异对照。避免ICAM-1探针与ICAM-1基因组DNA 杂交出 现假阳性结果，实验中未对组织切片进行高温变性处理。
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四、统计学方法
用秩和检验。
结 果
一、ICAM-1 mRNA表达
正常人和AsC肝组织内，肝窦内皮，枯否细胞和血管内皮细胞有少量ICAM-1 mRNA表达，肝 细胞无ICAM-1 mRNA表达。在慢性和重型乙型肝炎，肝细胞出现不同程度ICAM-1 mRNA表达 ，且肝窦内皮、血管内皮细胞ICAM-1 mRNA表达增强。阳性表达位于胞浆中，少数伴有核着 色。在慢性乙型肝炎，ICAM-1 mRNA阳性肝细胞多呈散在分布；在重型乙型肝炎，肝细 胞呈大片状坏死或桥形坏死，残存肝细胞和再生肝细胞大量表达ICAM-1 mRNA。
二、肝细胞ICAM-1 mRNA表达水平
重型肝炎患者肝细胞ICAM-1 mRNA表达显著强于慢性肝炎、AsC和正常人，P<0.01(表1) 。
, 百拇医药
表1 肝细胞ICAM-1 mRNA表达 组别
例数
ICAM-1 mRNA
-
+
++
+++
正常人
11
11
0
0
0
, 百拇医药
AsC
5
5
0
0
0
慢性肝炎
15
0
9
6
0
重型肝炎
30
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0
1
5
24
三、肝细胞ICAM-1 mRNA表达与肝坏死程度
存在大块或亚大块肝坏死者肝细胞ICAM-1 mRNA表达强度显著高于肝内具有桥形坏死者， P<0.05；桥形坏死者ICAM-1 mRNA表达强度显著高于点状或灶性坏死者，P<0.05(表2 )。表2 ICAM-1 mRNA表达与肝细胞坏死程度 病理表现
例数
染色强度
-
+
, 百拇医药
++
+++
无坏死
16
16
0
0
0
点状或灶性坏死
11
0
8
3
0
, 百拇医药
碎屑状坏死
4
0
1
3
0
桥形坏死
13
0
1
5
7
大块或亚大块坏死
17
, 百拇医药
0
0
0
17
讨 论 ICAM-1/LFA-1在介导淋巴细胞与血管内皮细胞粘附中起重要作用[1，2]。在正常 人和慢性无症状HBsAg携带者肝组织内，肝窦内皮和血管内皮细胞仅有少量ICAM-1 m RNA表达，与肝组织ICAM-1蛋白表达相似[3]；乙型重型肝炎患者肝窦内皮和血管 内皮细胞ICAM-1 mRNA表达明显增强，有利于淋巴细胞粘附血管内皮，并向肝组织中浸润， 为重型肝炎免疫肝损伤创造条件。
本研究显示正常人和AsC肝细胞无ICAM-1 mRNA表达，重型乙型肝炎患 者肝细胞ICAM-1 mRNA表达明显增强，并显著强于慢性肝炎，ICAM-1 mRNA阳性肝 细胞多位 于汇管区周围和腺泡内炎症坏死区域，与肝组织ICAM-1蛋白表达相似[4]，提 示重型乙型肝炎的肝坏死与肝细胞ICAM-1 mRNA表达密切相关。
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乙型肝炎患者肝损害越重，其肝细胞ICAM-1 mRNA表达越强；肝组织坏死越重，其肝细 胞ICAM-1 mRNA表达也越强。说明肝细胞ICAM-1表达参与介导乙型肝炎肝细胞坏 死，ICAM-1在重型乙型肝炎的免疫发病机制中起重要作用。
ICAM-1/LFA-1相互作用能增强细胞毒性T细胞(CTL)细胞对靶肝细胞表达抗原和MHC-1分子 的“双识别”， 强化CTL细胞对靶肝细胞的结合、攻击和破坏。活化CTL细胞(LFA-1阳性)对靶肝细胞的毒性 效应接受ICAM-1的调控[4，5]。
参考文献
1，Wawryk SO, Novotny JR, Wicks IP, et al. The role of the LFA-1/ICAM -1 interaction in human leukocyte homing and adhesion. Immunol Rev, 1989, 108:1 35-161.
