应用PCR技术诊断单疱病毒性角膜炎
作者：林国才 陈潮汉
单位：林国才(福建省龙岩市第一医院眼科 364000)；陈潮汉(福建省龙岩市第一医院眼科 364000)
关键词：单疱病毒性角膜炎；HSV-1；PCR
眼科新进展000125
摘 要：目的 探讨PCR对HSK的诊断价值。方法 应用PCR技术对临床诊断活动期HSK 33眼匐行性角膜溃疡5眼，原因不明角膜炎5眼进行HSV-1 DNA检测。结果 活动期HSK具有上皮病变者30眼中24眼检出HSV-1 DNA，5眼匐形性角膜溃疡全部未检出HSV-1 DNA；5眼原因不明角膜炎中1眼检出HSV-1 DNA。结论 PCR是一种快速、灵敏、特异性强的方法，对角膜炎的早期诊断及鉴别诊断具有重要意义，具有高度的临床应用价值，值得推广。
分类号：R772.2 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1003-5141(2000)01-0062-02
PCR in diagnosis of HSK
LIN Guo-Cai,CHEN Chao-Han
(Department of Ophthalmology,First Hospital of Longyan City,Longyan 364000,Fujian Province,China)
Abstract：Objective To investigate the value of polymerase chain reaction(PCR) in the diagnosis of herpes simpler keratitis(HSK).Methods PCR was used to detect herpes simplex virus type 1(HSV-1)DNA in 33 eyes with active HSK,5 eyes with serpiginous corneal ulcer and 5 eyes with keratitis with unknown cause.Results The results showed that 24 of 30 eyes with active HSK with epithelial lesions were positive for HSV-1 DNA.None of the five serpiginous corneal ulcers were positive.Of the five keratitis with unknown causes,one was positive.Conclusion PCR is a rapid,sensitive and specific diagnostic technique.It plays an important role in the early diagnosis and differential diagnosis for various keratitis.Its value should be highlighted.
, 百拇医药
Key words：HSK;HSV-1；PCR▲
单疱病毒性角膜炎(HSK)是目前眼部病毒感染中发病率最高的疾病，据国内最新统计，它已是角膜病的首要致盲原因[1-3]。其特点是急性感染后进入稳定期，在一定条件下可复发。其反复发作、迁延不愈以及抵抗药物治疗等特点，使眼科医生甚感棘手。近年由于激素及抗病毒剂的广泛应用，致使病变形态不典型，给临床诊断造成困难。我科自1994年起采用PCR技术对临床诊断为活动期HSK 33眼，匐行性角膜溃疡5眼，原因不明角膜炎5眼进行HSV-1 DNA检测，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本收集 以5g.L-1地卡因表麻，用尖刀片刮取角膜病变处上皮组织少许，立即置于男性拭子管内送检，其中临床诊断树枝状角膜炎24眼，地图状角膜溃疡5眼，盘状角膜炎4眼，匐行性角膜溃疡5眼，原因未明角膜炎5眼。
, 百拇医药
1.1.2 检测试剂 由厦门泰伦生物工程有限公司提供的单纯疱疹病毒DNA PCR试剂盒，其扩增产物227bp。
1.2 方法
1.2.1 样品提取 (1)将角膜刮取组织悬于0.5mL无菌生理盐水。取200μl样品悬液，加入0.5mL离心管中，滴加6滴裂解液彻底混匀，置室温作用10min，每分钟4 000转离心2min，弃上清；(2)加8滴洗涤液，混匀，照上法离心，弃上清凉干；(3)加二滴溶解液，充分混匀，置室温(最好55℃水浴)作用10min，上清液即可作PCR检测。
1.2.2 PCR扩增加20μL模板上清加入反应管，混匀，稍许离心，即可上机。先94℃预变性5min，按照94℃30s、58℃30s、72℃60s的条件，反复扩增35个循环，最后72℃延伸5min。
1.2.3 将浓缩缓冲液10mL稀释到500mL，取25mL于烧杯中，加入琼脂糖，加热使之溶解，浇制电泳平板，剩余缓冲液作电极液。取10μL PCR反应终产物，直接点样，电泳100V，10～20min，于紫外透射仪观察结果，阳性者可见一条与阳性对照平行的扩增条带。
, 百拇医药
2 结果
2.1 树枝状角膜炎24眼中PCR检测法20眼HSV-1 DNA阳性，阳性率83.3%；地图型角膜炎5眼中，3眼阳性，阳性率60%；盘状角膜炎4眼中，1眼阳性(为合并上皮病变者)，阳性率25%.匐行性角膜溃疡5眼，PCR法检测HSV-1 DNA全部阴性。5眼原因不明角膜炎，PCR法检测1眼HSV-1 DNA阳性。
