金黄地鼠颊囊白斑癌变过程中血管异常生成的观察研究
作者：华丽 周曾同 钟文静 张水龙
单位：华丽(上海第二医科大学第九人民医院 上海，200011)；周曾同(上海第二医科大学第九人民医院 上海，200011)；钟文静(上海第二医科大学第九人民医院 上海，200011)；张水龙(上海第二医科大学第九人民医院 上海，200011)
关键词：金黄地鼠颊囊；血管生成；癌前病变
临床口腔医学杂志000117 摘 要：目的 对动物颊囊癌变过程中的血管生成规律进行形态学的动态研究。方法 采用DMBA诱导的金黄地鼠颊囊癌变动物模型、树脂血管灌注及墨汁血管灌注检测癌变时的血管生成情况。结果 癌前病变及癌变期内均存在血管生成现象，并存在着随病变恶性程度增加，血管异常生成明显增加的规律。结论 血管异常生成及其严重程度与白斑癌变有关。
分类号：R781.59 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1003-1634(2000)01-0041-03
Observations on Angiogenesis During the Evolution of Golden Hamster Cheek Pouch Carcinogenesis
Hua Li,Zhou zengtong,Zhong Wenjing,Zhang Shuilong.
(Oral Medicine of the Ninth People's Hospital,ShanghaiSecond Medical Univercity 200011)
Abstract：Objectives To study the morphology of angiogenesis of cheek pouch carcinoma dynamically.Methods DMBA induced golden hamster cheek pouch carcinogenesis model,Resin vascular cast and prepared-Chinese-ink injection were used in this study to detect the angiogenesis of carcinogenesis.Results The phenomenon of angiogenesis existed in premalignant period and carcinogenesis,Abnormal angiogenesis remarkbly increased with the malignant degree of pathological changes ascending.Conclusions It was identified that angiogenesis was correlated with carcinogenesis.
, 百拇医药
Key words：golden hamster cheek angiogenesis precarcinoma▲
材料与方法
材料
1.实验动物：叙利亚品系金黄地鼠51只，每只取双侧颊囊标本，共102例，由上海西普尔-BK公司提供。
2.0.5%DMBA丙酮液配置：1g DMBA溶于200ml丙酮液，混匀。
3.树脂预聚液配置：2%NaOH清洗后的甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸甲酯按9∶1比例混合，再加入6%的过氧化苯甲酰，75～80℃水浴5分钟，加入苏丹Ⅲ染色剂混匀。
4.3%明胶墨汁配置：30g明胶溶于1000ml墨汁中，70～80℃水浴溶解。
, 百拇医药
5.KS400图像分析系统(Video Image Digital Analysis System)由德国远东蔡司公司(ZEISS)提供。
方法
1.实验动物分组：空白对照组：9只，常规饲养，双侧颊囊涂布0.9%NaCl液，于4～9周后处死，取双侧颊囊标本共18例。
模型组：42只，常规饲养，双侧颊囊涂布0.5%DMBA丙酮液，于4～9周后处死，取双侧颊囊标本共84例。
2.树脂血管铸型制作：
氯胺酮(2ml/kg)腹腔麻醉动物。开胸、暴露心脏、经左心室插管至升主动脉，结扎降主动脉，切开右心房，35～37℃生理盐水自导管灌注冲洗血管，以12～15kPa压力灌入树脂预聚液，结扎上腔静脉、升主动脉。动物置60℃水浴30分钟，取双侧颊囊，40%KOH液腐蚀2小时，流水冲洗，置50%甘油液2小时→100%甘油保存。双目解剖镜下观察血管形态。
