应激对大鼠血浆唾液酸水平及免疫功能影响的研究
作者：陈蕾 陈文芳 陶尚敏 陈家津
单位：
关键词：应激；唾液酸；T淋巴细胞亚群
中国行为医学科学000104【摘要】目的 观察应激刺激对大鼠血浆唾液酸含量的影响及与免疫功能的关系。方法 采用紫外分光光度法测定应激及麻醉状态下大鼠血浆唾液酸含量的改变，同时应用免疫组织化学法检测外周血T淋巴细胞亚群的阳性率。结果 束缚+浸水应激组大鼠血浆唾液酸含量较清醒大鼠明显升高(t=3.25,P<0.01)，麻醉大鼠血浆唾液酸水平较清醒大鼠降低(t=3.17,P<0.01)；应激刺激可降低大鼠血液CD3、CD4细胞的百分率(t=4.56～5.81，P<0.01)而CD8百分率提高(t=2.78,P<0.05)。结论 应激刺激可提高大鼠血浆唾液酸水平，并抑制机体免疫功能。
, http://www.100md.com Effect of stress on plasma sialic acid level and immunofunction in rats
Chen Lei,Chen Wenfang,Tao Shangmin,et al.
(Department of Physiology,Qingdao Medical College.Qingdao,266021)
【Abstract】Objective To study the effect of stress on plasma sialic acid (SA) level and on the immunofunction.Methods The contents of SA was measured by means of ultroviolet spectrophotometry.In the meantime,the T cell and T cell subpopulations in the peripheral blood was studied by the methods of immunohistochemistry.Result (1) The plasma SA level was significantly increased in stress rats.(t=3.25,P<0.01).But the plasma SA level was decreased in anesthesia rats.(t=3.17,P<0.01); (2) CD3 cell,CD4 cell were decreased,but CD8 cell was increased in stress rats.(t=4.56,5.81,2.78,P<0.05～0.01).Conclusion Stress stimulation may enhanced the plasma SA level and inhibited the immunofunction.
, 百拇医药
【Key words】Stress Sialic acid T cell subpopulation
唾液酸(sialic acid,SA)是一种糖类物质，广泛存在于各种生物体内。在哺乳类动物体内，SA主要以结合的形式存在于组织细胞膜表面。近年来，国内外就SA进行了大量的研究。已证明SA是细胞膜糖蛋白和糖脂的重要结构和功能成分，是细胞膜上负电荷的来源，与细胞的转变、增殖分化，免疫调控等功能密切相关[1～3]。 目前SA作为恶性肿瘤的非特异性标记物,已在临床广泛应用。有关SA水平变化的机制，目前尚不十分清楚。沈延希等[4,5]报道，血浆SA水平的变化与机体的神经状态密切相关，神经系统可能在调节SA浓度的变化上起重要作用。我们以往的工作也提示，大鼠侧脑室及弓状核内β-内啡肽参与血浆SA水平的调节[6,7]。应激刺激作用于机体，可激活下丘脑-垂体-肾上腺系统，引起整体神经体液调节功能变化。本实验旨在探讨应激刺激对大鼠血浆SA含量的影响，同时观察与免疫功能的关系。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、 实验动物和分组
实验选用体重230～280g的健康雄性Wistar 大鼠30只，随机分组。(1)20%氨基乙酸乙酯麻醉组(8只)：腹腔注射20%氨基乙酸乙酯(1g/Kg),4h后断头取血；(2)清醒动物组(8只)；(3)应激实验组(14只)：将大鼠四肢固定于鼠板，浸于20℃左右水槽浸泡，水面至剑突，4h后断头取血。
二、 紫外分光光度计测定血浆SA含量
大鼠断头，取血，立即置肝素抗凝管中，3000r/min离心30min,取血浆0.1ml及f8836试剂4ml置于15mm×10mm玻璃试管中，混匀后，置沸水浴中准确加热10 min,取上清液，采用日本产UV-260型紫外分光光度计进行比色，波长560nm，试剂调零，结果以吸光度(A)表示。
, 百拇医药
三、 外周血T淋巴细胞亚群测定