, 百拇医药
2，Volpes R, Van Den Oord JJ, Desmet VJ. Hepatic expression of intercellular a dhesion molecule-1(ICAM-1) in viral hepatitis B. Hepatology, 1990, 12:148-154 .
3，张绪清，顾长海.乙型肝炎肝细胞间粘附分子-1表达.中华肝脏病杂志，1998； 6：206 -207.
4，Chu CM, Liaw YF. Coexpression of intercellular adhesion molecule-1 and c lass I major histocompatibility complex antigens on hepatocyte membrane in chronic v iral hepatiits. J Clin Pathol, 1993, 46:1004-1008.
5，Doi T, Yamada G, Mizuno M, et al. Immunohistochemical study of the distributi on of intercellular adhesion molecule-1 and lymphocyte function-associated ant igen-1 in chronic type B hepatitis. J Gastroenterol 1994, 29:164-171.
收稿：1999-09-20, http://www.100md.com
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军传染病专科中心
关键词：细胞间粘附分子-1；乙型肝炎
中华传染病杂志000107【摘要】目的 探讨细胞间粘附分子-1(ICAM-1) mRNA在重型乙型肝炎肝内的表达水平及其意义。方法 用原位杂交技术检测11例非肝病对照者，5例慢性无症状HBsAg携带者(AsC)、15例慢性乙型 肝炎和30例重型乙型肝炎患者肝内ICAM-1 mRNA原位表达。结果 非肝病者和AsC肝细胞无ICAM-1 mRNA表达；重型乙型肝炎患者肝细胞ICAM-1 mRNA表达明 显增强，其表达水平显著高于慢性乙型肝炎。结论 ICAM-1在重型乙型肝炎肝坏死中起重要作用。
Hepatic expression of intercellular adhesion molecule-1 mRN A in severe viral hepatitis B
, 百拇医药
ZHANG Xuqing GU Changhai ZHANG Rui et al.
(Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital,The Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
【Abstract】Objective To study hepatic expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) mRNA and its role in the pathogenesis of severe viral hepatitis B. Methods Hepatic expression of ICMA-1 mRNA was studied in 11 individuals without liver d iseases, 5 chronic asymptomatic HBsAg carriers (AsC), 15 patients with chronic h epatitis B and 30 patients with severe hepatitis B by in situ hybridization. Results No ICAM-1 mRNA expression was found in the hepatocytes on the specimens from in dividuals without liver diseases and AsC. Enhanced expression of ICAM-1 mRNA was observe d on the hepatocytes in the patients with severe hepatitis B, and it was stronge r than that in the patients with chronic hepatitis B. Conclusion IC AM-1 plays an important role in the mechanism respons ible for liver necrosis in the patients with severe viral hepatitis B.