, 百拇医药
3.明胶墨汁血管灌注
动物按树脂灌注前步骤处理后，灌注3%明胶墨汁,取双侧颊囊涂药区组织块，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下病理分级，标准参照1978年WHO口腔癌前病变协作中心诊断标准。每例标本在KS400图像分析系统中测量邻近3个视野内的血管密度值(血管个数/mm2)和血管面积密度值(血管内腔面积和/视野面积×100%)，取平均值。
4.统计学处理
数据采用x2检验，单因素方差分析，Duncan法组间两两比较进行分析。
结 果
1.肉眼观察颊囊粘膜、血管变化及光镜下病理分级结果。
1.1 肉眼观察
, 百拇医药
空白对照组地鼠颊囊粘膜光滑红润，薄而有弹性，粘膜下血管清晰。模型组地鼠颊囊涂DMBA第4～5周时先后出现充血、糜烂；第6～7周出现不同程度粘膜粗糙、肥厚、白色斑块或疣状损害；第8～9周出现乳突状新生物，逐渐长大成菜花状肿块。
1.2 树脂血管铸型观察
空白对照组颊囊血管网中各级血管排列稀疏、均匀。模型组：4～5周组血管未见明显变化;6～7周组血管密度略为增加，个别部位见管径增粗，少量新生血管形成，局部有树脂渗漏现象；8～9周组血管网发生明显改变，各级血管排列稠密，不均匀，出现扭曲、扩张毛细血管，以至毛细血管团，新生血管芽多见，树脂多向管外渗漏。
1.3 光镜下组织学观察
12例空白对照组地鼠颊囊粘膜标本均为正常粘膜上皮；72例模型组地鼠颊囊粘膜标本中，炎症为11/72，轻、中、重度异常增生依次为21/72、19/72、16/72，鳞癌为5/72。
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表1示：涂DMBA第4～5周，炎症和轻度异常增生居多，占16/24；第6～7周，中、重度异常增生比例上升，占15/24；第8～9周中、重度异常增生和鳞癌占16/24。
表1 涂DMBA不同周数组间动物颊囊粘膜
光镜下病理分级(例) 涂DMBA
周 数
病 理 分 级
合计
炎症
轻度异
常增生
中度异
, 百拇医药 常增生
重度异
常增生
癌
第4周
第5周
第6周
第7周
第8周
第9周
合 计
2
4
0
, 百拇医药
2
3
0
11
6
4
2
4
2
3
21
0
4
5
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3
4
3
19
2
0
4
3
2
5
16
2
0
1
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0
1
1
5
12
12
12
12
12
12
72
经x2检验，P<0.05。
2.图像分析结果
, 百拇医药
涂DMBA不同周数组间血管密度及血管面积密度(表2)。
表2 涂DBMA不同周数组间血管密度(个/mm2)
和血管面积密度值(%) 涂DMBA周数
例数
血管密度
血管面积密度
第4周
第5周
第6周
第7周
, 百拇医药
第8周
第9周
5
5
5
5
5
5
7.44±2.22
7.33±2.12
9.09±6.10
11.07±4.45
10.83±3.74
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11.47±3.75
1.72±1.07
1.04±0.93
1.59±0.47
2.47±1.00
1.60±0.65
1.91±0.62
表2示：涂药第4～5周血管密度值无明显变化，第5～7周明显上升，7～8周保持稳定，8～9周又逐渐上升。血管面积密度值涂药第5～7周和第8～9周持续上升，第4～5周和第7～8周下降。
从表3可见，正常颊囊粘膜与鳞癌组间血管密度值有高度显著性差别(P<0.01)；轻、中、重度异常增生组较正常颊囊粘膜组，鳞癌组较炎症组血管密度值增高有显著差别(P<0.05)；其余各组间血管密度值无显著性差别(P>0.05)。表3 不同病理变化组间动物颊囊粘膜下
, 百拇医药
血管密度值(个/mm2) 病理分级
例数
α=0.05
α=0.01
正常粘膜
炎 症
轻度异常增生
中度异常增生
重度异常增生
癌
6
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4
9
8
7
2
3.39±1.96
6.42±3.07
