Graves眼病眼眶组织HLA-DR和HSP-70表达的研究
作者：周晓红 罗清礼 夏瑞南
单位：周晓红(华西医科大学附属第一医院眼科 成都市，610041)；罗清礼(华西医科大学附属第一医院眼科 成都市，610041)；夏瑞南(华西医科大学附属第一医院眼科 成都市，610041)
关键词：Graves眼病；自身免疫反应；组织相容性抗原DR；热休克蛋白70；免疫调节蛋白；
眼科新进展000106
摘 要：目的 了解Graves眼病患者眼部组织的组织相容性抗原DR(HLA-DR)和热休克蛋白(HSP-70)的表达极其与病程和治疗的关系。方法 收集Graves眼病患者的眼外肌19例，通过免疫组化的方法观察HLA-DR和HSP-70在不同病程，治疗与未治疗患者眼外肌的表达差异。结果 HLA-DR在眼外肌的纤维母细胞、血管内皮细胞和浸润的淋巴细胞表达，以未治病人的眶组织为明显；HSP-70在肌细胞和纤维母细胞表达，病程短的病人其表达增强。结论 眼外肌细胞和纤维母细胞可能都是Graves眼病自身免疫反应的重要靶细胞；HLA-DR和HSP-70在自身免疫反应中起重要作用；病程和治疗影响HLA-DR和HSP-70的表达。
, http://www.100md.com
分类号：R771.3 文献标识码：A
文章编号：1003-5141(2000)01-0017-04
Study on HLA-DR and HSP-70 of orbital tissue from Graves ophthalmopathy
ZHOU Xiao-Hong,LUO Qing-Li,XIA Rui-Nan
(Department of Ophthalmology,the First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041,Sichuan Province,China)
Abstract：Objective To investigate the expression and localization of human leukocyte antigen-DR(HLA-DR)and heat shock protein-70(HSP-70)in orbital tissue in patients with Graves ophthalmopathy.Method Orbital tissues were obtained from 19 patients with Graves ophthalmopathy and 17 control subjects.An immunohistochemical study were carried out using anti-HLA-DR and anti-HSP-70 monoclonal antibody and a streptavidin-biotin-peroxidase detection system.Results HLA-DR was detected on lymphocytes,intersitial cells and endothelial cells from 16 patients and 4 controls.HSP-70 was detected in eye muscles and interstitial cells from 13 of the patients and 3 of the controls.Significant expression of HSP-70 was more often demonstrated in patients with eye disease of short course than in those of long course.Conclusions These results support the notion that eye muscle fiber and fibroblast are important targets of the orbital autoimmune reaction that characterize Graves ophthalmopathy;HLA-DR and HSP-70 both play important roles in the reaction.
, 百拇医药
Key words：Graves ophthalmopathy;autoimmune reaction;HLA-DR;HSP-70；immunomodulation protein▲
Graves病是内科常见病，目前普遍认为它是一种由于免疫自身稳定机制紊乱而诱发的自身免疫反应，其具体发病机制尚不清楚[1]。本研究目的在于通过免疫组化方法，了解Graves眼病患者眼部组织的HLA-DR和HSP-70的表达，探讨其免疫功能状态，为了解发病机制提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 收集1990～1996年因Graves眼病在我科行眼眶减压术后切除的眼外肌。患者共19例，其中男11例，女8例。年龄18～64a，平均47.1a。所有的病人都具有Graves眼病典型的临床症状和体征，并经CT证实。其中经皮质类固醇和免疫抑制剂治疗14例，未治5例；急性13例，慢性6例。眼外肌标本中下直肌10例，内直肌4例，上直肌2例，外直肌、上斜肌、下斜肌各1例。正常对照共17例，年龄25～54a的意外死亡者，切取眼外肌包括下直肌7例，外直肌3例，上直肌、内直肌、上斜肌各2例，下斜肌1例。用100g.L-1福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，储存于干燥环境中。
