降钙素基因相关肽阳性神经纤维在鼠颞下颌关节中的分布
作者：刘向辉 斯方杰 周树夏 饶志仁
单位：刘向辉(第四军医大学口腔医学院颌面外科 西安 710032)；斯方杰 周树夏(现在南京市八一医院口腔科 210002)；饶志仁(第四军医大学神经生物研究所)
关键词：颞下颌关节；降钙素基因相关肽；神经纤维
中华口腔医学杂志000113 摘 要：目的 观察鼠颞下颌关节中降钙素基因相关肽阳性神经纤维的分布特征。方法 将鼠颞下颌关节取出，脱钙脱水后恒冷切片，以ABC法漂染后进行镜检及半定量分析。结果 除关节盘中心区外，颞下颌关节各部位的软组织均有丰富的降钙素基因相关肽阳性纤维，主要沿血管尤其是动脉周围分布，密度为：前部盘周附着和关节囊(454.6±72.8)mm2、后部(302.7±43.4)mm2、外侧(240.2±23.6)mm2、内侧(229.6±25.0)mm2、盘外周区(202.4±35.2)mm2。结论 降钙素基因相关肽阳性纤维广泛分布于颞下颌关节中，是感觉神经的一部分，其密度以关节前部盘周附着及关节囊中最高。
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Distribution of calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive fibres in the temporomandibular joint of rat
LIU Xianghui
(Department of Stomatology, the Eighty-first Hospital of PLA, Nangjing 210002, China)
SI Fangjie
ZHOU Shuxia, et al.
Abstract：Objective To observe the distribution of calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive (CGRP-LI) nerve fibres in rat's tempormandibular joint (TMJ). Methods The avidin-biotin-peroxidase complex method and image analysis were employed to detect CGRP-LI nerve fibres in frozen sections of TMJs in eight rats. Results CGRP-LI nerve fibres were plentifully distributed in TMJs except the central disc band and bone, mainly in the periphery of blood vessels, especially arteries. Density: anterior disc attachment and capsule, (454.6±72.8) mm2; posterior portion, (302.7±43.4)mm2; lateral portion, (240.2±23.6)mm2; medial portion, (229.6±25.0)mm2; and peripheral portion of disc, (202.4±35.2)mm2. Conclusion CGRP-LI nerve fibres were widely distributed in rat TMJ and were a part of trigeminal sensory nerve. Density was highest in anterior disc attachment and capsule.
, 百拇医药
Key words：Temporomandibular joint; Calcitonin gene-related peptide; Nerve fibers▲
降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是初级感觉神经的兴奋性递质，由37个氨基酸组成，其生物活性高，有效浓度低[1]。近年的研究表明，CGRP在膝、踝等滑膜关节的发病机制中有十分重要的作用[2]。而Alstergren等[3]检测颞下颌关节(temporomandibular joint, TMJ)内紊乱病和类风湿关节炎患者滑液中CGRP的浓度，结果显著高于正常TMJ及炎性膝关节滑液中的水平。因此认为CGRP与TMJ疾病的关系可能更密切。本项实验观察鼠TMJ中CGRP阳性纤维的分布，为研究神经因素在TMJ疾病中的作用提供形态学依据。
材料和方法
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1.标本制备：取雄性SD大鼠8只(重180～220 g，鼠龄4周)，经其腹膜下注射1%戊巴比妥钠1ml，打开胸腔，经心插管至升主动脉，灌注固定，取双侧TMJ置于15% EDTA(乙二胺四乙酸)中脱钙4周，在20%蔗糖液中脱水24 h。每只大鼠的两侧关节均用恒冷切片机分别行矢状及冠状切片，片厚45 μm。
2.染色：将经0.3 % Triton-X-100洗涤后的切片用含0.3% H2O2的甲醛和10%的羊血清依次封闭内源性过氧化物酶和生物素，然后分为实验组和对照组。实验组加1:7 000稀释的一抗，即兔抗鼠CGRP血清(Watpa，新西兰),置于4℃湿盒中48 h, 再经0.01 mol/L磷酸缓冲盐水(PBS)清洗后，加生物素化羊抗兔血清，置于4℃湿盒中12 h；清洗后加ABC复合物，置室温下3 h。以0.01 mol/L PBS洗3遍，双蒸水洗2遍备用。将50 mg DAB溶于50 ml蒸馏水中，将2.5 g硫酸镍胺溶于50 ml 0.2 mol/L醋酸缓冲液中(pH值为6.2),两者过滤后混合,再加入200mg葡萄糖及40mg氯化胺,搅匀后加0.8mg葡萄糖氧化酶(Sigma，美国)。将切片置入上液中反应20min,终止反应。
