甲基汞对大鼠仔代早期神经行为发育的影响
作者：李健 刘苹 刘伟华 顾涛 张玲 耿菊敏
单位：
关键词：甲基汞；神经行为发育；大鼠仔代
中国行为医学科学000101【摘要】目的 探讨甲基汞对大鼠仔代早期神经行为发育的影响。方法 以Wistar大鼠为模型，采用甲基汞0，0.01，0.05，2.00 mg/kg剂量于大鼠妊娠第6～9天经口灌胃染毒，观察仔鼠出生后体重增长、早期生理发育和神经行为发育指标。结果 暴露组仔鼠的体重增长、早期生理发育及神经行为发育明显滞后于对照组(P<0.05),具有一定的剂量-效应关系。结论 甲基汞能延迟大鼠仔代的早期生理发育及中枢神经系统的发育，导致神经行为功能的异常。
Effect of methylmercury on early neurobehavioral development in rat offspring
, http://www.100md.com
Li Jian，Liu Ping，Liu Weihua,et al.
(Faculty of Public Health,Kunming Medical College,KunMing,650031)
【Abstract】Objective To study the effect of methylmercury on early neurobehavioral development in Wistar rat offspring.Methods Methylmercury in doses of 0,0.01,0.05 and 2.00mg/kg was force fed to pregnant rats during the 6th～9th day after conception.Then body weight and developing landmarks of offspring were measured.Results The body weight,physiological and neurobehavioral development of treatment groups were delayed much more than those of control group (P<0.05).It showed dose-effects relationships.Conclusions Methylmercury could affect the early development of central nervous system and lead to neurobehavioral changes in rat offspring.
, 百拇医药
【Key words】Methylmercury Neurobehavioral development Rat offspring
甲基汞是一种脂溶性剧毒有机重金属化合物，严重危害人体健康和安全。50年代日本发生震惊世界的“水俣病”，就是由于甲基汞污染引起的公害病[1]。脑是甲基汞的靶器官，由于它可以通过胎盘屏障，对胎儿的侵犯部位几乎遍及全脑，因此对胎儿的影响更为严重。目前，对甲基汞的行为致畸作用已较肯定[2]，但关于甲基汞的神经行为效应国内未见报道。为探讨甲基汞对动物仔代早期神经行为发育的影响，进行了本研究。
材料与方法
一、材料
受试物：氯化甲基汞(methylmercury chloride)，CH3HgCl，由德国Alfa公司提供(批号：4310700)。
, 百拇医药
实验动物：健康3月龄Wistar大鼠，体重200～300 g，由中科院昆明动物研究所提供(动物合格证号：0000757)。雌雄以3:1于晚6:00时合笼，次日晨进行阴道涂片检查，凡查出有精子者确定为已交配，当日定为受孕“第0天”。实验动物喂饲标准饲料(由昆明医学院天然药物重点实验室提供)，自由饮水。
二、方法
实验剂量及分组：每天将阴道涂片精子检查为阳性的孕验鼠随机分成4组，于妊娠第6，7，8，9 天进行灌胃处理。3个暴露组的甲基汞剂量分别为2.00，0.05， 0.01 mg/kg，1个空白对照组采用蒸馏水灌胃。整个实验过程采用双盲法。
观察指标：(1)一般指标：仔鼠活胎数、死胎数、外观畸形、存活率。(2)生长情况：测定体重，仔鼠出生后每3天称量一次体重，28天后每周一次，连续4周。(3)早期生理发育指标：分别记录仔鼠出生后张耳、门牙萌出、开眼、睾丸下降、阴道开启的时间，并计算出各组指标的出现率。(4)神经行为发育指标：断崖回避、平面翻正、前肢悬挂、空中翻正、听觉惊愕、视觉定位，分别于仔鼠出生后第4、6、10、12、14、17天观察记录。
, 百拇医药
统计处理：实验数据采用PEMS 2.1版统计软件包在586微机上进行统计处理。采用t检验、秩和检验、Q检验、χ2 检验等。
结 果
一、一般情况
各暴露组与对照组相比，仔鼠活胎数、死胎数、存活率均无显著性差异(P>0.05)，4个实验组仔鼠均未发现外观形态畸形。
二、甲基汞对仔鼠体重增长的影响
图1显示，甲基汞暴露组的仔鼠出生后体重增长明显低于对照组，且随甲基汞剂量的增加而降低，第16、19天时高、中、低剂量组比对照组显著降低(P<0.05,P<0.01)，第7、8周时高剂量组比对照组显著降低(P<0.01)。