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【Key words】Intercellular adhesion molecule-1; H epatitis B
细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)属免疫球蛋白 超家 族成员，其配体是淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated antigen- 1,LFA-1)[1]。近年研究表明ICAM-1/LFA-1介导的细胞粘附在慢性乙型肝炎免疫 发病机制中起重要作用[2]，但有关重型乙型肝炎肝内ICAM-1表达的研究较少。我 们旨在探讨重型乙型肝炎患者肝内ICAM-1 mRNA表达水平及其意义。
材料与方法
一、对象
50例乙型肝炎病毒(HBV)感染者均为我院1996～1998年的住院患者，男41例，女9例，平均年 龄34.6岁，其中 慢性无症状HBsAg携带者(AsC)5例、轻度慢性肝炎15例、急性重型肝炎2例、亚急性重 型肝炎6例、慢性重型肝炎22例，诊断均符合1995年全国传染病与寄生虫病学 术会议修订的病毒性肝炎防治方案的标准。对照组11例均为意外事故死亡者，血清HBsAg、 丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、HBV DNA、HCV RNA均阴性，常规病理检查显示均为正常肝 组织。
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二、试剂
两条寡核苷酸(ODN)由中国科学院上海生物化学研究所合成，其中一条ODN1序列为5′-GG GACCCATAGC GAGGCTGAGGTTGCAA-3′，与ICAM-1 mRNA 5′末端翻译起始位点序列(nt63～81)互补，另 一条ODN2序列与ODN1互补；ODN3′末端地高辛(DIG)标记试剂盒，碱性磷酸标记的抗地 高辛抗体(抗-DIG-AP)和NBT/BCIP显色液由德国宝灵曼公司提供；杂交液含50%去离子甲酰 胺、5×SSC、5×Denhardt's液、0.25%SDS、100 μg/ml变性鲑精DNA和10%硫酸葡聚糖。
三、方法
(一) 标本保存及切片制备 每例肝组织分成2份，1份用10%甲醛溶液固定制成石蜡切片作常 规病理检查；另1份用去RNA酶的过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(PLP)溶液固定、去RNA酶的8. 5%蔗糖/PBS溶液漂洗后置液氮中保存，并制成5 μm厚的冰冻切片。
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(二) 制备DIG标记的ICAM-1寡核苷酸探针 按试剂盒说明书提供的方法对ODN1 和ODN2进行3′末端标记，各获得100 pmol(1 400 ng)的探针，其中DIG标记的ODN 1为检测ICAM-1 mRNA的探针。
(三) 原位杂交检测肝组织ICAM mRNA 为避免肝组织的mRNA被降解，实验过程中的全部试剂 均用去RNA酶的DEPC水配制，全部器材均经去RNA酶处理。按照《非放射性杂交技术》介绍的 方法，稍加修改后进行，主要步骤如下：(1) 肝组织冰冻切片自然风干后，4%多聚甲醛/PBS 溶液固定15 min，蛋白酶K(5 μg/ml)消化15 min，0.1 mol甘氨酸/PBS处理5 min，4%多聚 甲醛/PBS溶液固定10 min，PBS溶液漂洗5 min×3次，2×SSC溶液漂洗15 min;(2) 将杂交液 在100°C加温10 min，将制备的探针用杂交液稀释20倍，将含有ICAM-1探针的杂交液 滴加 在切片上，放入湿盒37°C杂交24 h；(3) 系列SSC溶液漂洗；(4) 用封闭试剂封闭后加 入抗 -DIG-AP,4°C 16 h;(5) 用1号(100 min Tris-HCl, pH 7.5, 150 mol NaCl)和3号(100 mol Tris-HCl, pH 9.5, 100 mol NaCl, 50 mmol MgCl2) DIG缓冲液漂洗后加NBT/BCIP 溶 液显色，光镜下见紫色颗粒为阳性，肝细胞ICAM-1 mRNA表达强度分级参照Chu等提出 的标 准：肝细胞不着色为-，肝细胞着色<10%为+，10%～50%为++,>50%为+++。对照设置：不 加探针为阴性对照，加DIG标记的ODN2为特异对照。避免ICAM-1探针与ICAM-1基因组DNA 杂交出 现假阳性结果，实验中未对组织切片进行高温变性处理。
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四、统计学方法
用秩和检验。
结 果
一、ICAM-1 mRNA表达
正常人和AsC肝组织内，肝窦内皮，枯否细胞和血管内皮细胞有少量ICAM-1 mRNA表达，肝 细胞无ICAM-1 mRNA表达。在慢性和重型乙型肝炎，肝细胞出现不同程度ICAM-1 mRNA表达 ，且肝窦内皮、血管内皮细胞ICAM-1 mRNA表达增强。阳性表达位于胞浆中，少数伴有核着 色。在慢性乙型肝炎，ICAM-1 mRNA阳性肝细胞多呈散在分布；在重型乙型肝炎，肝细 胞呈大片状坏死或桥形坏死，残存肝细胞和再生肝细胞大量表达ICAM-1 mRNA。
二、肝细胞ICAM-1 mRNA表达水平