应用免疫组织化学染色SP法(链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶法)检测外周血CD3(外周血总T淋巴细胞)、CD4(T辅助淋巴细胞)和 CD8(T抑制淋巴细胞)阳性率。SP试剂盒系美国 Zymed公司产品。取血(肝素抗凝)1ml，分离淋巴细胞后用PBS液洗二次，将淋巴细胞悬液滴于10孔抗原片上，每孔 20μl，放4℃丙酮-福尔马林固定液固定30S，PBS液洗2次后吹干；抗原片水化，加非免疫动物血清孵育10 min，加第一抗体60min后，再加生物素标记的二抗孵育10min；加链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶10min后 ，置于新配制的DAB显色液显色5min；苏木素复染核，常规脱水，透明，中性树胶封固，在高倍镜下连续记数200个淋巴细胞，计算其阳性细胞的百分数。
实验所得数据以平均数±标准差(
±s)表示，应用两样本均数的t检验进行统计学分析。
, 百拇医药
结 果
一、应激刺激对大鼠血浆SA水平的影响
20%氨基甲酸乙酯麻醉4h后，大鼠血浆SA水平较清醒大鼠明显降低 (t=3.17,P<0.01)；而束缚加浸水应激组大鼠血浆SA水平较清醒大鼠明显升高(t=3.25,P<0.01)。见表1
二、应激刺激对大鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
应激组大鼠CD3、CD4细胞的百分率均低于正常清醒组大鼠(t=4.56～5.81,P<0.01); 而CD8的百分率高于正常对照组(t=2.78,P<0.05)。应激状态下CD4/CD8比值明显降低(t=6.20,P<0.01)。见表2。
表1 应激刺激对大鼠血浆SA水平的影响(±s) 组别
, 百拇医药
n
吸光度(A)
对照组
8
0.291±0.010
麻醉组
8
0.267±0.018**
应激组
14
0.329±0.029**
**P<0.01 与对照组比较
, 百拇医药 表2 应激刺激对大鼠外周血T细胞及其亚群的影响(%) 组别
n
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
对照组
8
70.88±3.95
43.75±2.86
29.88±4.34
, 百拇医药
1.49±0.16
应激组
14
58.14±5.10
37.64±2.89
33.79±1.90
1.12±0.10
**
**
*
**
*P<0.05; **P<0.01
, 百拇医药
讨 论
血浆SA水平的检测在临床上广泛地应用于恶性肿瘤的诊断，疗效监测及预后等方面。近年来，国内外学者在SA检测方法的改进及临床应用方面有较多的研究，但有关SA水平的变化机制尚不完全清楚。有报道，4种肿瘤细胞于体外培养的条件下，培养前后培养液中未见SA水平提高。陈文芳等研究表明，中枢β-内啡肽等神经递质可调节血浆SA水平。可见血浆SA水平的变化与机体神经体液调节密切相关。临床上除肿瘤病人血浆SA水平升高外，某些感染或严重创伤病人SA水平也升高。应激刺激分为损伤性刺激和非损伤性刺激，而非损伤性应激与人类精神性(心理性)应激十分相似。本实验采用束缚加浸水制备非损伤性应激模型，探讨血浆SA水平的变化。结果显示应激刺激时大鼠血浆SA水平较清醒对照组明显升高；而与应激刺激相对应，麻醉状态下，SA水平明显降低。提示应激刺激可能通过交感神经和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能活动的改变，参与SA水平的调节，其机制有待于进一步深入探讨。
临床上SA水平升高的肿瘤病人往往伴有机体免疫功能的降低。本实验在检测到应激刺激升高SA水平的同时，测得外周血总T细胞(CD3)较正常组降低；T辅助细胞(CD4)降低，而T抑制细胞(CD8)升高，CD4/CD8比值明显下降。T抑制细胞(CD8)是重要的免疫调节细胞，可抑制体液和细胞免疫功能。应激刺激作用于机体后可引起一系列非特异性的神经--内分泌反应，其中主要特征为交感神经兴奋、垂体-肾上腺皮质激素分泌增多以及由此引起的各种机能、代谢的变化，其中也包括免疫机能的改变。应激刺激抑制免疫功能的主要途径是通过激活下丘脑-垂体-肾上腺系统，此外，应激时机体可产生免疫抑制因子。有报道非损伤性应激可使血清中产生能抑制正常淋巴细胞转化的抑制因子，且其免疫抑制作用不受切除肾上腺的影响。关于束缚+浸水应激降低机体免疫功能的机制及与血浆SA水平升高之间联系，还要进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Black PH.Shedding from the cell surface of normal and cancer cells.Adv Cancer Res,1980,32:75.