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3.对照实验：①空白对照：用0.01 mol/L PBS取代一抗;②血清对照：用健康兔血清取代一抗；③吸收对照:用合成的鼠CGRP纯品(Watpa,新西兰) 1.0 μmol/L加入稀释的一抗，置于4℃湿盒中48 h，离心，取其上清液代替一抗。其余步骤均同实验组。
4.镜下观察,摄片,进行计算机图像分析。
结果
除关节盘中心区和骨质外，鼠TMJ各部位均有丰富的CGRP阳性纤维分布，纤维直径0.35～0.80 μm,多为中等粗细，其走行迂曲，方向不规则。多数纤维由棕黑色膨体呈串珠状构成，少数细纤维呈近似均质的腊肠状。在关节囊、盘周附着及骨膜等组织中阳性纤维主要沿血管，尤其是动脉血管周围，呈环状或放射状分布；部分以网状、丛状或游离神经末梢分布于结缔组织中，常见到由几条纤维组成的纤维束(图1)。在关节盘外周(前、后带及中间带的内外侧边缘区)，阳性纤维呈树枝状或丛状分布，主要位于近关节腔的盘上及盘下1/3区。纤维末梢多终止于关节盘上下表面，越靠近关节盘中心区，纤维越少(图2)。滑膜中CGRP阳性纤维丰富，呈网状或树枝状迂曲走行于内膜下层，部分末梢穿过内膜层后显著曲张，终止于滑膜表面。特别在滑膜皱襞和指状突起中，阳性纤维更多且曲张更明显(图3)。
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图1 盘前附着区CGRP阳性纤维呈放射状和网状分布(ABC×20)
图2 关节盘外周区阳性纤维呈树枝状分布于盘上、下1/3区(ABC×20)
图3 滑膜层CGRP阳性纤维呈网状或树枝状分布(ABC×20)
为了检测TMJ各部位CGRP阳性纤维的密度，本项研究将关节分为5个区：Ⅰ 前部盘周附着和关节囊；Ⅱ 盘外周区；Ⅲ 后部盘周附着和关节囊；Ⅳ 外侧盘周附着和关节囊；Ⅴ 内侧盘周附着和关节囊。每只实验动物各随机选取关节中部矢状和冠状切片一张，在矢状切片中观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区，在冠状切片中观察Ⅳ、Ⅴ区。各切片在观察区选一个标准视野，用计算机图像分析仪测量每区CGRP阳性纤维的表面积，各区分别相加，取其均值。结果：Ⅰ区为(454.6±72.8)mm2,Ⅱ区为(202.4±35.2)mm2,Ⅲ区为(302.7±43.4)mm2,Ⅳ区为(240.2±23.6)mm2,Ⅴ区为(229.6±25.0)mm2;即Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ>Ⅱ。统计学分析表明：Ⅰ与Ⅲ、Ⅲ与Ⅳ、Ⅳ与Ⅱ之间，差异有显著性(P<0.05)；Ⅳ与Ⅴ、Ⅴ与Ⅱ之间，差异无显著性。对照组中均无阳性反应。
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讨论
以往有关TMJ中CGRP阳性纤维的研究尚不多见。Ichikawa等[4]认为，出生10天内的幼鼠关节盘中有CGRP阳性纤维，但在成年鼠中消失；而Kido等[5]发现，鼠TMJ软组织中除关节盘中心区外均有CGRP阳性纤维分布，但未对其密度进行定量分析。我们的结果表明，除盘中心区和骨组织外，TMJ各部位均有丰富的CGRP阳性纤维，主要沿小血管尤其是动脉周围分布，密度以前部盘周附着和关节囊中最高，与文献报道盘后附着中神经更丰富有所不同。这可能与CGRP纤维分布特性有关。观察表明盘前附着区面积小于盘后附着区，但血管密度更高。
关于TMJ关节盘及滑膜中有无神经分布，学者们一直存有争议。Dresson[6]认为TMJ盘及部分滑膜中没有神经支配，而Kido等[5]的研究发现滑膜及关节盘中有三叉神经分布。本项实验结果表明，除关节盘中心区外，关节盘外周区及滑膜中均有丰富的CGRP阳性纤维分布，其走行多靠近关节腔，末梢多终止于关节盘及滑膜表面。
, 百拇医药
TMJ中的CGRP阳性纤维是感觉神经的一部分。各种伤害性剌激因子，如创伤、压力、精神紧张和炎症介质如胶原酶、前列腺素E2等，都能激活伤害感受器引起CGRP合成和释放增加[1，2]。它们可能具有以下作用：①顺行向中枢传导痛觉，逆行释放于TMJ引起痛觉过敏，特别是滑膜及关节盘表面的CGRP纤维，对滑膜炎及滑液性质改变时的痛觉传递具有重要作用；②引起神经源性炎症：CGRP是迄今为止发现的最有效的血管活性物质，能显著扩张微血管，尤其是动脉，引起局部充血；还能抑制神经肽P物质的降解，与其共同促进血管壁通透性增加和炎症介质的释放，引起炎性水肿；③促进成纤维细胞及滑膜细胞的增生和分泌胶原酶、前列腺素E2等，引起关节结构的破坏[1，2]。可见感觉神经不单具有感觉功能而且参与关节疾病的发生与发展。因此，可以认为感觉神经去除术或应用CGRP等的拮抗剂，对治疗TMJ疾病应具有重要意义。
参考文献：
, 百拇医药
[1]Kenneth M, Hargreaves J, Swift M, et al. Pharmacology of peripheral neuropeptide and inflammatory mediator release. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, 1994, 78:503-509.