重型肝炎患者肝细胞ICAM-1 mRNA表达显著强于慢性肝炎、AsC和正常人，P<0.01(表1) 。
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表1 肝细胞ICAM-1 mRNA表达 组别
例数
ICAM-1 mRNA
-
+
++
+++
正常人
11
11
0
0
0
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AsC
5
5
0
0
0
慢性肝炎
15
0
9
6
0
重型肝炎
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0
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三、肝细胞ICAM-1 mRNA表达与肝坏死程度
存在大块或亚大块肝坏死者肝细胞ICAM-1 mRNA表达强度显著高于肝内具有桥形坏死者， P<0.05；桥形坏死者ICAM-1 mRNA表达强度显著高于点状或灶性坏死者，P<0.05(表2 )。表2 ICAM-1 mRNA表达与肝细胞坏死程度 病理表现
例数
染色强度
-
+
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++
+++
无坏死
16
16
0
0
0
点状或灶性坏死
11
0
8
3
0
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碎屑状坏死
4
0
1
3
0
桥形坏死
13
0
1
5
7
大块或亚大块坏死
17
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0
0
0
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讨 论 ICAM-1/LFA-1在介导淋巴细胞与血管内皮细胞粘附中起重要作用[1，2]。在正常 人和慢性无症状HBsAg携带者肝组织内，肝窦内皮和血管内皮细胞仅有少量ICAM-1 m RNA表达，与肝组织ICAM-1蛋白表达相似[3]；乙型重型肝炎患者肝窦内皮和血管 内皮细胞ICAM-1 mRNA表达明显增强，有利于淋巴细胞粘附血管内皮，并向肝组织中浸润， 为重型肝炎免疫肝损伤创造条件。
本研究显示正常人和AsC肝细胞无ICAM-1 mRNA表达，重型乙型肝炎患 者肝细胞ICAM-1 mRNA表达明显增强，并显著强于慢性肝炎，ICAM-1 mRNA阳性肝 细胞多位 于汇管区周围和腺泡内炎症坏死区域，与肝组织ICAM-1蛋白表达相似[4]，提 示重型乙型肝炎的肝坏死与肝细胞ICAM-1 mRNA表达密切相关。
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乙型肝炎患者肝损害越重，其肝细胞ICAM-1 mRNA表达越强；肝组织坏死越重，其肝细 胞ICAM-1 mRNA表达也越强。说明肝细胞ICAM-1表达参与介导乙型肝炎肝细胞坏 死，ICAM-1在重型乙型肝炎的免疫发病机制中起重要作用。
ICAM-1/LFA-1相互作用能增强细胞毒性T细胞(CTL)细胞对靶肝细胞表达抗原和MHC-1分子 的“双识别”， 强化CTL细胞对靶肝细胞的结合、攻击和破坏。活化CTL细胞(LFA-1阳性)对靶肝细胞的毒性 效应接受ICAM-1的调控[4，5]。
参考文献
1，Wawryk SO, Novotny JR, Wicks IP, et al. The role of the LFA-1/ICAM -1 interaction in human leukocyte homing and adhesion. Immunol Rev, 1989, 108:1 35-161.
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2，Volpes R, Van Den Oord JJ, Desmet VJ. Hepatic expression of intercellular a dhesion molecule-1(ICAM-1) in viral hepatitis B. Hepatology, 1990, 12:148-154 .
3，张绪清，顾长海.乙型肝炎肝细胞间粘附分子-1表达.中华肝脏病杂志，1998； 6：206 -207.
4，Chu CM, Liaw YF. Coexpression of intercellular adhesion molecule-1 and c lass I major histocompatibility complex antigens on hepatocyte membrane in chronic v iral hepatiits. J Clin Pathol, 1993, 46:1004-1008.
5，Doi T, Yamada G, Mizuno M, et al. Immunohistochemical study of the distributi on of intercellular adhesion molecule-1 and lymphocyte function-associated ant igen-1 in chronic type B hepatitis. J Gastroenterol 1994, 29:164-171.
收稿：1999-09-20, http://www.100md.com