支气管肺泡冲洗液中p53基因突变检测的研究
作者：郑雪梅 倪继军
单位：郑雪梅 倪继军(龙岩市第一医院 福建 364000)
关键词：BALF；p53；PCR-RFLP法；肺癌诊断
中国肿瘤生物治疗杂志000126 《中国图书资料分类法》分类号 R734.2; R392.3
p53基因被认为是和多种恶性肿瘤相关的基因，其突变型被认为是癌基因。p53基因249位密码子突变最常见，该突变广泛存在于肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌中。在肺癌的诊断中，纤支镜活检有时钳夹不到组织或组织太小无法确诊。为了提高肺癌的诊断率，我们用PCR-RFLP法对320例支气管肺泡冲洗液(BALF)中p53基因突变进行研究，探讨其对肺癌诊断的临床应用价值。
标本为我院1996年12月～1999年6月，纤支镜室送检320例BALF，送检液去上层液后取1 ml放入Eppendorf管，加等体积1N NaOH消化10 min，12 000 r/min 10 min，去上层液，沉淀加蒸馏水1 ml，12 000 r/min 5 min，去上清，再加蒸馏水1 ml，重复1次，去上清液，沉淀加50 μl裂解液，沸水煮10 min，12 000 r/min 1 min，取上清液待检。另外，对肺活检组织、细胞刷涂片或肺手术标本病理切片进行肺癌与肺良性疾病的分组，并与BALF阳性组及阴性组进行比较。
采用上海中亚生物基因研究所的p53基因检测试剂盒对待测标本进行特异性体外扩增，并配合限制性内切酶解分析(PCR-RFLP法)对249位密码突变进行检测。
①按94℃ 50 s, 55℃ 40 s, 72℃ 90 s；循环35个周期扩增，最后72℃保温4 min。取扩增产物15 μl加内切酶10 U混合后置37℃ 3 h水浴。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳：限制性内切酶解分析后，取15 μl加2 μl电泳加样液置12%聚丙烯酰胺电泳2 h左右，经溴乙锭染色15 min。置紫外透射仪上观察结果,如出现50 bp和80 bp条带为正常，如出现130 bp为p53基因突变。
结果显示，320例BALF标本的患者年龄范围21～88岁,平均54.5岁，男∶女为4.5∶1(262/58例)；均未接受放、化疗。肺恶性病变(肺癌)117例，肺良性病变203例。其中,99例肺癌检测结果为阳性，18例为阴性；在肺良性病变中187例为阴性，16例为阳性,具显著性差异(P<0.001)。结果表明，肺癌组p53基因突变显著高于肺良性病变组,因此,用PCR-RFLP法检测BALF中p53基因突变对肺癌诊断可能发挥重要作用,具有较高临床应用价值。
本研究中，肺癌组呈阴性结果18例：鳞癌6例、腺癌5例、转移癌4例、小细胞癌3例；出现阴性结果可能是BALF中癌细胞太少，因为BALF实质上是支气管肺泡的被复上皮(包括脱落的癌细胞)与灌入冲洗的无菌生理盐水的混合液。P53蛋白表达可能是支气管粘膜上皮癌变的早期改变，有文献报告p53基因在肺癌中表达率为46%～48%，可能它们本身就不表达，而在肺良性病变中有16例为阳性，多数是咯血或血性成份的BALF，这有待进一步研究。
(1999-03-05收稿； 1999-05-11修回), http://www.100md.com
单位：郑雪梅 倪继军(龙岩市第一医院 福建 364000)
关键词：BALF；p53；PCR-RFLP法；肺癌诊断
中国肿瘤生物治疗杂志000126 《中国图书资料分类法》分类号 R734.2; R392.3
p53基因被认为是和多种恶性肿瘤相关的基因，其突变型被认为是癌基因。p53基因249位密码子突变最常见，该突变广泛存在于肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌中。在肺癌的诊断中，纤支镜活检有时钳夹不到组织或组织太小无法确诊。为了提高肺癌的诊断率，我们用PCR-RFLP法对320例支气管肺泡冲洗液(BALF)中p53基因突变进行研究，探讨其对肺癌诊断的临床应用价值。
标本为我院1996年12月～1999年6月，纤支镜室送检320例BALF，送检液去上层液后取1 ml放入Eppendorf管，加等体积1N NaOH消化10 min，12 000 r/min 10 min，去上层液，沉淀加蒸馏水1 ml，12 000 r/min 5 min，去上清，再加蒸馏水1 ml，重复1次，去上清液，沉淀加50 μl裂解液，沸水煮10 min，12 000 r/min 1 min，取上清液待检。另外，对肺活检组织、细胞刷涂片或肺手术标本病理切片进行肺癌与肺良性疾病的分组，并与BALF阳性组及阴性组进行比较。
采用上海中亚生物基因研究所的p53基因检测试剂盒对待测标本进行特异性体外扩增，并配合限制性内切酶解分析(PCR-RFLP法)对249位密码突变进行检测。
①按94℃ 50 s, 55℃ 40 s, 72℃ 90 s；循环35个周期扩增，最后72℃保温4 min。取扩增产物15 μl加内切酶10 U混合后置37℃ 3 h水浴。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳：限制性内切酶解分析后，取15 μl加2 μl电泳加样液置12%聚丙烯酰胺电泳2 h左右，经溴乙锭染色15 min。置紫外透射仪上观察结果,如出现50 bp和80 bp条带为正常，如出现130 bp为p53基因突变。
结果显示，320例BALF标本的患者年龄范围21～88岁,平均54.5岁，男∶女为4.5∶1(262/58例)；均未接受放、化疗。肺恶性病变(肺癌)117例，肺良性病变203例。其中,99例肺癌检测结果为阳性，18例为阴性；在肺良性病变中187例为阴性，16例为阳性,具显著性差异(P<0.001)。结果表明，肺癌组p53基因突变显著高于肺良性病变组,因此,用PCR-RFLP法检测BALF中p53基因突变对肺癌诊断可能发挥重要作用,具有较高临床应用价值。
本研究中，肺癌组呈阴性结果18例：鳞癌6例、腺癌5例、转移癌4例、小细胞癌3例；出现阴性结果可能是BALF中癌细胞太少，因为BALF实质上是支气管肺泡的被复上皮(包括脱落的癌细胞)与灌入冲洗的无菌生理盐水的混合液。P53蛋白表达可能是支气管粘膜上皮癌变的早期改变，有文献报告p53基因在肺癌中表达率为46%～48%，可能它们本身就不表达，而在肺良性病变中有16例为阳性，多数是咯血或血性成份的BALF，这有待进一步研究。
(1999-03-05收稿； 1999-05-11修回), http://www.100md.com