8.89±4.92
9.46±3.17
9.95±4.33
13.83±4.33
A
AB
, 百拇医药
BC
BC
BC
C
A
AB
AB
AB
AB
B
采用单因素方差分析，Duncan法作组间两两比较，字母相同为无显著差异。
从表4可见，正常颊囊粘膜与重度异常增生、鳞癌组间，炎症与重度异常增生、鳞癌组间粘膜下血管面积密度有高度显著性差别(P<0.01)；轻、中度异常增生组较正常粘膜组，中度异常增生组较炎症组粘膜下血管面积密度有显著性差别(P<0.05)；其余各组间粘膜下血管面积密度无显著性差别(P>0.05)。
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表4 不同病理分级组间动物颊囊粘膜下
血管面积密度值(%) 病理分级
例数
α=0.05
α=0.05
正常粘膜
炎 症
轻度异常增生
中度异常增生
重度异常增生
癌
, 百拇医药
6
4
9
8
7
2
0.46±0.27
0.70±0.28
1.45±0.73
1.64±0.66
2.25±0.88
2.30±0.11
A
, 百拇医药
AB
BC
C
C
C
A
A
AB
AB
B
B
采用单因素方差分析，Duncan法作组间两两比较，字母相同无显著差别。
, 百拇医药
图1 正常粘膜的明胶墨汁血管灌注
图2 异常增生粘膜的明胶墨汁血管灌注
讨 论
1.动物模型连续病变谱动态分析
1954年Salley首次利用DMBA诱导叙利亚品系金地鼠颊囊，成功建立了口腔鳞癌的实验动物模型〔1〕。该模型目前被认为是研究由癌前病变向癌演变动态过程的经典模型〔2、3〕。本实验亦采用此模型，其肉眼观察病变序列如下：“正常粘膜→粗糙、充血、糜烂→白斑→癌”，经病理证实，动态变化序列与以往报导相符，即“正常粘膜→炎症→单纯增生→不典型增生(轻度→中度→重度)→原位癌”。树脂血管铸型双目解剖镜下的观察初步发现，血管生成过程基本与地鼠颊囊粘膜病变过程同步，也存在“稀疏、平滑而又均匀的毛细血管网→扩张、扭曲、新生血管增多→血管空间构筑紊乱”的癌血管独特动态变化规律。另外，比较颊囊癌变的肉眼观察和病理检测结果发现，光镜下所见的癌变时间序列较肉眼观察约提前1→2周，证实病理检测是一种更可靠的病变诊断方法。提示临床医师在重视肉眼观察的同时，不能忽略病理诊断。
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2.癌前病变期血管生成的动态观察
血管生成，通常在生理和病理条件下发生，多见于伤口愈合，行经、胚胎发育、糖尿病性视网膜病、风湿性动脉炎、休克和肿瘤生长〔4〕。生长的持续性、无限制性，是肿瘤血管生成有别于其他状态下血管生成的二大特点。目前，对于肿瘤血管的定量研究尚无成熟的方法。有研究发现，血管密度是衡量肿瘤血生成的较好指标，对于肿瘤的生长、转移和预后具有一定指导意义〔5、6、7〕。
本实验采用简便、易被识别的明胶墨汁灌注技术，检测血管密度值和面积密度值，动态观察颊囊粘膜癌变过程中血管生成情况，结果显示：涂DMBA第5～7周和第8～9周，血管密度和面积密度值持续升高，该时间经肉眼和光镜观察分别属于正常→异常增生，以及异常增生→癌的转变期，提示旺盛的血管生成活性。扩张及新生的毛细血管，可能给局部组织带来丰富的营养物质，从而促进细胞的恶性转换；而涂DMBA第4～5周和7～8周显示出血管生成处于相对稳定期，可能是癌变过程的量变期，尤其是第4～5周属于上皮异常增生早期。提示在这一时期给予干扰，则可能较好地阻断癌变发展。
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综上所述，肿瘤形成具有血管生成依赖性。血管密度和血管面积密度是评价肿瘤血管生成的较好定量指标。虽然二者作为癌前病变各期的诊断指标尚缺乏敏感性，但其值的落差性变化有提示癌变的作用。相信，随着对癌前病变及鳞癌期血管生成的病理生理学的深入研究，必将为口腔粘膜癌前病变及鳞癌的防治带来福音。■
参考文献：
[1]Salley JJ.Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster.J.Dent.Reserch,1954;33:253～262.
[2]Eveson JW.Animal model of intra-oral chemical carcinogensis:A review.J Oral Pathol.,1981;10:129.