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1.2 实验方法 采用LSAB法检测HLA-DR和HSP-70的表达。其中一抗分别为鼠抗人HLA-DR单克隆抗体(Dako公司)和鼠抗人HSP-70单克隆抗体(Sigma公司)；二抗和三抗均由Victor公司提供。阳性对照由迈新公司提供，阴性对照用PBS代替一抗。
HLA-DR和HSP-70的染色是计算阳性细胞阳性率的平均值，再换算成Ⅲ级增殖指数，增殖指数≤25%记为“+”，26%～50%为“++”，>50%为“+++”，无染色则记为“-”。
1.3 统计学分析 采用确切概率法检验病例组和正常对照组HLA-DR和HSP-70的表达，并检验其表达与Graves眼病病程、治疗的关系。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 HLA-DR在眼眶组织的表达
, 百拇医药 2.1.1 病例组与对照组HLA-DR表达的差异 在病例组19例患者中HLA-DR在16例浸润的淋巴细胞有表达(图1)，纤维母细胞和血管内皮细胞染色阳性(图2)，包括在2例未治疗的患者中发现肌细胞呈弱阳性。而在正常对照组仅有4例出现少量纤维母细胞和内皮细胞HLA-DR着色，其余无着色。2组间具有明显差异，(P=0.0006)，见表1。
Figure 1 Significant expression of HLA-DR on infilltrated lymphocyte ×400 浸润淋巴细胞HLA-DR特异性染色
Figure 2 Significant expression of HLA-DR on fibroblast ×400 纤维母细胞HLA-DR特异性染色
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表1 Graves眼病眼眶组织与对照组HLA-DR表达的差异
Table 1 The difference of HLA-DR expression on orbital
tissue between Graves ophthalmopathy and control Group
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2.1.2 HAL-DR表达与Graves眼病病程的关系 结果经检验，P=0.1891，说明病程的长短与HLA-DR的表达无显著相关(见表2)。
表2 病程与HLA-DR表达的关系
Table 2 The relation of HLA-DR
expression on orbital tissue to course Course
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2.1.3 HLA-DR表达与Graves眼病治疗的关系 未治疗组与治疗组HLA-DR的表达有显著差异，P=0.0122，治疗组HLA-DR表达明显低于未治疗组(见表3)。表3 治疗与HLA-DR表达的关系
Table 3 The relation of HLA-DR
expression on orbital tissue to therapy Therapy
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2.2 HSP-70在眼眶组织的表达
2.2.1 病例组与对照组HSP-70表达的差异 病例组19例中HSP-70在13例眼外肌细胞表达(图3)，在纤维母细胞有染色阳性(图4)。正常对组则仅有3例出现肌细胞和纤维母细胞阳性着色，而大多数无染色。2组间HSP-70的表达有显著差异(见表4)，P=0.0055。
Figure 3 Significant expression of HSP-70 on extramuscle ×400 肌细胞HSP-70特异性染色
Figure 4 Significant expression of HSP-70 on fibroblast ×400 纤维母细胞HSP-70特异性染色
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表4 Graves眼病眼眶组织与对照组HSP-70表达的差异
Table 4 The difference of HSP-70 expression on orbital
tissues between Graves ophthalmopathy and control Group
+～+++
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Patient
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, 百拇医药 6
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Control
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17.65
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50.77
, 百拇医药
2.2.2 HSP-70表达与Graves眼病病程的关系 在病程短、处于急性期的病例中可见肌细胞及纤维母细胞有大量HSP-70的表达，明显强于病程长、处于慢性期的病例P=0.0003(见表5)。