, http://www.100md.com
图1 仔鼠体重增长曲线
三、甲基汞对仔鼠早期生理发育的影响
由表1可看出，门牙萌出率、开眼率、阴道开启率各暴露组与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；张耳率低剂量组与对照组比较显著升高(P<0.05)；睾丸下降率高剂量组与对照组比较显著降低(P<0.05)；各项生理发育指标除门牙萌出率外，其余指标有随甲基汞剂量增加而降低的趋势。
表1 甲基汞对仔鼠早期生理发育的影响(%) 剂量组
(mg/kg)
样本数
(只)
张耳率
门牙萌出
, http://www.100md.com
率
开眼率
睾丸下降
率
阴道开启
率
0
44
71.74
100.00
62.22
100.00
22.22
, 百拇医药
0.01
50
98.00*
100.00
73.47
95.45
13.04
0.05
41
72.09
100.00
76.74
84.62
, http://www.100md.com
30.77
2.00
66
57.58
100.00
50.00
80.00*
17.65
与对照组比较 *P<0.05
四、甲基汞对仔鼠神经行为发育的影响
神经行为发育测试结果中，断崖回避、平面翻正、空中翻正、视觉定位，各暴露组与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；前肢悬挂时间高剂量组比其它3组均显著缩短(P<0.05)(表2)；听觉惊愕级别高、中剂量组与对照组比较均显著升高(P<0.01)(表3)。
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表2 甲基汞对仔鼠前肢悬挂时间的影响 剂量组(mg/kg)
样本数 (只)
前肢悬挂时间(秒)
0～
5～
10～
15～
20～
0
46
1
8
15
, 百拇医药
11
11
0.01
50
0
11
8
11
20
0.05
43
3
7
8
, 百拇医药
6
19
2.00*
66
15
19
9
9
14
表3 甲基汞对仔鼠听觉惊愕分级的影响 剂量组(mg/kg)
样本数 (只)
听觉惊愕分级
-
, 百拇医药
+
++
+++
0
44
6
33
5
0
0.01
50
14
32
4
, http://www.100md.com
0
0.05**
41
3
18
13
7
2.00**
66
5
37
21
3
与对照组比较 *P < 0.05,** P < 0.01讨论
, 百拇医药
甲基汞进入脑组织后，损害最严重的部位是小脑和大脑两半球，特别是枕叶、脊髓后束和末梢感觉神经，致使患者主要以小脑性运动失调、视野缩小、发音困难三大主要症状为特征，此外肢体感觉神经损害症状也很常见。近年来，人们对甲基汞的关注点移向了它的敏感效应，如与中枢神经系统功能有关的行为和认知改变。并且人们逐渐认识到胎儿比成人对甲基汞更易感，而甲基汞可随血液透过胎盘屏障，侵入胎儿脑组织，对胎儿脑细胞造成更为广泛而严重的损害[3]。
大量关于甲基汞神经行为毒性的研究表明，动物妊娠期暴露于甲基汞后，仔代可产生明显的行为改变，并具有剂量效应关系[4]。本实验发现：怀孕大鼠在妊娠6～9天暴露于甲基汞后，其仔鼠出生后体重增长明显低于对照组；暴露组张耳率升高，睾丸下降率降低；前肢悬挂时间缩短，听觉惊愕程度升高，结果与许多学者的结论相似。80年代中期国际上进行的行为畸胎学合作研究(collaborative behavioral teratology study,CBTS)主要针对仔代动物产前暴露于外源化学物，出生后功能的失调[5]。在SD大鼠怀孕第6～9天时给予甲基汞灌胃，剂量分别为0，2.0及6.0 mg/kg，应用辛辛那提及CBTS测试组合对大鼠进行测试。结果表明，6.0 mg/kg剂量甲基汞能增加仔鼠断奶前的死亡率，并加速门牙萌出及开眼时间，延迟阴道开启时间；在出生30天内体重无差别，而60天内则可见到差异性；还能显著影响平面翻正的能力，增加听觉惊愕的反应幅度；而2.0 mg/kg剂量甲基汞却能加速负趋地性的能力[6]。一些研究者[7,8]在大鼠孕期6～9天时以0，0.025，0.05，0.5，5.0 mg/kg剂量的甲基汞进行灌胃，大鼠仔代听觉惊愕的反应幅度显著增高。Rice DC[9] 和Wassick KH[10]的研究亦表明，猴和小鼠接触甲基汞后，可诱发高频区听力损伤。
, 百拇医药
甲基汞明显的神经行为毒性，可能与它影响到脑组织的生长发育、生殖细胞的损伤、细胞的凋亡、生物膜的损伤以及神经递质的改变等有关[11]。有文献报道[7]，出生前暴露于低剂量甲基汞后，仔代出生后的组织病理学显示：主管躯体感觉的大脑皮质中，锥体细胞的短粗蘑菇状树突嵴减少，同时长而弯曲的树突嵴增多。而树突嵴在大脑皮质椎体细胞和小脑蒲肯野细胞树突上数量最多且明显，是形成突触的主要部位[12]。树突嵴的变化可能是导致甲基汞暴露后动物仔代神经行为发育异常的原因之一。对此有待作进一步的研究。
(本课题得到纳冬荃、毛玉明、张肇玖等老师的大力支持与帮助，在此谨致谢意!)