, 百拇医药 [3]宋宁峰，温玉明。二甲基苯丙蒽诱导金黄地鼠颊囊癌的模型建立及组织学研究.华西口腔医学杂志，1994；12(2)：111.
[4]Folkman J.Angiogenesis in cancer,rheumatoid and other disease.Nature Med.,1995;1:27～32.
[5]Weidner N,Folkman J,Pozza F et al.Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J.of the National Cancer Inst.,1992;84(24):1875～1886.
[6]Yamazak I k,Abe S,Takekama H et al.Tumor angiogenesis inhuman lung adenocarcinoma.Cancer,1994;74:2245～2250.
[7]Vermeulen PB,Verhoeven D,Hubens G et al.Microvessel density,endothelial cell proliferation and tumor cell proliferation inhuman colorectal adenocarcinomas.Ann Oncol,1995;6:59～64.
收稿日期：1999-08-30, http://www.100md.com
单位：华丽(上海第二医科大学第九人民医院 上海，200011)；周曾同(上海第二医科大学第九人民医院 上海，200011)；钟文静(上海第二医科大学第九人民医院 上海，200011)；张水龙(上海第二医科大学第九人民医院 上海，200011)
关键词：金黄地鼠颊囊；血管生成；癌前病变
临床口腔医学杂志000117 摘 要：目的 对动物颊囊癌变过程中的血管生成规律进行形态学的动态研究。方法 采用DMBA诱导的金黄地鼠颊囊癌变动物模型、树脂血管灌注及墨汁血管灌注检测癌变时的血管生成情况。结果 癌前病变及癌变期内均存在血管生成现象，并存在着随病变恶性程度增加，血管异常生成明显增加的规律。结论 血管异常生成及其严重程度与白斑癌变有关。
分类号：R781.59 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1003-1634(2000)01-0041-03
Observations on Angiogenesis During the Evolution of Golden Hamster Cheek Pouch Carcinogenesis
Hua Li,Zhou zengtong,Zhong Wenjing,Zhang Shuilong.
(Oral Medicine of the Ninth People's Hospital,ShanghaiSecond Medical Univercity 200011)
Abstract：Objectives To study the morphology of angiogenesis of cheek pouch carcinoma dynamically.Methods DMBA induced golden hamster cheek pouch carcinogenesis model,Resin vascular cast and prepared-Chinese-ink injection were used in this study to detect the angiogenesis of carcinogenesis.Results The phenomenon of angiogenesis existed in premalignant period and carcinogenesis,Abnormal angiogenesis remarkbly increased with the malignant degree of pathological changes ascending.Conclusions It was identified that angiogenesis was correlated with carcinogenesis.
, 百拇医药
Key words：golden hamster cheek angiogenesis precarcinoma▲
材料与方法
材料
1.实验动物：叙利亚品系金黄地鼠51只，每只取双侧颊囊标本，共102例，由上海西普尔-BK公司提供。
2.0.5%DMBA丙酮液配置：1g DMBA溶于200ml丙酮液，混匀。
3.树脂预聚液配置：2%NaOH清洗后的甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸甲酯按9∶1比例混合，再加入6%的过氧化苯甲酰，75～80℃水浴5分钟，加入苏丹Ⅲ染色剂混匀。
4.3%明胶墨汁配置：30g明胶溶于1000ml墨汁中，70～80℃水浴溶解。
, 百拇医药
5.KS400图像分析系统(Video Image Digital Analysis System)由德国远东蔡司公司(ZEISS)提供。
方法