表5 病程与HSP-70表达的关系
Table 1 The relation of HSP-70
expression on orbital tissue to course Course
++～+++
-～+
Add up
Positive modulus%
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<2a
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12
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63.16
2.2.3 HSP-70表达程度与Graves眼病治疗的关系 未治疗组和治疗组HSP-70的表达强弱无明显差异(P=0.0758)(见表6)。表6 治疗与HSP-70表达的关系
Table 6 The relation of HSP-70
expression on orbital tissue to therapy Therapy
+++
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Add up
Positive modulus%
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Without therapy
4
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21.43
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19
58.57
3 讨论
3.1 HLA-DR在Graves眼病眼外肌的表达
3.1.1 本研究证实在Graves眼病活跃期患者的眼外肌中有大量淋巴细胞浸润且其HLA-DR呈现强阳性，少量的浆细胞和巨噬细胞以及血管内皮细胞也有HLA-DR着色；静止期患者眼外肌以纤维化为主，大量纤维母细胞增生，这些纤维母细胞和血管内皮细胞有HLA-DR的表达；在未经免疫抑制治疗的患者中，HLA-DR在纤维母细胞、血管内皮细胞和浸润淋巴细胞的表达明显强于治疗组，并且在2例未治疗患者眼外肌有HLA-DR的弱阳性表达。上述结果与Weetman等[2]的报道相似，他们用石蜡包埋组织切片证实Graves眼病患者眼外肌的间质细胞有HLA-DR的表达，并认为间质细胞可能是Graves病自身免疫的靶细胞。而Hiromatsu等[3]用冰冻切片证实在3例未经治疗的Graves眼病患者的眼外肌HLA-DR呈强阳性。但因本研究采用石蜡切片，对眼外肌抗原有一定的破坏，而且已知免疫抑制治疗对HLA-DR的表达有明显抑制作用，因而眼外肌无HLA-DR的明显着色。
, 百拇医药
3.1.2 虽然HLA-DR在眼部组织表达的具体作用还未阐明，但Graves病甲状腺滤泡细胞HLA-DR的明确表达，提示HLA-DR分子可能是甲状腺自身免疫性疾病的启动或持续因素[4]。已知Graves眼病浸润的淋巴细胞绝大多数是CD3+，其次是CD8、CD45RO等[5]且这些增多的淋巴细胞均为活化细胞。Graves眼病患者血清中可溶性白细胞介素-2受体(IL-2R)明显增高，而IL-2R的表达是T淋巴细胞活化增殖所必需的，它的增高提示T淋巴细胞活化[6]浸润的淋巴细胞可分泌大量的细胞因子，如α干扰素(α-IFN)、白细胞介素-4(IL-4)等。正常人的眼外肌细胞、纤维母细胞在体外α-IFN诱导下可增强HLA-DR分子的表达[7，8]。结合本研究结果，提示眼外肌细胞和纤维母细胞可能都是Graves眼病自身免疫反应的重要靶细胞。
3.2 HSP-70在肌细胞和纤维母细胞的表达
, 百拇医药
3.2.1 现已证实HSP-70族能辅佐抗原提呈细胞(APC)加工提呈抗原。当APC摄入抗原决定簇后诱生伴随细胞的HSP-70族，由此族派生新成员称为72/74KDa肽结合蛋白(PBP72/74)。此蛋白与抗原结合，使抗原解离出肽片段，再由PBP72/74将抗原肽片段与细胞内MHCⅡ类分子结合加工成为免疫原性的超抗原，然后转移至细胞膜上提呈交给免疫活性细胞进行免疫应答[9，10]。
3.2.2 在Graves甲亢病中，甲状腺细胞有HSP-70的显著表达[11]。国外曾用免疫组化法证实HSP-70在肌细胞表达[3]，SDS-PAGE法证实它也表达在Graves眼病的纤维母细胞[12]。本研究证实其选择性表达于眼外肌和纤维母细胞，这与Tanaka等[13]用原位杂交技术测得在Graves眼病中眼外肌和纤维母细胞有HSP-70 mRNA表达的结果一致，可能与该病的慢性应激或免疫激活有关。因为HSP-70在细胞间加工处理和其它免疫调节过程中起重要作用。
, 百拇医药
基金项目：四川省卫生厅科研基金资助课题。本文曾在第一届世界华人眼科学术大会上交流
作者简介：周晓红，女，生于1970年10月，四川省成都市人，汉族，中共党员。于1997年7月毕
业于华西医科大学，获医学硕士学位。现为华西医科大学附属第一医院眼科住院医
师。联系电话：028-5551255-22469，E-mail:zhlxzhxh@mail.sc.cninfo.net
参考文献：
[1]Bahn RS,Garrity JA,Gorman CA.Diagnosis and management of Graves ophthalmopathy[J].J Clin Endocrinol Metab 1990;71∶559-563.
