基因治疗靶向载体研究进展(二)
作者：贺平 汤钊猷
单位：贺平 汤钊猷(上海医科大学中山医院肝癌研究所 上海 200032)
关键词：基因治疗；靶向诱导载体
中国肿瘤生物治疗杂志000121
摘 要 针对基因治疗安全性，国内外研究的重点之一是寻找理想的靶向表达载体。除了构建靶向转导载体和靶向转录载体外，还有利用可诱导的启动子或人工合成的转录因子，构建靶向诱导系统，以诱导目的基因按一定的时相表达。本文综述有关基因治疗靶向诱导载体的研究进展。
《中国图书资料分类法》分类号 Q782
靶向转录载体中所用的组织特异的启动子常导致目的基因在特定靶组织中呈基础性表达，表达水平不高。靶向诱导载体常用组织特异性的可诱导的启动子，通过诱导物的作用以调控目的基因按一定的时相表达。通过外加无毒的诱导剂来提高外源基因的表达。
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1 利用细胞或病毒启动子构建靶向诱导载体
有些细胞启动子，如糖皮质激素和重金属反应启动子及细胞色素P450A1启动子，能够被有效地诱导，但它们缺乏组织特异性。有些启动子兼具组织特异性和可诱导性两个特点，如酪氨酸酶启动子的活性限制在黑素细胞系中，这个启动子含有cAMP反应元件(CRE)，能对cAMP上调物起反应。研究发现，氨茶碱等PKA激活性能促进受酪氨酸酶启动子启动的细胞因子基因在黑素细胞系中的表达，而在成纤维细胞中不表达[1]。但在体内实验中没有出现类似效应。
一个更为复杂的方法是鉴定某些细胞启动子，它们在特殊病理状态下优先激活。利用这些启动子构建的靶向诱导载体，即使在健康和病理组织混杂的情况下，也能实现目的基因仅在适当的靶细胞中特异表达。例如，在实体瘤中典型的病理状态是缺氧。研究发现，内皮细胞生长因子(VEGF)与血管形成密切相关，在缺氧条件下，其表达增加。VEGF的缺氧诱导反应是与位于VEGF基因5′端缺氧反应转录激活元件的存在有关[2]。这类元件可用来构建靶向诱导载体，在缺氧条件下诱导表达目的基因以阻断肿瘤的血管形成。内皮细胞一氧化氮合成酶启动子含有相似的缺氧反应元件，在缺氧时，能调控转录[3]。
, 百拇医药
这种经病理状态诱导调控目的基因表达的策略，不仅用于肿瘤，也可用于其它疾病的治疗。炎症刺激诱导鼠补体因子3(CF3)和血清淀粉样蛋白3(SA3)的表达，它们各自的启动子组装到AdV载体中，在体内指导目的基因的表达时，仍保留这种可诱导性[4]。CF3启动子经脂多糖(LPS)和松油脂诱导在肝和肺组织中表达，而SA3启动子活性仅在肝脏起作用，且更易受LPS诱导。因此，这些启动子似乎都表现出组织特异性和病理依赖的转录活性。这类转录控制元件的使用比较安全，因为一旦病理状态消失，诱导因素也就消失，目的基因的表达也将停止。
有研究证明，这种可诱导表达的靶向调控载体可用于基因治疗。如用放射线照射诱导早期生长反应基因-1(EGR-1) 启动子表达肿瘤坏死因子-α[5]。这里诱导剂本身就有杀肿瘤细胞的作用，这种杀瘤作用可通过诱导目的基因的表达进一步加强。EGR启动子经腺病毒介导转入实验性肿瘤中，它仍有放射线诱导活性，而且经放射线处理后，导致肿瘤的进一步消除而不增加毒性作用。由于放射线照射不仅作为一种治疗剂，同时也作为一种诱导剂暂时性和区域性激活外源抗肿瘤基因的表达，因此，这种方法可能对肿瘤基因治疗有重要价值。
, 百拇医药
2 利用人工合成的诱导物/启动子系统构建靶向诱导载体
上述根据可诱导的细胞启动子来构建靶向诱导载体具有一定的缺陷。因为诱导物的效应很复杂，细胞内源性启动子和载体所用的启动子都对诱导物起反应，而且会有内源激活物的干扰。更好的调控系统能通过应用正常的惰性化合物对靶组织中的目的基因表达进行诱导调控。
2.1 原核转录控制系统的应用
2.1.1 乳糖操纵子(Lac操纵子),经典的原核转录控制系统是大肠杆菌Lac操纵子。LacZ的转录受阻遏蛋白负调控，阻遏蛋白与LacZ启动子中特异的操纵子序列结合，阻遏LacZ基因的转录。正常情况下，阻遏蛋白呈基础表达，因此，LacZ基因不表达。在β-半乳糖苷酶底物或其类似物IPTG存在下，阻遏蛋白与这些诱导剂结合而失活，LacZ基因开始转录。Baim发现将HSV的VP16蛋白插入到Lac阻遏蛋白中，可使后者转变为Lac的转录激活物[6]，因为VP16蛋白具有转录激活的功能域。因此，这个嵌合蛋白能与Lac操纵子序列结合而诱导转录，而且VP16的插入还使这个嵌合蛋白具有温度调控活性，它在32℃时有DNA结合活性而在39.5℃失去此活性。
, 百拇医药