3 讨论
病毒分离是经典的病原学特异诊断方法，由于组织培养费时费力，不能提供早期诊断，且基层医院不能普遍开展，目前临床诊断主要通过病史及裂隙灯检查来完成。近年来由于激素和免疫抑制剂的广泛应用，使HSK发病率不断上升，同时由于HSK病情迁延，复发率高，病变形态多种多样，病变表现常不典型，故临床上仅凭病变形态进行诊断，易造成误诊误治，贻误病情。
从以上检测结果可以看出，有上皮病变者HSV-1检出率高达80%，检出率高，表明PCR法检测灵敏度高。深层角膜炎无合并上皮病变者3例均未检出HSV-1，除可能这些病变不是HSV-1所致外，更可能是因病变部位深，角膜上皮尚未受病毒感染所致。典型树状角膜炎24眼中有4眼未检出HSV-1，表明并非树枝状病灶均为HSK，临床仅凭病变形态进行诊断容易误诊。1例原因不明角膜炎检出HSV-1 DNA，说明了HSV-1眼部感染的不典型性。5眼匐行性角膜溃疡PCR法检测HSV-1 DNA均阴性，提示应用PCR技术检测HSV-1 DNA不仅灵敏度高，而且特异性强，在临床应用方面具有鉴别诊断意义。
, http://www.100md.com
PCR法是检测病毒基因，影响因素很小[4]，且基因水平上诊断具有高度的特异性，从理论上讲，只要存在一个DNA分子，就可用PCR法检出[4]，因而具有高度的敏感性。此外，PCR法检测角膜组织HSV-1，取材方便，只要少量角膜上皮，同时检测时间短，仅需6～7h，且操作简便，再加上其实验设备要求不高等优点，因而具有高度的临床应用价值，值得推广应用。
参考文献：
[1]姜忠良.单疱病毒性角膜炎的分子生物学研究进展[J].国外医学眼科学分册 1997；21(2)∶109-114.
[2]杜 鹃.多聚酶链反应对单疱病毒性角膜炎泪液HSV-DNA的检测[J].中国实用眼科杂志 1998；16(2)∶98-99.
[3]吴一迪.单疱性角膜炎病毒基因诊断研究[J].中国实用眼科杂志 1998；16(3)∶139-140.
[4]管怀进.聚合酶链反应检测角膜组织中的单疱病毒DNA[J].中国实用眼科杂志 1995；13(6)∶352-355.
收稿日期：1998-09-18
修稿日期：1998-11-04, 百拇医药
单位：林国才(福建省龙岩市第一医院眼科 364000)；陈潮汉(福建省龙岩市第一医院眼科 364000)
关键词：单疱病毒性角膜炎；HSV-1；PCR
眼科新进展000125
摘 要：目的 探讨PCR对HSK的诊断价值。方法 应用PCR技术对临床诊断活动期HSK 33眼匐行性角膜溃疡5眼，原因不明角膜炎5眼进行HSV-1 DNA检测。结果 活动期HSK具有上皮病变者30眼中24眼检出HSV-1 DNA，5眼匐形性角膜溃疡全部未检出HSV-1 DNA；5眼原因不明角膜炎中1眼检出HSV-1 DNA。结论 PCR是一种快速、灵敏、特异性强的方法，对角膜炎的早期诊断及鉴别诊断具有重要意义，具有高度的临床应用价值，值得推广。
分类号：R772.2 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1003-5141(2000)01-0062-02
PCR in diagnosis of HSK
LIN Guo-Cai,CHEN Chao-Han
(Department of Ophthalmology,First Hospital of Longyan City,Longyan 364000,Fujian Province,China)
Abstract：Objective To investigate the value of polymerase chain reaction(PCR) in the diagnosis of herpes simpler keratitis(HSK).Methods PCR was used to detect herpes simplex virus type 1(HSV-1)DNA in 33 eyes with active HSK,5 eyes with serpiginous corneal ulcer and 5 eyes with keratitis with unknown cause.Results The results showed that 24 of 30 eyes with active HSK with epithelial lesions were positive for HSV-1 DNA.None of the five serpiginous corneal ulcers were positive.Of the five keratitis with unknown causes,one was positive.Conclusion PCR is a rapid,sensitive and specific diagnostic technique.It plays an important role in the early diagnosis and differential diagnosis for various keratitis.Its value should be highlighted.