2，Alhadeff JA,Holzinger RT.Sialy transferase,sialic acid and sialoglycoconjugates in metastatic tumor and human liver tissue.Int J Biochem,1982,14(1):119～123.
3，周柔丽,肿瘤细胞表面复合糖类的变化及其意义.细胞生物学杂志，1989，11(1):18～22.
4，Erbil.K.M,Jones.J D,Klee G,et al.Use and liminations of serum total and lipid-bound sialic acid concentrations as markers for colorectal cancer.Cancer,1985,55:404～409.
, 百拇医药
5，沈延希，任光国，李力,等.唾液酸神经体液调节机理的探讨.四川省卫生管理干部学院学报，1992,2(11)：50～52.
6，陈文芳，陈家津，陈蕾.兴奋下丘脑弓状核神经元降低大鼠血浆唾液酸水平的作用.生理学报,1995，47(6)：597～600.
7，梁福波，陈家津，陈文芳,等.侧脑室注射β-内啡肽对大鼠血浆唾液酸水平的影响及其机制探讨.动物学报，1997，43(4)：361～365.
8，韩济生，关新民.医用神经生物学.武汉出版社，1995：305～307.
收稿日期：1999-04-23, 百拇医药
单位：
关键词：应激；唾液酸；T淋巴细胞亚群
中国行为医学科学000104【摘要】目的 观察应激刺激对大鼠血浆唾液酸含量的影响及与免疫功能的关系。方法 采用紫外分光光度法测定应激及麻醉状态下大鼠血浆唾液酸含量的改变，同时应用免疫组织化学法检测外周血T淋巴细胞亚群的阳性率。结果 束缚+浸水应激组大鼠血浆唾液酸含量较清醒大鼠明显升高(t=3.25,P<0.01)，麻醉大鼠血浆唾液酸水平较清醒大鼠降低(t=3.17,P<0.01)；应激刺激可降低大鼠血液CD3、CD4细胞的百分率(t=4.56～5.81，P<0.01)而CD8百分率提高(t=2.78,P<0.05)。结论 应激刺激可提高大鼠血浆唾液酸水平，并抑制机体免疫功能。
, http://www.100md.com Effect of stress on plasma sialic acid level and immunofunction in rats
Chen Lei,Chen Wenfang,Tao Shangmin,et al.
(Department of Physiology,Qingdao Medical College.Qingdao,266021)
【Abstract】Objective To study the effect of stress on plasma sialic acid (SA) level and on the immunofunction.Methods The contents of SA was measured by means of ultroviolet spectrophotometry.In the meantime,the T cell and T cell subpopulations in the peripheral blood was studied by the methods of immunohistochemistry.Result (1) The plasma SA level was significantly increased in stress rats.(t=3.25,P<0.01).But the plasma SA level was decreased in anesthesia rats.(t=3.17,P<0.01); (2) CD3 cell,CD4 cell were decreased,but CD8 cell was increased in stress rats.(t=4.56,5.81,2.78,P<0.05～0.01).Conclusion Stress stimulation may enhanced the plasma SA level and inhibited the immunofunction.