Ward将T7噬菌体RNA聚合酶基因置于Lac操纵子的启动子控制之下，将外源目的基因置于含T7 RNA聚合酶识别位点的启动子控制之下，再将这二个转录单位以相反的方向装入疫苗病毒(vaccinia virus)中，与病毒的转录相关联，阻遏蛋白抑制T7RNA聚合酶的表达，进而抑制外源目的基因的转录，在诱导剂存在下(如加IPTG或对温度敏感的Lac阻遏蛋白突变体升高温度)，阻遏蛋白失活，不能结合到Lac操纵子上，T7RNA聚合酶得以转录，随之引起被调控基因的转录[7]。很明显，这个系统比目的基因单独置于Lac操纵子控制下具有更低的基础转录活性和更高的可诱导性。但这个系统的不足之处是达到最大转录活性所需的IPTG水平较高，可能有毒性作用。而且温度敏感系统对人类的基因治疗也不适合。
2.1.2 四环素操纵子(tet操纵子)中抗性基因的转录也是通过tet阻遏蛋白结合到操纵子上而起负性调控作用，四环素可与阻遏蛋白结合而诱导tet操纵子开始转录。将tet阻遏蛋白与VP16激活区融合也可逆转阻遏蛋白的作用，形成受四环素抑制的嵌合体反式转录激活因子(tTA)，它可以激活人工合成的含tet操纵子DNA序列的启动子的转录。当四环素浓度达到50 ng/ml时，这个启动子的转录受到抑制，当四环素浓度降低时，这个启动子的转录活性可被成比例地放大，再加入四环素后，又可抑制其转录。
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tet阻遏系统已经与组织特异的转录控制元件一起联合使用。Deuschle将tTA与人锌指蛋白kox1中的KREB阻遏结构域融合在一起，一旦与tet操纵子序列结合，这个蛋白能阻断下游远至3 kb的基因的转录[8]。
Gossen于1995年发现一种突变的tet阻遏蛋白(rtTA)，它在四环素存在时，能与DNA结合[9]。因此，利用这个突变蛋白可将tet阻遏系统转变为诱导系统，这个突变蛋白与其野生型相比有4个氨基酸残基发生突变，它诱导的启动子的转录在24 h内即可达到最大值，但它需要相对高浓度的四环素(1 μg/ml)。这个rtTA系统在需要快速诱导基因表达的情况下，有较大的应用价值，但它诱导基因表达的速率受机体清除四环素速率的影响。
将tet阻遏系统装入重组病毒载体中，仍能发挥调控作用。Hu等将tet阻遏系统插入到腺病毒载体中，构建AdVtTA重组载体，以调控TNF-β的表达[10]。将这个重组载体转入人肿瘤细胞和T淋巴细胞中，不加四环素时，24 hTNF的表达量达5～10 μg/106细胞；当加入四环素时(浓度为0.1 mg/ml)，TNF的表达彻底抑制。利用这种方法，可限制TNF严重的毒副反应。
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尽管四环素调控系统的设计方案多种多样，但它不可能适用于所有的细胞。同时，tTA系统的一个不足之处是难以达到高水平表达的tTA，这可能是由于VP16结构域的毒性淬灭效应；再者，病毒来源的VP16激活域可能对人有免疫原性。因此，还需不断地发展比较完善的可应用于人类的基因靶向诱导载体系统。
2.2 真核转录控制系统的应用
理论上说，哺乳动物细胞中所没有的任一调控元件都可用来构建靶向诱导载体。如酿酒酵母DNA结合蛋白GAL4和LEU3等。在α-异丙基苹果酸酯存在下，LEU3可诱导某些启动子在哺乳动物细胞中的转录，这些启动子通常含哺乳动物细胞中不存在的转录调控元件。应用昆虫蜕皮素类似物也可在哺乳动物细胞中对外源含蜕皮素反应元件的启动子进行有效地调控[11]。这个系统可能比tet阻遏系统有更强的可诱导性和更低的基础活性。No等进一步改进了这个系统，如用VP16蛋白置换蜕皮素受体的氨基末端；用哺乳动物类固醇受体的一个单体作为蜕皮素异源二聚体的一个组份；插入SP1转录因子识别序列以使蜕皮素依赖的启动子有更强的反应性。然而，这个系统相对比较复杂，因为它需要表达2个不同的受体，在蜕皮素类固醇的存在下，形成异源二聚体以识别蜕皮素反应元件[12]。
, 百拇医药
哺乳动物核激素受体通过配体识别而激活并随之结合到受激素调控的基因启动子的特异元件上，促进这些基因的转录。对这些受体进行某种处理后，可以利用它们构建一个适于外源基因调控的靶向诱导载体。例如，将核受体的DNA结合区用识别非哺乳动物转录调控模式的结构域替代，以避免对转录的非特异影响；或者改变这些受体的配体结合区特异性，以识别药用化合物，而不识别内源性的类固醇，以避免内源性类固醇的非特异激活。雌激素受体可用来构建这种靶向诱导载体系统。将VP16的激活域与GAL4的DNA结合域融合到雌激素受体的配体结合区(LBD)，构建一个嵌合转录因子。当有雌二醇时，它与受体结合，使GAL4与其识别序列结合，并进而促进VP16激活启动子的转录(一般认为在哺乳动物基因组中不存在GAL4结合位点)，经短暂转染细胞后，雌二醇可诱导这类启动子的转录效率提高100倍，但雌二醇的用量也较大(浓度达1 μm)。