参考文献
1，蔡宏道主编.现代环境卫生学.第一版.北京:人民卫生出版社,1995:25～25.
2，张铣,刘毓谷主编.毒理学.第一版.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1997:418～420.
, 百拇医药
3，Watanabe C,Satoh H.Evolution of our understanding of methylmercury as a health threst.Environ-Health-Perspect,1996,104 Suppl 2:367～379.
4，Shimai S,Satoh H.Behavioral teratology of methylmercury.J-Toxicol-Sci,1985,10(3):199～216.
5，Kimmel CA,Buelke Sam J.Collaborative Behavioral Teratology Study:background and overview.Neurobehav-Toxicol-Teratol,1985,7(6):541～545.
6，Vorhees CV.Behavioral effects of prenatal methylmercury in rats:a parallel trial to Collaborative Behavioral Teratology Study.Neurobehav-Toxicol-Teratol,1985,7(6):717～725.
, 百拇医药
7，Stoltenburg Didinger G,Markwort S.Prenatal methylmercury exposure results in dendritic spine dysgenesis in rats.Neurotoxicol-Teratol,1990,12(6):573～576.
8，Elsner J,Hodel B,Suter KE,et al.Detection limits of different approaches in behavioral teratology,and correlation of effects with neurochemical parameters.Neurotoxicol-Teratol,1988,10(2):155～167.
9，Rice DC,Gilbert SG.Exposure to methyl mercury from birth to adulthood impairs high-frequency hearing in monkeys.Toxicol-Appl-Pharmacol,1992,115(1):6～10.
10，Wassick KH,Yonovitz A.Methyl mercury ototoxicity in mice determined by auditory brainstem responses.Acta-Otolaryngol-Stockh,1985,99(1-2):35～45.
11，李健,刘苹.甲基汞的神经行为毒性.昆明医学院学报,1999,20(3):83～87.
12，成令忠主编.组织学与胚胎学(第3版).北京:人民卫生出版社,1994:79～79.
收稿日期：1999—07—19, http://www.100md.com
单位：
关键词：甲基汞；神经行为发育；大鼠仔代
中国行为医学科学000101【摘要】目的 探讨甲基汞对大鼠仔代早期神经行为发育的影响。方法 以Wistar大鼠为模型，采用甲基汞0，0.01，0.05，2.00 mg/kg剂量于大鼠妊娠第6～9天经口灌胃染毒，观察仔鼠出生后体重增长、早期生理发育和神经行为发育指标。结果 暴露组仔鼠的体重增长、早期生理发育及神经行为发育明显滞后于对照组(P<0.05),具有一定的剂量-效应关系。结论 甲基汞能延迟大鼠仔代的早期生理发育及中枢神经系统的发育，导致神经行为功能的异常。
Effect of methylmercury on early neurobehavioral development in rat offspring
, http://www.100md.com
Li Jian，Liu Ping，Liu Weihua,et al.
(Faculty of Public Health,Kunming Medical College,KunMing,650031)
【Abstract】Objective To study the effect of methylmercury on early neurobehavioral development in Wistar rat offspring.Methods Methylmercury in doses of 0,0.01,0.05 and 2.00mg/kg was force fed to pregnant rats during the 6th～9th day after conception.Then body weight and developing landmarks of offspring were measured.Results The body weight,physiological and neurobehavioral development of treatment groups were delayed much more than those of control group (P<0.05).It showed dose-effects relationships.Conclusions Methylmercury could affect the early development of central nervous system and lead to neurobehavioral changes in rat offspring.