, 百拇医药
【Key words】Stress Sialic acid T cell subpopulation
唾液酸(sialic acid,SA)是一种糖类物质，广泛存在于各种生物体内。在哺乳类动物体内，SA主要以结合的形式存在于组织细胞膜表面。近年来，国内外就SA进行了大量的研究。已证明SA是细胞膜糖蛋白和糖脂的重要结构和功能成分，是细胞膜上负电荷的来源，与细胞的转变、增殖分化，免疫调控等功能密切相关[1～3]。 目前SA作为恶性肿瘤的非特异性标记物,已在临床广泛应用。有关SA水平变化的机制，目前尚不十分清楚。沈延希等[4,5]报道，血浆SA水平的变化与机体的神经状态密切相关，神经系统可能在调节SA浓度的变化上起重要作用。我们以往的工作也提示，大鼠侧脑室及弓状核内β-内啡肽参与血浆SA水平的调节[6,7]。应激刺激作用于机体，可激活下丘脑-垂体-肾上腺系统，引起整体神经体液调节功能变化。本实验旨在探讨应激刺激对大鼠血浆SA含量的影响，同时观察与免疫功能的关系。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、 实验动物和分组
实验选用体重230～280g的健康雄性Wistar 大鼠30只，随机分组。(1)20%氨基乙酸乙酯麻醉组(8只)：腹腔注射20%氨基乙酸乙酯(1g/Kg),4h后断头取血；(2)清醒动物组(8只)；(3)应激实验组(14只)：将大鼠四肢固定于鼠板，浸于20℃左右水槽浸泡，水面至剑突，4h后断头取血。
二、 紫外分光光度计测定血浆SA含量
大鼠断头，取血，立即置肝素抗凝管中，3000r/min离心30min,取血浆0.1ml及f8836试剂4ml置于15mm×10mm玻璃试管中，混匀后，置沸水浴中准确加热10 min,取上清液，采用日本产UV-260型紫外分光光度计进行比色，波长560nm，试剂调零，结果以吸光度(A)表示。
, 百拇医药
三、 外周血T淋巴细胞亚群测定
应用免疫组织化学染色SP法(链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶法)检测外周血CD3(外周血总T淋巴细胞)、CD4(T辅助淋巴细胞)和 CD8(T抑制淋巴细胞)阳性率。SP试剂盒系美国 Zymed公司产品。取血(肝素抗凝)1ml，分离淋巴细胞后用PBS液洗二次，将淋巴细胞悬液滴于10孔抗原片上，每孔 20μl，放4℃丙酮-福尔马林固定液固定30S，PBS液洗2次后吹干；抗原片水化，加非免疫动物血清孵育10 min，加第一抗体60min后，再加生物素标记的二抗孵育10min；加链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶10min后 ，置于新配制的DAB显色液显色5min；苏木素复染核，常规脱水，透明，中性树胶封固，在高倍镜下连续记数200个淋巴细胞，计算其阳性细胞的百分数。
实验所得数据以平均数±标准差(
±s)表示，应用两样本均数的t检验进行统计学分析。, 百拇医药
结 果
一、应激刺激对大鼠血浆SA水平的影响
20%氨基甲酸乙酯麻醉4h后，大鼠血浆SA水平较清醒大鼠明显降低 (t=3.17,P<0.01)；而束缚加浸水应激组大鼠血浆SA水平较清醒大鼠明显升高(t=3.25,P<0.01)。见表1
二、应激刺激对大鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
应激组大鼠CD3、CD4细胞的百分率均低于正常清醒组大鼠(t=4.56～5.81,P<0.01); 而CD8的百分率高于正常对照组(t=2.78,P<0.05)。应激状态下CD4/CD8比值明显降低(t=6.20,P<0.01)。见表2。
表1 应激刺激对大鼠血浆SA水平的影响(
±s) 组别, 百拇医药
n
吸光度(A)
对照组
8
0.291±0.010
麻醉组
8
0.267±0.018**
应激组
14
0.329±0.029**
**P<0.01 与对照组比较
, 百拇医药 表2 应激刺激对大鼠外周血T细胞及其亚群的影响(%) 组别
n