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Key words：HSK;HSV-1；PCR▲
单疱病毒性角膜炎(HSK)是目前眼部病毒感染中发病率最高的疾病，据国内最新统计，它已是角膜病的首要致盲原因[1-3]。其特点是急性感染后进入稳定期，在一定条件下可复发。其反复发作、迁延不愈以及抵抗药物治疗等特点，使眼科医生甚感棘手。近年由于激素及抗病毒剂的广泛应用，致使病变形态不典型，给临床诊断造成困难。我科自1994年起采用PCR技术对临床诊断为活动期HSK 33眼，匐行性角膜溃疡5眼，原因不明角膜炎5眼进行HSV-1 DNA检测，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本收集 以5g.L-1地卡因表麻，用尖刀片刮取角膜病变处上皮组织少许，立即置于男性拭子管内送检，其中临床诊断树枝状角膜炎24眼，地图状角膜溃疡5眼，盘状角膜炎4眼，匐行性角膜溃疡5眼，原因未明角膜炎5眼。
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1.1.2 检测试剂 由厦门泰伦生物工程有限公司提供的单纯疱疹病毒DNA PCR试剂盒，其扩增产物227bp。
1.2 方法
1.2.1 样品提取 (1)将角膜刮取组织悬于0.5mL无菌生理盐水。取200μl样品悬液，加入0.5mL离心管中，滴加6滴裂解液彻底混匀，置室温作用10min，每分钟4 000转离心2min，弃上清；(2)加8滴洗涤液，混匀，照上法离心，弃上清凉干；(3)加二滴溶解液，充分混匀，置室温(最好55℃水浴)作用10min，上清液即可作PCR检测。
1.2.2 PCR扩增加20μL模板上清加入反应管，混匀，稍许离心，即可上机。先94℃预变性5min，按照94℃30s、58℃30s、72℃60s的条件，反复扩增35个循环，最后72℃延伸5min。
1.2.3 将浓缩缓冲液10mL稀释到500mL，取25mL于烧杯中，加入琼脂糖，加热使之溶解，浇制电泳平板，剩余缓冲液作电极液。取10μL PCR反应终产物，直接点样，电泳100V，10～20min，于紫外透射仪观察结果，阳性者可见一条与阳性对照平行的扩增条带。
, 百拇医药
2 结果
2.1 树枝状角膜炎24眼中PCR检测法20眼HSV-1 DNA阳性，阳性率83.3%；地图型角膜炎5眼中，3眼阳性，阳性率60%；盘状角膜炎4眼中，1眼阳性(为合并上皮病变者)，阳性率25%.匐行性角膜溃疡5眼，PCR法检测HSV-1 DNA全部阴性。5眼原因不明角膜炎，PCR法检测1眼HSV-1 DNA阳性。
3 讨论
病毒分离是经典的病原学特异诊断方法，由于组织培养费时费力，不能提供早期诊断，且基层医院不能普遍开展，目前临床诊断主要通过病史及裂隙灯检查来完成。近年来由于激素和免疫抑制剂的广泛应用，使HSK发病率不断上升，同时由于HSK病情迁延，复发率高，病变形态多种多样，病变表现常不典型，故临床上仅凭病变形态进行诊断，易造成误诊误治，贻误病情。
从以上检测结果可以看出，有上皮病变者HSV-1检出率高达80%，检出率高，表明PCR法检测灵敏度高。深层角膜炎无合并上皮病变者3例均未检出HSV-1，除可能这些病变不是HSV-1所致外，更可能是因病变部位深，角膜上皮尚未受病毒感染所致。典型树状角膜炎24眼中有4眼未检出HSV-1，表明并非树枝状病灶均为HSK，临床仅凭病变形态进行诊断容易误诊。1例原因不明角膜炎检出HSV-1 DNA，说明了HSV-1眼部感染的不典型性。5眼匐行性角膜溃疡PCR法检测HSV-1 DNA均阴性，提示应用PCR技术检测HSV-1 DNA不仅灵敏度高，而且特异性强，在临床应用方面具有鉴别诊断意义。
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PCR法是检测病毒基因，影响因素很小[4]，且基因水平上诊断具有高度的特异性，从理论上讲，只要存在一个DNA分子，就可用PCR法检出[4]，因而具有高度的敏感性。此外，PCR法检测角膜组织HSV-1，取材方便，只要少量角膜上皮，同时检测时间短，仅需6～7h，且操作简便，再加上其实验设备要求不高等优点，因而具有高度的临床应用价值，值得推广应用。
参考文献：
[1]姜忠良.单疱病毒性角膜炎的分子生物学研究进展[J].国外医学眼科学分册 1997；21(2)∶109-114.
[2]杜 鹃.多聚酶链反应对单疱病毒性角膜炎泪液HSV-DNA的检测[J].中国实用眼科杂志 1998；16(2)∶98-99.
[3]吴一迪.单疱性角膜炎病毒基因诊断研究[J].中国实用眼科杂志 1998；16(3)∶139-140.
[4]管怀进.聚合酶链反应检测角膜组织中的单疱病毒DNA[J].中国实用眼科杂志 1995；13(6)∶352-355.
收稿日期：1998-09-18
修稿日期：1998-11-04, 百拇医药