, 百拇医药
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[3]Hiromatsu Y,Tanaka K,Ishiscka N,et al.Human histo-compatibility leukocyte antigen-DR and heat shock protein-70 expression in eye muscle tissue in thyroid-associated ophthalmopathy[J].J Clin Endocrinol Metab 1995;80∶685-691.
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[11]Heufelder AE,Goellner JR,Wenzel BE,et al.Immunohistochemical detection and localization of a 72 kilodalton heat shock protein in autoimmune thyroid disease[J].J Clin Endocrinol Metab 1992;74∶724-731.
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收稿日期：1998-10-21
修稿日期：1998-11-19, 百拇医药
单位：周晓红(华西医科大学附属第一医院眼科 成都市，610041)；罗清礼(华西医科大学附属第一医院眼科 成都市，610041)；夏瑞南(华西医科大学附属第一医院眼科 成都市，610041)
关键词：Graves眼病；自身免疫反应；组织相容性抗原DR；热休克蛋白70；免疫调节蛋白；
眼科新进展000106
摘 要：目的 了解Graves眼病患者眼部组织的组织相容性抗原DR(HLA-DR)和热休克蛋白(HSP-70)的表达极其与病程和治疗的关系。方法 收集Graves眼病患者的眼外肌19例，通过免疫组化的方法观察HLA-DR和HSP-70在不同病程，治疗与未治疗患者眼外肌的表达差异。结果 HLA-DR在眼外肌的纤维母细胞、血管内皮细胞和浸润的淋巴细胞表达，以未治病人的眶组织为明显；HSP-70在肌细胞和纤维母细胞表达，病程短的病人其表达增强。结论 眼外肌细胞和纤维母细胞可能都是Graves眼病自身免疫反应的重要靶细胞；HLA-DR和HSP-70在自身免疫反应中起重要作用；病程和治疗影响HLA-DR和HSP-70的表达。
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分类号：R771.3 文献标识码：A
文章编号：1003-5141(2000)01-0017-04
Study on HLA-DR and HSP-70 of orbital tissue from Graves ophthalmopathy
ZHOU Xiao-Hong,LUO Qing-Li,XIA Rui-Nan
(Department of Ophthalmology,the First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041,Sichuan Province,China)
Abstract：Objective To investigate the expression and localization of human leukocyte antigen-DR(HLA-DR)and heat shock protein-70(HSP-70)in orbital tissue in patients with Graves ophthalmopathy.Method Orbital tissues were obtained from 19 patients with Graves ophthalmopathy and 17 control subjects.An immunohistochemical study were carried out using anti-HLA-DR and anti-HSP-70 monoclonal antibody and a streptavidin-biotin-peroxidase detection system.Results HLA-DR was detected on lymphocytes,intersitial cells and endothelial cells from 16 patients and 4 controls.HSP-70 was detected in eye muscles and interstitial cells from 13 of the patients and 3 of the controls.Significant expression of HSP-70 was more often demonstrated in patients with eye disease of short course than in those of long course.Conclusions These results support the notion that eye muscle fiber and fibroblast are important targets of the orbital autoimmune reaction that characterize Graves ophthalmopathy;HLA-DR and HSP-70 both play important roles in the reaction.