[2]Cruwys SC. Sensory denervation with capsaicin attenuates inflammation and nociception in arthritic rats. Neurosci Lett, 1995, 67:235-243.
[3]Alstergren P, Appelgren A, Appelgren B, et al. Co-variation of neuropeptide Y, calcitonin gene-related peptide, substance P and neurokinin A in joint fluid from patients with temporomandibular joint arthritis. Arch Oral Biol, 1995, 40:127-135.
, 百拇医药
[4]Ichikawa H, Wakisaka S, Matsuo S, et al. Peptidergic innervation of the temporomandibular disc in the rat. Experientia, 1989, 45:303-304.
[5]Kido MA, Kiyoshima T, Kondo T, et al. Distribution of substance P and calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive nerve fibers in the rat temporomandibular joint. J Dent Res, 1993, 72:592-598.
[6]Dresson D. Sensory innervation of the temporomandibular joint in the mouse. Acta Anat, 1990, 139:154-160.
收稿日期： 1998-12-05, 百拇医药
单位：刘向辉(第四军医大学口腔医学院颌面外科 西安 710032)；斯方杰 周树夏(现在南京市八一医院口腔科 210002)；饶志仁(第四军医大学神经生物研究所)
关键词：颞下颌关节；降钙素基因相关肽；神经纤维
中华口腔医学杂志000113 摘 要：目的 观察鼠颞下颌关节中降钙素基因相关肽阳性神经纤维的分布特征。方法 将鼠颞下颌关节取出，脱钙脱水后恒冷切片，以ABC法漂染后进行镜检及半定量分析。结果 除关节盘中心区外，颞下颌关节各部位的软组织均有丰富的降钙素基因相关肽阳性纤维，主要沿血管尤其是动脉周围分布，密度为：前部盘周附着和关节囊(454.6±72.8)mm2、后部(302.7±43.4)mm2、外侧(240.2±23.6)mm2、内侧(229.6±25.0)mm2、盘外周区(202.4±35.2)mm2。结论 降钙素基因相关肽阳性纤维广泛分布于颞下颌关节中，是感觉神经的一部分，其密度以关节前部盘周附着及关节囊中最高。
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Distribution of calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive fibres in the temporomandibular joint of rat
LIU Xianghui
(Department of Stomatology, the Eighty-first Hospital of PLA, Nangjing 210002, China)
SI Fangjie
ZHOU Shuxia, et al.
Abstract：Objective To observe the distribution of calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive (CGRP-LI) nerve fibres in rat's tempormandibular joint (TMJ). Methods The avidin-biotin-peroxidase complex method and image analysis were employed to detect CGRP-LI nerve fibres in frozen sections of TMJs in eight rats. Results CGRP-LI nerve fibres were plentifully distributed in TMJs except the central disc band and bone, mainly in the periphery of blood vessels, especially arteries. Density: anterior disc attachment and capsule, (454.6±72.8) mm2; posterior portion, (302.7±43.4)mm2; lateral portion, (240.2±23.6)mm2; medial portion, (229.6±25.0)mm2; and peripheral portion of disc, (202.4±35.2)mm2. Conclusion CGRP-LI nerve fibres were widely distributed in rat TMJ and were a part of trigeminal sensory nerve. Density was highest in anterior disc attachment and capsule.