Whelan和Miller对这一系统进研了改进。利用低保真性的PCR技术对雌激素受体的LBD区进行随机突变，筛选一种突变体使其仅识别非毒性的药用化合物而不识别雌二醇，将这个突变的LBD与人转录因子NF-kB的P65激活区和酵母GAL4蛋白融合在一起，构建人工转录因子[13]。当加入诱导剂时，这个转录因子可以启动含GAL4识别序列的启动子按诱导剂依赖的方式进行表达。研究发现，P65比VP16激活区允许更低的接近生理状态的诱导水平，同时，由于P65是细胞来源的，比病毒来源的VP16更适合于人类基因治疗。
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3 展 望
迄今为止，已发展了多种靶向载体，希望能解决基因治疗中基因转移的安全性和有效性问题。但这些载体各自都有一定的局限性。目前，人们更倾向于将这些靶向载体的各种优点集中在一起，构建一个具有多种靶向特征的可精确调控的载体系统。Miller曾提出了一个比较理想的载体模式，它包括许多特点:如具有稳定的非免疫原性的包膜，包膜上暴露有特异的配体，还有能促进病毒颗粒与靶细胞膜融合的组份；载体DNA也应含有组织特异性启动子和其它调控元件以及有助于载体整合的同源序列等[14]。相信这些载体的成功构建定会进一步推动基因治疗的研究和应用。
参 考 文 献
1，Miller N, Vile RG， Hart IR. Effects of modulators of tyrosinase activity on expression of mIL-2 cDNA driven by the tyrosinase promoter. Melanoma Res， 1995, 5: 75
, http://www.100md.com
2，Ikeda E, Achen MG, Breier G, et al. Hypoxia-induced transcriptional activation and increased mRNA stability of vascular endothelial growth factor in C6 glioma cells. J Biol Chem， 1995, 270: 19761
3，Arnet UA, Mcmillan A, Dinerman JL, et al. Regulation of endothelial nitric-oxide synthase during hypoxia. J Biol Chem， 1996, 271: 15069
4，Varley AW, Coulthard MG, Meidell RS, et al. Inflammation-induced recombinant protein expression in vivo using promoters from acute-phase protein genes. Proc Natl Acad Sci USA， 1995, 92: 5346
, 百拇医药
5，Hallahan DE, Mauceri HJ, Seung LP, et al. Spatial and temporal control of gene therapy using ionising radiation. Nature Med， 1995, 1: 786
6，Baim SB, Labow MA, Levine AJ, et al. A chimeric mammalian transactivator based on the lac repressor that is regulated by temperature and isopropyl b-D-thiogal atopyranoside. Proc Natl Acad Sci USA， 1991, 88: 5072
7，Ward GA, Stover CK, Moss B, et al. Stringentchemical and thermal regulation of recombinant gene expression by vaccinia virus in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA， 1995, 92: 6773
, 百拇医药
8，Deuschle U, Meyer WKH, Thiesen HJ. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol， 1995, 15: 1907