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【Key words】Methylmercury Neurobehavioral development Rat offspring
甲基汞是一种脂溶性剧毒有机重金属化合物，严重危害人体健康和安全。50年代日本发生震惊世界的“水俣病”，就是由于甲基汞污染引起的公害病[1]。脑是甲基汞的靶器官，由于它可以通过胎盘屏障，对胎儿的侵犯部位几乎遍及全脑，因此对胎儿的影响更为严重。目前，对甲基汞的行为致畸作用已较肯定[2]，但关于甲基汞的神经行为效应国内未见报道。为探讨甲基汞对动物仔代早期神经行为发育的影响，进行了本研究。
材料与方法
一、材料
受试物：氯化甲基汞(methylmercury chloride)，CH3HgCl，由德国Alfa公司提供(批号：4310700)。
, 百拇医药
实验动物：健康3月龄Wistar大鼠，体重200～300 g，由中科院昆明动物研究所提供(动物合格证号：0000757)。雌雄以3:1于晚6:00时合笼，次日晨进行阴道涂片检查，凡查出有精子者确定为已交配，当日定为受孕“第0天”。实验动物喂饲标准饲料(由昆明医学院天然药物重点实验室提供)，自由饮水。
二、方法
实验剂量及分组：每天将阴道涂片精子检查为阳性的孕验鼠随机分成4组，于妊娠第6，7，8，9 天进行灌胃处理。3个暴露组的甲基汞剂量分别为2.00，0.05， 0.01 mg/kg，1个空白对照组采用蒸馏水灌胃。整个实验过程采用双盲法。
观察指标：(1)一般指标：仔鼠活胎数、死胎数、外观畸形、存活率。(2)生长情况：测定体重，仔鼠出生后每3天称量一次体重，28天后每周一次，连续4周。(3)早期生理发育指标：分别记录仔鼠出生后张耳、门牙萌出、开眼、睾丸下降、阴道开启的时间，并计算出各组指标的出现率。(4)神经行为发育指标：断崖回避、平面翻正、前肢悬挂、空中翻正、听觉惊愕、视觉定位，分别于仔鼠出生后第4、6、10、12、14、17天观察记录。
, 百拇医药
统计处理：实验数据采用PEMS 2.1版统计软件包在586微机上进行统计处理。采用t检验、秩和检验、Q检验、χ2 检验等。
结 果
一、一般情况
各暴露组与对照组相比，仔鼠活胎数、死胎数、存活率均无显著性差异(P>0.05)，4个实验组仔鼠均未发现外观形态畸形。
二、甲基汞对仔鼠体重增长的影响
图1显示，甲基汞暴露组的仔鼠出生后体重增长明显低于对照组，且随甲基汞剂量的增加而降低，第16、19天时高、中、低剂量组比对照组显著降低(P<0.05,P<0.01)，第7、8周时高剂量组比对照组显著降低(P<0.01)。
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图1 仔鼠体重增长曲线
三、甲基汞对仔鼠早期生理发育的影响
由表1可看出，门牙萌出率、开眼率、阴道开启率各暴露组与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；张耳率低剂量组与对照组比较显著升高(P<0.05)；睾丸下降率高剂量组与对照组比较显著降低(P<0.05)；各项生理发育指标除门牙萌出率外，其余指标有随甲基汞剂量增加而降低的趋势。
表1 甲基汞对仔鼠早期生理发育的影响(%) 剂量组
(mg/kg)
样本数
(只)
张耳率
门牙萌出
, http://www.100md.com
率
开眼率
睾丸下降
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71.74
100.00
62.22
100.00
22.22
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0.01
50
98.00*
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13.04
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30.77
2.00
66
57.58
100.00
50.00
80.00*
17.65
与对照组比较 *P<0.05
四、甲基汞对仔鼠神经行为发育的影响
神经行为发育测试结果中，断崖回避、平面翻正、空中翻正、视觉定位，各暴露组与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；前肢悬挂时间高剂量组比其它3组均显著缩短(P<0.05)(表2)；听觉惊愕级别高、中剂量组与对照组比较均显著升高(P<0.01)(表3)。
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表2 甲基汞对仔鼠前肢悬挂时间的影响 剂量组(mg/kg)
样本数 (只)
前肢悬挂时间(秒)
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表3 甲基汞对仔鼠听觉惊愕分级的影响 剂量组(mg/kg)
样本数 (只)
听觉惊愕分级
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与对照组比较 *P < 0.05,** P < 0.01讨论
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甲基汞进入脑组织后，损害最严重的部位是小脑和大脑两半球，特别是枕叶、脊髓后束和末梢感觉神经，致使患者主要以小脑性运动失调、视野缩小、发音困难三大主要症状为特征，此外肢体感觉神经损害症状也很常见。近年来，人们对甲基汞的关注点移向了它的敏感效应，如与中枢神经系统功能有关的行为和认知改变。并且人们逐渐认识到胎儿比成人对甲基汞更易感，而甲基汞可随血液透过胎盘屏障，侵入胎儿脑组织，对胎儿脑细胞造成更为广泛而严重的损害[3]。