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
对照组
8
70.88±3.95
43.75±2.86
29.88±4.34
, 百拇医药
1.49±0.16
应激组
14
58.14±5.10
37.64±2.89
33.79±1.90
1.12±0.10
**
**
*
**
*P<0.05; **P<0.01
, 百拇医药
讨 论
血浆SA水平的检测在临床上广泛地应用于恶性肿瘤的诊断，疗效监测及预后等方面。近年来，国内外学者在SA检测方法的改进及临床应用方面有较多的研究，但有关SA水平的变化机制尚不完全清楚。有报道，4种肿瘤细胞于体外培养的条件下，培养前后培养液中未见SA水平提高。陈文芳等研究表明，中枢β-内啡肽等神经递质可调节血浆SA水平。可见血浆SA水平的变化与机体神经体液调节密切相关。临床上除肿瘤病人血浆SA水平升高外，某些感染或严重创伤病人SA水平也升高。应激刺激分为损伤性刺激和非损伤性刺激，而非损伤性应激与人类精神性(心理性)应激十分相似。本实验采用束缚加浸水制备非损伤性应激模型，探讨血浆SA水平的变化。结果显示应激刺激时大鼠血浆SA水平较清醒对照组明显升高；而与应激刺激相对应，麻醉状态下，SA水平明显降低。提示应激刺激可能通过交感神经和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能活动的改变，参与SA水平的调节，其机制有待于进一步深入探讨。
临床上SA水平升高的肿瘤病人往往伴有机体免疫功能的降低。本实验在检测到应激刺激升高SA水平的同时，测得外周血总T细胞(CD3)较正常组降低；T辅助细胞(CD4)降低，而T抑制细胞(CD8)升高，CD4/CD8比值明显下降。T抑制细胞(CD8)是重要的免疫调节细胞，可抑制体液和细胞免疫功能。应激刺激作用于机体后可引起一系列非特异性的神经--内分泌反应，其中主要特征为交感神经兴奋、垂体-肾上腺皮质激素分泌增多以及由此引起的各种机能、代谢的变化，其中也包括免疫机能的改变。应激刺激抑制免疫功能的主要途径是通过激活下丘脑-垂体-肾上腺系统，此外，应激时机体可产生免疫抑制因子。有报道非损伤性应激可使血清中产生能抑制正常淋巴细胞转化的抑制因子，且其免疫抑制作用不受切除肾上腺的影响。关于束缚+浸水应激降低机体免疫功能的机制及与血浆SA水平升高之间联系，还要进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Black PH.Shedding from the cell surface of normal and cancer cells.Adv Cancer Res,1980,32:75.
2，Alhadeff JA,Holzinger RT.Sialy transferase,sialic acid and sialoglycoconjugates in metastatic tumor and human liver tissue.Int J Biochem,1982,14(1):119～123.
3，周柔丽,肿瘤细胞表面复合糖类的变化及其意义.细胞生物学杂志，1989，11(1):18～22.
4，Erbil.K.M,Jones.J D,Klee G,et al.Use and liminations of serum total and lipid-bound sialic acid concentrations as markers for colorectal cancer.Cancer,1985,55:404～409.
, 百拇医药
5，沈延希，任光国，李力,等.唾液酸神经体液调节机理的探讨.四川省卫生管理干部学院学报，1992,2(11)：50～52.
6，陈文芳，陈家津，陈蕾.兴奋下丘脑弓状核神经元降低大鼠血浆唾液酸水平的作用.生理学报,1995，47(6)：597～600.
7，梁福波，陈家津，陈文芳,等.侧脑室注射β-内啡肽对大鼠血浆唾液酸水平的影响及其机制探讨.动物学报，1997，43(4)：361～365.
8，韩济生，关新民.医用神经生物学.武汉出版社，1995：305～307.
收稿日期：1999-04-23, 百拇医药