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Key words：Graves ophthalmopathy;autoimmune reaction;HLA-DR;HSP-70；immunomodulation protein▲
Graves病是内科常见病，目前普遍认为它是一种由于免疫自身稳定机制紊乱而诱发的自身免疫反应，其具体发病机制尚不清楚[1]。本研究目的在于通过免疫组化方法，了解Graves眼病患者眼部组织的HLA-DR和HSP-70的表达，探讨其免疫功能状态，为了解发病机制提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 收集1990～1996年因Graves眼病在我科行眼眶减压术后切除的眼外肌。患者共19例，其中男11例，女8例。年龄18～64a，平均47.1a。所有的病人都具有Graves眼病典型的临床症状和体征，并经CT证实。其中经皮质类固醇和免疫抑制剂治疗14例，未治5例；急性13例，慢性6例。眼外肌标本中下直肌10例，内直肌4例，上直肌2例，外直肌、上斜肌、下斜肌各1例。正常对照共17例，年龄25～54a的意外死亡者，切取眼外肌包括下直肌7例，外直肌3例，上直肌、内直肌、上斜肌各2例，下斜肌1例。用100g.L-1福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，储存于干燥环境中。
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1.2 实验方法 采用LSAB法检测HLA-DR和HSP-70的表达。其中一抗分别为鼠抗人HLA-DR单克隆抗体(Dako公司)和鼠抗人HSP-70单克隆抗体(Sigma公司)；二抗和三抗均由Victor公司提供。阳性对照由迈新公司提供，阴性对照用PBS代替一抗。
HLA-DR和HSP-70的染色是计算阳性细胞阳性率的平均值，再换算成Ⅲ级增殖指数，增殖指数≤25%记为“+”，26%～50%为“++”，>50%为“+++”，无染色则记为“-”。
1.3 统计学分析 采用确切概率法检验病例组和正常对照组HLA-DR和HSP-70的表达，并检验其表达与Graves眼病病程、治疗的关系。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 HLA-DR在眼眶组织的表达
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Figure 1 Significant expression of HLA-DR on infilltrated lymphocyte ×400 浸润淋巴细胞HLA-DR特异性染色
Figure 2 Significant expression of HLA-DR on fibroblast ×400 纤维母细胞HLA-DR特异性染色
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表1 Graves眼病眼眶组织与对照组HLA-DR表达的差异
Table 1 The difference of HLA-DR expression on orbital
tissue between Graves ophthalmopathy and control Group
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2.1.2 HAL-DR表达与Graves眼病病程的关系 结果经检验，P=0.1891，说明病程的长短与HLA-DR的表达无显著相关(见表2)。
表2 病程与HLA-DR表达的关系
Table 2 The relation of HLA-DR
expression on orbital tissue to course Course
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2.1.3 HLA-DR表达与Graves眼病治疗的关系 未治疗组与治疗组HLA-DR的表达有显著差异，P=0.0122，治疗组HLA-DR表达明显低于未治疗组(见表3)。表3 治疗与HLA-DR表达的关系
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2.2 HSP-70在眼眶组织的表达
2.2.1 病例组与对照组HSP-70表达的差异 病例组19例中HSP-70在13例眼外肌细胞表达(图3)，在纤维母细胞有染色阳性(图4)。正常对组则仅有3例出现肌细胞和纤维母细胞阳性着色，而大多数无染色。2组间HSP-70的表达有显著差异(见表4)，P=0.0055。
Figure 3 Significant expression of HSP-70 on extramuscle ×400 肌细胞HSP-70特异性染色
Figure 4 Significant expression of HSP-70 on fibroblast ×400 纤维母细胞HSP-70特异性染色
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表4 Graves眼病眼眶组织与对照组HSP-70表达的差异