1.实验动物分组：空白对照组：9只，常规饲养，双侧颊囊涂布0.9%NaCl液，于4～9周后处死，取双侧颊囊标本共18例。
模型组：42只，常规饲养，双侧颊囊涂布0.5%DMBA丙酮液，于4～9周后处死，取双侧颊囊标本共84例。
2.树脂血管铸型制作：
氯胺酮(2ml/kg)腹腔麻醉动物。开胸、暴露心脏、经左心室插管至升主动脉，结扎降主动脉，切开右心房，35～37℃生理盐水自导管灌注冲洗血管，以12～15kPa压力灌入树脂预聚液，结扎上腔静脉、升主动脉。动物置60℃水浴30分钟，取双侧颊囊，40%KOH液腐蚀2小时，流水冲洗，置50%甘油液2小时→100%甘油保存。双目解剖镜下观察血管形态。
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3.明胶墨汁血管灌注
动物按树脂灌注前步骤处理后，灌注3%明胶墨汁,取双侧颊囊涂药区组织块，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下病理分级，标准参照1978年WHO口腔癌前病变协作中心诊断标准。每例标本在KS400图像分析系统中测量邻近3个视野内的血管密度值(血管个数/mm2)和血管面积密度值(血管内腔面积和/视野面积×100%)，取平均值。
4.统计学处理
数据采用x2检验，单因素方差分析，Duncan法组间两两比较进行分析。
结 果
1.肉眼观察颊囊粘膜、血管变化及光镜下病理分级结果。
1.1 肉眼观察
, 百拇医药
空白对照组地鼠颊囊粘膜光滑红润，薄而有弹性，粘膜下血管清晰。模型组地鼠颊囊涂DMBA第4～5周时先后出现充血、糜烂；第6～7周出现不同程度粘膜粗糙、肥厚、白色斑块或疣状损害；第8～9周出现乳突状新生物，逐渐长大成菜花状肿块。
1.2 树脂血管铸型观察
空白对照组颊囊血管网中各级血管排列稀疏、均匀。模型组：4～5周组血管未见明显变化;6～7周组血管密度略为增加，个别部位见管径增粗，少量新生血管形成，局部有树脂渗漏现象；8～9周组血管网发生明显改变，各级血管排列稠密，不均匀，出现扭曲、扩张毛细血管，以至毛细血管团，新生血管芽多见，树脂多向管外渗漏。
1.3 光镜下组织学观察
12例空白对照组地鼠颊囊粘膜标本均为正常粘膜上皮；72例模型组地鼠颊囊粘膜标本中，炎症为11/72，轻、中、重度异常增生依次为21/72、19/72、16/72，鳞癌为5/72。
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表1示：涂DMBA第4～5周，炎症和轻度异常增生居多，占16/24；第6～7周，中、重度异常增生比例上升，占15/24；第8～9周中、重度异常增生和鳞癌占16/24。
表1 涂DMBA不同周数组间动物颊囊粘膜
光镜下病理分级(例) 涂DMBA
周 数
病 理 分 级
合计
炎症
轻度异
常增生
中度异
, 百拇医药 常增生
重度异
常增生
癌
第4周
第5周
第6周
第7周
第8周
第9周
合 计
2
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经x2检验，P<0.05。
2.图像分析结果
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涂DMBA不同周数组间血管密度及血管面积密度(表2)。
表2 涂DBMA不同周数组间血管密度(个/mm2)
和血管面积密度值(%) 涂DMBA周数
例数
血管密度
血管面积密度
第4周
第5周
第6周
第7周
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第8周
第9周
5
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7.44±2.22
7.33±2.12
9.09±6.10
11.07±4.45
10.83±3.74
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11.47±3.75
1.72±1.07
1.04±0.93
1.59±0.47
2.47±1.00
1.60±0.65
1.91±0.62
表2示：涂药第4～5周血管密度值无明显变化，第5～7周明显上升，7～8周保持稳定，8～9周又逐渐上升。血管面积密度值涂药第5～7周和第8～9周持续上升，第4～5周和第7～8周下降。
从表3可见，正常颊囊粘膜与鳞癌组间血管密度值有高度显著性差别(P<0.01)；轻、中、重度异常增生组较正常颊囊粘膜组，鳞癌组较炎症组血管密度值增高有显著差别(P<0.05)；其余各组间血管密度值无显著性差别(P>0.05)。表3 不同病理变化组间动物颊囊粘膜下
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血管密度值(个/mm2) 病理分级
例数
α=0.05
α=0.01
正常粘膜
炎 症
轻度异常增生
中度异常增生
重度异常增生
癌
6
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4
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3.39±1.96