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Key words：Temporomandibular joint; Calcitonin gene-related peptide; Nerve fibers▲
降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是初级感觉神经的兴奋性递质，由37个氨基酸组成，其生物活性高，有效浓度低[1]。近年的研究表明，CGRP在膝、踝等滑膜关节的发病机制中有十分重要的作用[2]。而Alstergren等[3]检测颞下颌关节(temporomandibular joint, TMJ)内紊乱病和类风湿关节炎患者滑液中CGRP的浓度，结果显著高于正常TMJ及炎性膝关节滑液中的水平。因此认为CGRP与TMJ疾病的关系可能更密切。本项实验观察鼠TMJ中CGRP阳性纤维的分布，为研究神经因素在TMJ疾病中的作用提供形态学依据。
材料和方法
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1.标本制备：取雄性SD大鼠8只(重180～220 g，鼠龄4周)，经其腹膜下注射1%戊巴比妥钠1ml，打开胸腔，经心插管至升主动脉，灌注固定，取双侧TMJ置于15% EDTA(乙二胺四乙酸)中脱钙4周，在20%蔗糖液中脱水24 h。每只大鼠的两侧关节均用恒冷切片机分别行矢状及冠状切片，片厚45 μm。
2.染色：将经0.3 % Triton-X-100洗涤后的切片用含0.3% H2O2的甲醛和10%的羊血清依次封闭内源性过氧化物酶和生物素，然后分为实验组和对照组。实验组加1:7 000稀释的一抗，即兔抗鼠CGRP血清(Watpa，新西兰),置于4℃湿盒中48 h, 再经0.01 mol/L磷酸缓冲盐水(PBS)清洗后，加生物素化羊抗兔血清，置于4℃湿盒中12 h；清洗后加ABC复合物，置室温下3 h。以0.01 mol/L PBS洗3遍，双蒸水洗2遍备用。将50 mg DAB溶于50 ml蒸馏水中，将2.5 g硫酸镍胺溶于50 ml 0.2 mol/L醋酸缓冲液中(pH值为6.2),两者过滤后混合,再加入200mg葡萄糖及40mg氯化胺,搅匀后加0.8mg葡萄糖氧化酶(Sigma，美国)。将切片置入上液中反应20min,终止反应。
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3.对照实验：①空白对照：用0.01 mol/L PBS取代一抗;②血清对照：用健康兔血清取代一抗；③吸收对照:用合成的鼠CGRP纯品(Watpa,新西兰) 1.0 μmol/L加入稀释的一抗，置于4℃湿盒中48 h，离心，取其上清液代替一抗。其余步骤均同实验组。
4.镜下观察,摄片,进行计算机图像分析。
结果
除关节盘中心区和骨质外，鼠TMJ各部位均有丰富的CGRP阳性纤维分布，纤维直径0.35～0.80 μm,多为中等粗细，其走行迂曲，方向不规则。多数纤维由棕黑色膨体呈串珠状构成，少数细纤维呈近似均质的腊肠状。在关节囊、盘周附着及骨膜等组织中阳性纤维主要沿血管，尤其是动脉血管周围，呈环状或放射状分布；部分以网状、丛状或游离神经末梢分布于结缔组织中，常见到由几条纤维组成的纤维束(图1)。在关节盘外周(前、后带及中间带的内外侧边缘区)，阳性纤维呈树枝状或丛状分布，主要位于近关节腔的盘上及盘下1/3区。纤维末梢多终止于关节盘上下表面，越靠近关节盘中心区，纤维越少(图2)。滑膜中CGRP阳性纤维丰富，呈网状或树枝状迂曲走行于内膜下层，部分末梢穿过内膜层后显著曲张，终止于滑膜表面。特别在滑膜皱襞和指状突起中，阳性纤维更多且曲张更明显(图3)。
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图1 盘前附着区CGRP阳性纤维呈放射状和网状分布(ABC×20)
图2 关节盘外周区阳性纤维呈树枝状分布于盘上、下1/3区(ABC×20)
图3 滑膜层CGRP阳性纤维呈网状或树枝状分布(ABC×20)
为了检测TMJ各部位CGRP阳性纤维的密度，本项研究将关节分为5个区：Ⅰ 前部盘周附着和关节囊；Ⅱ 盘外周区；Ⅲ 后部盘周附着和关节囊；Ⅳ 外侧盘周附着和关节囊；Ⅴ 内侧盘周附着和关节囊。每只实验动物各随机选取关节中部矢状和冠状切片一张，在矢状切片中观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区，在冠状切片中观察Ⅳ、Ⅴ区。各切片在观察区选一个标准视野，用计算机图像分析仪测量每区CGRP阳性纤维的表面积，各区分别相加，取其均值。结果：Ⅰ区为(454.6±72.8)mm2,Ⅱ区为(202.4±35.2)mm2,Ⅲ区为(302.7±43.4)mm2,Ⅳ区为(240.2±23.6)mm2,Ⅴ区为(229.6±25.0)mm2;即Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ>Ⅱ。统计学分析表明：Ⅰ与Ⅲ、Ⅲ与Ⅳ、Ⅳ与Ⅱ之间，差异有显著性(P<0.05)；Ⅳ与Ⅴ、Ⅴ与Ⅱ之间，差异无显著性。对照组中均无阳性反应。