9，Gossen M, Freundlieb S, Bender G, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science， 1995, 268: 1766
10，Hu SX, Ji W, Zhou Y, et al. Development of an adenovirus vectors with tetracycline-regulatable human tumor necrosis factor alpha gene expression. Cancer Res， 1997, 57(16): 3339
, 百拇医药
11，Guo H, Kohlhaw GB. Regulation of transcription in mammalian cells by yeast Leu3p and externally supplied inducer. FEBS Lett， 1996, 390: 191
12，No D, Yao TP, Evans RM. Ecdysone-inducible expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA， 1996, 93: 3346
13，Whelan J， Miller N. Generation of estrogen receptor mutants with altered ligand specificity for use in establishing a regulatable gene expression system. J Steroid Biochem Mol Biol， 1996, 58: 3
14，Miller N, Vile RG. Targeted vectors for gene therapy. FASEB J， 1995, 9: 190
(1999-01-04收稿； 1999-03-06修回), http://www.100md.com
单位：贺平 汤钊猷(上海医科大学中山医院肝癌研究所 上海 200032)
关键词：基因治疗；靶向诱导载体
中国肿瘤生物治疗杂志000121
摘 要 针对基因治疗安全性，国内外研究的重点之一是寻找理想的靶向表达载体。除了构建靶向转导载体和靶向转录载体外，还有利用可诱导的启动子或人工合成的转录因子，构建靶向诱导系统，以诱导目的基因按一定的时相表达。本文综述有关基因治疗靶向诱导载体的研究进展。
《中国图书资料分类法》分类号 Q782
靶向转录载体中所用的组织特异的启动子常导致目的基因在特定靶组织中呈基础性表达，表达水平不高。靶向诱导载体常用组织特异性的可诱导的启动子，通过诱导物的作用以调控目的基因按一定的时相表达。通过外加无毒的诱导剂来提高外源基因的表达。
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1 利用细胞或病毒启动子构建靶向诱导载体
有些细胞启动子，如糖皮质激素和重金属反应启动子及细胞色素P450A1启动子，能够被有效地诱导，但它们缺乏组织特异性。有些启动子兼具组织特异性和可诱导性两个特点，如酪氨酸酶启动子的活性限制在黑素细胞系中，这个启动子含有cAMP反应元件(CRE)，能对cAMP上调物起反应。研究发现，氨茶碱等PKA激活性能促进受酪氨酸酶启动子启动的细胞因子基因在黑素细胞系中的表达，而在成纤维细胞中不表达[1]。但在体内实验中没有出现类似效应。
一个更为复杂的方法是鉴定某些细胞启动子，它们在特殊病理状态下优先激活。利用这些启动子构建的靶向诱导载体，即使在健康和病理组织混杂的情况下，也能实现目的基因仅在适当的靶细胞中特异表达。例如，在实体瘤中典型的病理状态是缺氧。研究发现，内皮细胞生长因子(VEGF)与血管形成密切相关，在缺氧条件下，其表达增加。VEGF的缺氧诱导反应是与位于VEGF基因5′端缺氧反应转录激活元件的存在有关[2]。这类元件可用来构建靶向诱导载体，在缺氧条件下诱导表达目的基因以阻断肿瘤的血管形成。内皮细胞一氧化氮合成酶启动子含有相似的缺氧反应元件，在缺氧时，能调控转录[3]。
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这种经病理状态诱导调控目的基因表达的策略，不仅用于肿瘤，也可用于其它疾病的治疗。炎症刺激诱导鼠补体因子3(CF3)和血清淀粉样蛋白3(SA3)的表达，它们各自的启动子组装到AdV载体中，在体内指导目的基因的表达时，仍保留这种可诱导性[4]。CF3启动子经脂多糖(LPS)和松油脂诱导在肝和肺组织中表达，而SA3启动子活性仅在肝脏起作用，且更易受LPS诱导。因此，这些启动子似乎都表现出组织特异性和病理依赖的转录活性。这类转录控制元件的使用比较安全，因为一旦病理状态消失，诱导因素也就消失，目的基因的表达也将停止。