6.42±3.07
8.89±4.92
9.46±3.17
9.95±4.33
13.83±4.33
A
AB
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BC
BC
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C
A
AB
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AB
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B
采用单因素方差分析，Duncan法作组间两两比较，字母相同为无显著差异。
从表4可见，正常颊囊粘膜与重度异常增生、鳞癌组间，炎症与重度异常增生、鳞癌组间粘膜下血管面积密度有高度显著性差别(P<0.01)；轻、中度异常增生组较正常粘膜组，中度异常增生组较炎症组粘膜下血管面积密度有显著性差别(P<0.05)；其余各组间粘膜下血管面积密度无显著性差别(P>0.05)。
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表4 不同病理分级组间动物颊囊粘膜下
血管面积密度值(%) 病理分级
例数
α=0.05
α=0.05
正常粘膜
炎 症
轻度异常增生
中度异常增生
重度异常增生
癌
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6
4
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0.46±0.27
0.70±0.28
1.45±0.73
1.64±0.66
2.25±0.88
2.30±0.11
A
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C
A
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AB
AB
B
B
采用单因素方差分析，Duncan法作组间两两比较，字母相同无显著差别。
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图1 正常粘膜的明胶墨汁血管灌注
图2 异常增生粘膜的明胶墨汁血管灌注
讨 论
1.动物模型连续病变谱动态分析
1954年Salley首次利用DMBA诱导叙利亚品系金地鼠颊囊，成功建立了口腔鳞癌的实验动物模型〔1〕。该模型目前被认为是研究由癌前病变向癌演变动态过程的经典模型〔2、3〕。本实验亦采用此模型，其肉眼观察病变序列如下：“正常粘膜→粗糙、充血、糜烂→白斑→癌”，经病理证实，动态变化序列与以往报导相符，即“正常粘膜→炎症→单纯增生→不典型增生(轻度→中度→重度)→原位癌”。树脂血管铸型双目解剖镜下的观察初步发现，血管生成过程基本与地鼠颊囊粘膜病变过程同步，也存在“稀疏、平滑而又均匀的毛细血管网→扩张、扭曲、新生血管增多→血管空间构筑紊乱”的癌血管独特动态变化规律。另外，比较颊囊癌变的肉眼观察和病理检测结果发现，光镜下所见的癌变时间序列较肉眼观察约提前1→2周，证实病理检测是一种更可靠的病变诊断方法。提示临床医师在重视肉眼观察的同时，不能忽略病理诊断。
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2.癌前病变期血管生成的动态观察
血管生成，通常在生理和病理条件下发生，多见于伤口愈合，行经、胚胎发育、糖尿病性视网膜病、风湿性动脉炎、休克和肿瘤生长〔4〕。生长的持续性、无限制性，是肿瘤血管生成有别于其他状态下血管生成的二大特点。目前，对于肿瘤血管的定量研究尚无成熟的方法。有研究发现，血管密度是衡量肿瘤血生成的较好指标，对于肿瘤的生长、转移和预后具有一定指导意义〔5、6、7〕。
本实验采用简便、易被识别的明胶墨汁灌注技术，检测血管密度值和面积密度值，动态观察颊囊粘膜癌变过程中血管生成情况，结果显示：涂DMBA第5～7周和第8～9周，血管密度和面积密度值持续升高，该时间经肉眼和光镜观察分别属于正常→异常增生，以及异常增生→癌的转变期，提示旺盛的血管生成活性。扩张及新生的毛细血管，可能给局部组织带来丰富的营养物质，从而促进细胞的恶性转换；而涂DMBA第4～5周和7～8周显示出血管生成处于相对稳定期，可能是癌变过程的量变期，尤其是第4～5周属于上皮异常增生早期。提示在这一时期给予干扰，则可能较好地阻断癌变发展。
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综上所述，肿瘤形成具有血管生成依赖性。血管密度和血管面积密度是评价肿瘤血管生成的较好定量指标。虽然二者作为癌前病变各期的诊断指标尚缺乏敏感性，但其值的落差性变化有提示癌变的作用。相信，随着对癌前病变及鳞癌期血管生成的病理生理学的深入研究，必将为口腔粘膜癌前病变及鳞癌的防治带来福音。■
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收稿日期：1999-08-30, http://www.100md.com