Table 4 The difference of HSP-70 expression on orbital
tissues between Graves ophthalmopathy and control Group
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2.2.2 HSP-70表达与Graves眼病病程的关系 在病程短、处于急性期的病例中可见肌细胞及纤维母细胞有大量HSP-70的表达，明显强于病程长、处于慢性期的病例P=0.0003(见表5)。
表5 病程与HSP-70表达的关系
Table 1 The relation of HSP-70
expression on orbital tissue to course Course
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2.2.3 HSP-70表达程度与Graves眼病治疗的关系 未治疗组和治疗组HSP-70的表达强弱无明显差异(P=0.0758)(见表6)。表6 治疗与HSP-70表达的关系
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3 讨论
3.1 HLA-DR在Graves眼病眼外肌的表达
3.1.1 本研究证实在Graves眼病活跃期患者的眼外肌中有大量淋巴细胞浸润且其HLA-DR呈现强阳性，少量的浆细胞和巨噬细胞以及血管内皮细胞也有HLA-DR着色；静止期患者眼外肌以纤维化为主，大量纤维母细胞增生，这些纤维母细胞和血管内皮细胞有HLA-DR的表达；在未经免疫抑制治疗的患者中，HLA-DR在纤维母细胞、血管内皮细胞和浸润淋巴细胞的表达明显强于治疗组，并且在2例未治疗患者眼外肌有HLA-DR的弱阳性表达。上述结果与Weetman等[2]的报道相似，他们用石蜡包埋组织切片证实Graves眼病患者眼外肌的间质细胞有HLA-DR的表达，并认为间质细胞可能是Graves病自身免疫的靶细胞。而Hiromatsu等[3]用冰冻切片证实在3例未经治疗的Graves眼病患者的眼外肌HLA-DR呈强阳性。但因本研究采用石蜡切片，对眼外肌抗原有一定的破坏，而且已知免疫抑制治疗对HLA-DR的表达有明显抑制作用，因而眼外肌无HLA-DR的明显着色。
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3.1.2 虽然HLA-DR在眼部组织表达的具体作用还未阐明，但Graves病甲状腺滤泡细胞HLA-DR的明确表达，提示HLA-DR分子可能是甲状腺自身免疫性疾病的启动或持续因素[4]。已知Graves眼病浸润的淋巴细胞绝大多数是CD3+，其次是CD8、CD45RO等[5]且这些增多的淋巴细胞均为活化细胞。Graves眼病患者血清中可溶性白细胞介素-2受体(IL-2R)明显增高，而IL-2R的表达是T淋巴细胞活化增殖所必需的，它的增高提示T淋巴细胞活化[6]浸润的淋巴细胞可分泌大量的细胞因子，如α干扰素(α-IFN)、白细胞介素-4(IL-4)等。正常人的眼外肌细胞、纤维母细胞在体外α-IFN诱导下可增强HLA-DR分子的表达[7，8]。结合本研究结果，提示眼外肌细胞和纤维母细胞可能都是Graves眼病自身免疫反应的重要靶细胞。
3.2 HSP-70在肌细胞和纤维母细胞的表达
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3.2.1 现已证实HSP-70族能辅佐抗原提呈细胞(APC)加工提呈抗原。当APC摄入抗原决定簇后诱生伴随细胞的HSP-70族，由此族派生新成员称为72/74KDa肽结合蛋白(PBP72/74)。此蛋白与抗原结合，使抗原解离出肽片段，再由PBP72/74将抗原肽片段与细胞内MHCⅡ类分子结合加工成为免疫原性的超抗原，然后转移至细胞膜上提呈交给免疫活性细胞进行免疫应答[9，10]。
3.2.2 在Graves甲亢病中，甲状腺细胞有HSP-70的显著表达[11]。国外曾用免疫组化法证实HSP-70在肌细胞表达[3]，SDS-PAGE法证实它也表达在Graves眼病的纤维母细胞[12]。本研究证实其选择性表达于眼外肌和纤维母细胞，这与Tanaka等[13]用原位杂交技术测得在Graves眼病中眼外肌和纤维母细胞有HSP-70 mRNA表达的结果一致，可能与该病的慢性应激或免疫激活有关。因为HSP-70在细胞间加工处理和其它免疫调节过程中起重要作用。
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基金项目：四川省卫生厅科研基金资助课题。本文曾在第一届世界华人眼科学术大会上交流
作者简介：周晓红，女，生于1970年10月，四川省成都市人，汉族，中共党员。于1997年7月毕
业于华西医科大学，获医学硕士学位。现为华西医科大学附属第一医院眼科住院医
师。联系电话：028-5551255-22469，E-mail:zhlxzhxh@mail.sc.cninfo.net
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收稿日期：1998-10-21
修稿日期：1998-11-19, 百拇医药