大量关于甲基汞神经行为毒性的研究表明，动物妊娠期暴露于甲基汞后，仔代可产生明显的行为改变，并具有剂量效应关系[4]。本实验发现：怀孕大鼠在妊娠6～9天暴露于甲基汞后，其仔鼠出生后体重增长明显低于对照组；暴露组张耳率升高，睾丸下降率降低；前肢悬挂时间缩短，听觉惊愕程度升高，结果与许多学者的结论相似。80年代中期国际上进行的行为畸胎学合作研究(collaborative behavioral teratology study,CBTS)主要针对仔代动物产前暴露于外源化学物，出生后功能的失调[5]。在SD大鼠怀孕第6～9天时给予甲基汞灌胃，剂量分别为0，2.0及6.0 mg/kg，应用辛辛那提及CBTS测试组合对大鼠进行测试。结果表明，6.0 mg/kg剂量甲基汞能增加仔鼠断奶前的死亡率，并加速门牙萌出及开眼时间，延迟阴道开启时间；在出生30天内体重无差别，而60天内则可见到差异性；还能显著影响平面翻正的能力，增加听觉惊愕的反应幅度；而2.0 mg/kg剂量甲基汞却能加速负趋地性的能力[6]。一些研究者[7,8]在大鼠孕期6～9天时以0，0.025，0.05，0.5，5.0 mg/kg剂量的甲基汞进行灌胃，大鼠仔代听觉惊愕的反应幅度显著增高。Rice DC[9] 和Wassick KH[10]的研究亦表明，猴和小鼠接触甲基汞后，可诱发高频区听力损伤。
, 百拇医药
甲基汞明显的神经行为毒性，可能与它影响到脑组织的生长发育、生殖细胞的损伤、细胞的凋亡、生物膜的损伤以及神经递质的改变等有关[11]。有文献报道[7]，出生前暴露于低剂量甲基汞后，仔代出生后的组织病理学显示：主管躯体感觉的大脑皮质中，锥体细胞的短粗蘑菇状树突嵴减少，同时长而弯曲的树突嵴增多。而树突嵴在大脑皮质椎体细胞和小脑蒲肯野细胞树突上数量最多且明显，是形成突触的主要部位[12]。树突嵴的变化可能是导致甲基汞暴露后动物仔代神经行为发育异常的原因之一。对此有待作进一步的研究。
(本课题得到纳冬荃、毛玉明、张肇玖等老师的大力支持与帮助，在此谨致谢意!)
参考文献
1，蔡宏道主编.现代环境卫生学.第一版.北京:人民卫生出版社,1995:25～25.
2，张铣,刘毓谷主编.毒理学.第一版.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1997:418～420.
, 百拇医药
3，Watanabe C,Satoh H.Evolution of our understanding of methylmercury as a health threst.Environ-Health-Perspect,1996,104 Suppl 2:367～379.
4，Shimai S,Satoh H.Behavioral teratology of methylmercury.J-Toxicol-Sci,1985,10(3):199～216.
5，Kimmel CA,Buelke Sam J.Collaborative Behavioral Teratology Study:background and overview.Neurobehav-Toxicol-Teratol,1985,7(6):541～545.
6，Vorhees CV.Behavioral effects of prenatal methylmercury in rats:a parallel trial to Collaborative Behavioral Teratology Study.Neurobehav-Toxicol-Teratol,1985,7(6):717～725.
, 百拇医药
7，Stoltenburg Didinger G,Markwort S.Prenatal methylmercury exposure results in dendritic spine dysgenesis in rats.Neurotoxicol-Teratol,1990,12(6):573～576.
8，Elsner J,Hodel B,Suter KE,et al.Detection limits of different approaches in behavioral teratology,and correlation of effects with neurochemical parameters.Neurotoxicol-Teratol,1988,10(2):155～167.
9，Rice DC,Gilbert SG.Exposure to methyl mercury from birth to adulthood impairs high-frequency hearing in monkeys.Toxicol-Appl-Pharmacol,1992,115(1):6～10.
10，Wassick KH,Yonovitz A.Methyl mercury ototoxicity in mice determined by auditory brainstem responses.Acta-Otolaryngol-Stockh,1985,99(1-2):35～45.
11，李健,刘苹.甲基汞的神经行为毒性.昆明医学院学报,1999,20(3):83～87.
12，成令忠主编.组织学与胚胎学(第3版).北京:人民卫生出版社,1994:79～79.
收稿日期：1999—07—19, http://www.100md.com