有研究证明，这种可诱导表达的靶向调控载体可用于基因治疗。如用放射线照射诱导早期生长反应基因-1(EGR-1) 启动子表达肿瘤坏死因子-α[5]。这里诱导剂本身就有杀肿瘤细胞的作用，这种杀瘤作用可通过诱导目的基因的表达进一步加强。EGR启动子经腺病毒介导转入实验性肿瘤中，它仍有放射线诱导活性，而且经放射线处理后，导致肿瘤的进一步消除而不增加毒性作用。由于放射线照射不仅作为一种治疗剂，同时也作为一种诱导剂暂时性和区域性激活外源抗肿瘤基因的表达，因此，这种方法可能对肿瘤基因治疗有重要价值。
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2 利用人工合成的诱导物/启动子系统构建靶向诱导载体
上述根据可诱导的细胞启动子来构建靶向诱导载体具有一定的缺陷。因为诱导物的效应很复杂，细胞内源性启动子和载体所用的启动子都对诱导物起反应，而且会有内源激活物的干扰。更好的调控系统能通过应用正常的惰性化合物对靶组织中的目的基因表达进行诱导调控。
2.1 原核转录控制系统的应用
2.1.1 乳糖操纵子(Lac操纵子),经典的原核转录控制系统是大肠杆菌Lac操纵子。LacZ的转录受阻遏蛋白负调控，阻遏蛋白与LacZ启动子中特异的操纵子序列结合，阻遏LacZ基因的转录。正常情况下，阻遏蛋白呈基础表达，因此，LacZ基因不表达。在β-半乳糖苷酶底物或其类似物IPTG存在下，阻遏蛋白与这些诱导剂结合而失活，LacZ基因开始转录。Baim发现将HSV的VP16蛋白插入到Lac阻遏蛋白中，可使后者转变为Lac的转录激活物[6]，因为VP16蛋白具有转录激活的功能域。因此，这个嵌合蛋白能与Lac操纵子序列结合而诱导转录，而且VP16的插入还使这个嵌合蛋白具有温度调控活性，它在32℃时有DNA结合活性而在39.5℃失去此活性。
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Ward将T7噬菌体RNA聚合酶基因置于Lac操纵子的启动子控制之下，将外源目的基因置于含T7 RNA聚合酶识别位点的启动子控制之下，再将这二个转录单位以相反的方向装入疫苗病毒(vaccinia virus)中，与病毒的转录相关联，阻遏蛋白抑制T7RNA聚合酶的表达，进而抑制外源目的基因的转录，在诱导剂存在下(如加IPTG或对温度敏感的Lac阻遏蛋白突变体升高温度)，阻遏蛋白失活，不能结合到Lac操纵子上，T7RNA聚合酶得以转录，随之引起被调控基因的转录[7]。很明显，这个系统比目的基因单独置于Lac操纵子控制下具有更低的基础转录活性和更高的可诱导性。但这个系统的不足之处是达到最大转录活性所需的IPTG水平较高，可能有毒性作用。而且温度敏感系统对人类的基因治疗也不适合。
2.1.2 四环素操纵子(tet操纵子)中抗性基因的转录也是通过tet阻遏蛋白结合到操纵子上而起负性调控作用，四环素可与阻遏蛋白结合而诱导tet操纵子开始转录。将tet阻遏蛋白与VP16激活区融合也可逆转阻遏蛋白的作用，形成受四环素抑制的嵌合体反式转录激活因子(tTA)，它可以激活人工合成的含tet操纵子DNA序列的启动子的转录。当四环素浓度达到50 ng/ml时，这个启动子的转录受到抑制，当四环素浓度降低时，这个启动子的转录活性可被成比例地放大，再加入四环素后，又可抑制其转录。
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tet阻遏系统已经与组织特异的转录控制元件一起联合使用。Deuschle将tTA与人锌指蛋白kox1中的KREB阻遏结构域融合在一起，一旦与tet操纵子序列结合，这个蛋白能阻断下游远至3 kb的基因的转录[8]。
Gossen于1995年发现一种突变的tet阻遏蛋白(rtTA)，它在四环素存在时，能与DNA结合[9]。因此，利用这个突变蛋白可将tet阻遏系统转变为诱导系统，这个突变蛋白与其野生型相比有4个氨基酸残基发生突变，它诱导的启动子的转录在24 h内即可达到最大值，但它需要相对高浓度的四环素(1 μg/ml)。这个rtTA系统在需要快速诱导基因表达的情况下，有较大的应用价值，但它诱导基因表达的速率受机体清除四环素速率的影响。