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以往有关TMJ中CGRP阳性纤维的研究尚不多见。Ichikawa等[4]认为，出生10天内的幼鼠关节盘中有CGRP阳性纤维，但在成年鼠中消失；而Kido等[5]发现，鼠TMJ软组织中除关节盘中心区外均有CGRP阳性纤维分布，但未对其密度进行定量分析。我们的结果表明，除盘中心区和骨组织外，TMJ各部位均有丰富的CGRP阳性纤维，主要沿小血管尤其是动脉周围分布，密度以前部盘周附着和关节囊中最高，与文献报道盘后附着中神经更丰富有所不同。这可能与CGRP纤维分布特性有关。观察表明盘前附着区面积小于盘后附着区，但血管密度更高。
关于TMJ关节盘及滑膜中有无神经分布，学者们一直存有争议。Dresson[6]认为TMJ盘及部分滑膜中没有神经支配，而Kido等[5]的研究发现滑膜及关节盘中有三叉神经分布。本项实验结果表明，除关节盘中心区外，关节盘外周区及滑膜中均有丰富的CGRP阳性纤维分布，其走行多靠近关节腔，末梢多终止于关节盘及滑膜表面。
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TMJ中的CGRP阳性纤维是感觉神经的一部分。各种伤害性剌激因子，如创伤、压力、精神紧张和炎症介质如胶原酶、前列腺素E2等，都能激活伤害感受器引起CGRP合成和释放增加[1，2]。它们可能具有以下作用：①顺行向中枢传导痛觉，逆行释放于TMJ引起痛觉过敏，特别是滑膜及关节盘表面的CGRP纤维，对滑膜炎及滑液性质改变时的痛觉传递具有重要作用；②引起神经源性炎症：CGRP是迄今为止发现的最有效的血管活性物质，能显著扩张微血管，尤其是动脉，引起局部充血；还能抑制神经肽P物质的降解，与其共同促进血管壁通透性增加和炎症介质的释放，引起炎性水肿；③促进成纤维细胞及滑膜细胞的增生和分泌胶原酶、前列腺素E2等，引起关节结构的破坏[1，2]。可见感觉神经不单具有感觉功能而且参与关节疾病的发生与发展。因此，可以认为感觉神经去除术或应用CGRP等的拮抗剂，对治疗TMJ疾病应具有重要意义。
参考文献：
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[1]Kenneth M, Hargreaves J, Swift M, et al. Pharmacology of peripheral neuropeptide and inflammatory mediator release. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, 1994, 78:503-509.
[2]Cruwys SC. Sensory denervation with capsaicin attenuates inflammation and nociception in arthritic rats. Neurosci Lett, 1995, 67:235-243.
[3]Alstergren P, Appelgren A, Appelgren B, et al. Co-variation of neuropeptide Y, calcitonin gene-related peptide, substance P and neurokinin A in joint fluid from patients with temporomandibular joint arthritis. Arch Oral Biol, 1995, 40:127-135.
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[4]Ichikawa H, Wakisaka S, Matsuo S, et al. Peptidergic innervation of the temporomandibular disc in the rat. Experientia, 1989, 45:303-304.
[5]Kido MA, Kiyoshima T, Kondo T, et al. Distribution of substance P and calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive nerve fibers in the rat temporomandibular joint. J Dent Res, 1993, 72:592-598.
[6]Dresson D. Sensory innervation of the temporomandibular joint in the mouse. Acta Anat, 1990, 139:154-160.
收稿日期： 1998-12-05, 百拇医药