将tet阻遏系统装入重组病毒载体中，仍能发挥调控作用。Hu等将tet阻遏系统插入到腺病毒载体中，构建AdVtTA重组载体，以调控TNF-β的表达[10]。将这个重组载体转入人肿瘤细胞和T淋巴细胞中，不加四环素时，24 hTNF的表达量达5～10 μg/106细胞；当加入四环素时(浓度为0.1 mg/ml)，TNF的表达彻底抑制。利用这种方法，可限制TNF严重的毒副反应。
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尽管四环素调控系统的设计方案多种多样，但它不可能适用于所有的细胞。同时，tTA系统的一个不足之处是难以达到高水平表达的tTA，这可能是由于VP16结构域的毒性淬灭效应；再者，病毒来源的VP16激活域可能对人有免疫原性。因此，还需不断地发展比较完善的可应用于人类的基因靶向诱导载体系统。
2.2 真核转录控制系统的应用
理论上说，哺乳动物细胞中所没有的任一调控元件都可用来构建靶向诱导载体。如酿酒酵母DNA结合蛋白GAL4和LEU3等。在α-异丙基苹果酸酯存在下，LEU3可诱导某些启动子在哺乳动物细胞中的转录，这些启动子通常含哺乳动物细胞中不存在的转录调控元件。应用昆虫蜕皮素类似物也可在哺乳动物细胞中对外源含蜕皮素反应元件的启动子进行有效地调控[11]。这个系统可能比tet阻遏系统有更强的可诱导性和更低的基础活性。No等进一步改进了这个系统，如用VP16蛋白置换蜕皮素受体的氨基末端；用哺乳动物类固醇受体的一个单体作为蜕皮素异源二聚体的一个组份；插入SP1转录因子识别序列以使蜕皮素依赖的启动子有更强的反应性。然而，这个系统相对比较复杂，因为它需要表达2个不同的受体，在蜕皮素类固醇的存在下，形成异源二聚体以识别蜕皮素反应元件[12]。
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哺乳动物核激素受体通过配体识别而激活并随之结合到受激素调控的基因启动子的特异元件上，促进这些基因的转录。对这些受体进行某种处理后，可以利用它们构建一个适于外源基因调控的靶向诱导载体。例如，将核受体的DNA结合区用识别非哺乳动物转录调控模式的结构域替代，以避免对转录的非特异影响；或者改变这些受体的配体结合区特异性，以识别药用化合物，而不识别内源性的类固醇，以避免内源性类固醇的非特异激活。雌激素受体可用来构建这种靶向诱导载体系统。将VP16的激活域与GAL4的DNA结合域融合到雌激素受体的配体结合区(LBD)，构建一个嵌合转录因子。当有雌二醇时，它与受体结合，使GAL4与其识别序列结合，并进而促进VP16激活启动子的转录(一般认为在哺乳动物基因组中不存在GAL4结合位点)，经短暂转染细胞后，雌二醇可诱导这类启动子的转录效率提高100倍，但雌二醇的用量也较大(浓度达1 μm)。
Whelan和Miller对这一系统进研了改进。利用低保真性的PCR技术对雌激素受体的LBD区进行随机突变，筛选一种突变体使其仅识别非毒性的药用化合物而不识别雌二醇，将这个突变的LBD与人转录因子NF-kB的P65激活区和酵母GAL4蛋白融合在一起，构建人工转录因子[13]。当加入诱导剂时，这个转录因子可以启动含GAL4识别序列的启动子按诱导剂依赖的方式进行表达。研究发现，P65比VP16激活区允许更低的接近生理状态的诱导水平，同时，由于P65是细胞来源的，比病毒来源的VP16更适合于人类基因治疗。
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3 展 望
迄今为止，已发展了多种靶向载体，希望能解决基因治疗中基因转移的安全性和有效性问题。但这些载体各自都有一定的局限性。目前，人们更倾向于将这些靶向载体的各种优点集中在一起，构建一个具有多种靶向特征的可精确调控的载体系统。Miller曾提出了一个比较理想的载体模式，它包括许多特点:如具有稳定的非免疫原性的包膜，包膜上暴露有特异的配体，还有能促进病毒颗粒与靶细胞膜融合的组份；载体DNA也应含有组织特异性启动子和其它调控元件以及有助于载体整合的同源序列等[14]。相信这些载体的成功构建定会进一步推动基因治疗的研究和应用。
参 考 文 献
1，Miller N, Vile RG， Hart IR. Effects of modulators of tyrosinase activity on expression of mIL-2 cDNA driven by the tyrosinase promoter. Melanoma Res， 1995, 5: 75
, http://www.100md.com
2，Ikeda E, Achen MG, Breier G, et al. Hypoxia-induced transcriptional activation and increased mRNA stability of vascular endothelial growth factor in C6 glioma cells. J Biol Chem， 1995, 270: 19761
3，Arnet UA, Mcmillan A, Dinerman JL, et al. Regulation of endothelial nitric-oxide synthase during hypoxia. J Biol Chem， 1996, 271: 15069
4，Varley AW, Coulthard MG, Meidell RS, et al. Inflammation-induced recombinant protein expression in vivo using promoters from acute-phase protein genes. Proc Natl Acad Sci USA， 1995, 92: 5346
, 百拇医药
5，Hallahan DE, Mauceri HJ, Seung LP, et al. Spatial and temporal control of gene therapy using ionising radiation. Nature Med， 1995, 1: 786
6，Baim SB, Labow MA, Levine AJ, et al. A chimeric mammalian transactivator based on the lac repressor that is regulated by temperature and isopropyl b-D-thiogal atopyranoside. Proc Natl Acad Sci USA， 1991, 88: 5072
7，Ward GA, Stover CK, Moss B, et al. Stringentchemical and thermal regulation of recombinant gene expression by vaccinia virus in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA， 1995, 92: 6773
, 百拇医药
8，Deuschle U, Meyer WKH, Thiesen HJ. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol， 1995, 15: 1907
9，Gossen M, Freundlieb S, Bender G, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science， 1995, 268: 1766
10，Hu SX, Ji W, Zhou Y, et al. Development of an adenovirus vectors with tetracycline-regulatable human tumor necrosis factor alpha gene expression. Cancer Res， 1997, 57(16): 3339
, 百拇医药
11，Guo H, Kohlhaw GB. Regulation of transcription in mammalian cells by yeast Leu3p and externally supplied inducer. FEBS Lett， 1996, 390: 191
12，No D, Yao TP, Evans RM. Ecdysone-inducible expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA， 1996, 93: 3346
13，Whelan J， Miller N. Generation of estrogen receptor mutants with altered ligand specificity for use in establishing a regulatable gene expression system. J Steroid Biochem Mol Biol， 1996, 58: 3
14，Miller N, Vile RG. Targeted vectors for gene therapy. FASEB J， 1995, 9: 190
(1999-01-04收稿； 1999-03-06修回), http://www.100md.com