增殖病毒对肿瘤的治疗作用
作者：钱其军
单位：钱其军(第二军医大学东方肝胆外科医院 上海 200438)
关键词：肿瘤；病毒；基因治疗
中国肿瘤生物治疗杂志000101 《中国图书资料分类法》分类号 R730.5； R373
近百年以来偶有肿瘤病人在某种病毒感染后会出现肿瘤暂时性消退的现象，引起医学家的关注，开始寻找能杀灭肿瘤细胞的病毒。至1970年，人们已发现了38种在动物或人体体内具有抗肿瘤活性的病毒，并开始在晚期肿瘤病人中进行临床试验，但当时只能应用病毒的粗提物，其疗效并不显著，治疗后病人平均生存期很短。
近三十年来，由于病毒学、分子生物学及肿瘤学的飞速发展，人们己完成了多个病毒全部基因测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对病毒基因进行结构改造，使改造后的病毒能在肿瘤细胞中特异性增殖，而在正常细胞内不增殖，这样，病毒一旦感染肿瘤细胞即可在细胞内增殖并裂解肿瘤细胞，细胞裂解后释放的病毒颗粒再次感染其它肿瘤细胞，直到将全部肿瘤细胞杀灭，由于该病毒不能在正常细胞内增殖，故对正常细胞损害不大，这种病毒被称为肿瘤特异性增殖病毒。与此同时，对各种病毒的纯化及浓集方案也日趋成熟，从而能够大量制备高纯度、高效价的病毒用于肿瘤治疗。最近几年多种增殖病毒已进入临床试验，为肿瘤的研究开辟了一个新的研究领域。
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1 根据病毒在肿瘤内特异性增殖机制分为三大类
1.1 选择性进入细胞
某些病毒具有组织亲和性(例如逆转录病毒，腺病毒) ，改变它们表面的结合蛋白可使其与某些特定的肿瘤组织结合，从而使病毒只能感染特定的肿瘤组织，但在这方面研究未取得重大进展。
1.2 选择性转录病毒增殖必需基因
用肿瘤组织特异性启动子或增强子插入病毒增殖必需基因的上游，使其表达限制于肿瘤细胞，通过这一方案有望达到病毒只能在肿瘤细胞内特异性增殖的目标。如Johns Hopkins大学Henderson等应用前列腺素特异性抗原启动子控制腺病毒增殖必需基因E1A，从而使腺病毒只能在分泌前列腺素特异性抗原细胞中增殖并特异性杀灭前列腺癌细胞，己进入Ⅰ期临床试验。为进一步增强其特异性，减少其全身毒性作用，最近该研究组应用了对前列腺细胞相对特异性的人腺血管舒缓素启动子与前列腺素特异性抗原启动子,分别控制腺病毒增殖必需基因E1B及E1A区，该病毒杀灭前列腺癌细胞的能力比杀灭正常细胞的能力高10 000倍。Georgetown大学Martuza等应用数十种肿瘤组织特异性启动子分别控制单纯疱疹病毒增殖必需基因ICP4，使单纯疱疹病毒只能在相关肿瘤中增殖并杀灭肿瘤细胞。我们科研组利用EB病毒与多种肿瘤如鼻咽癌、淋巴瘤及胃癌等密切相关的特性，应用EB病毒潜伏感染细胞特异性激活的增强子及启动子来控制腺病毒增殖必需基因E1A，E1B或单纯疱疹病毒的ICP4等，使上述腺病毒或单纯疱疹病毒只能在EB病毒潜伏感染的细胞内复制及增殖，从而特异性杀灭鼻咽癌、淋巴瘤及胃癌细胞，达到应用病毒治疗病毒相关肿瘤的目的。
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1.3 将病毒在正常细胞中复制所必需而在肿瘤细胞中非必需的病毒基因选择性地缺失
正常细胞与肿瘤存在着某些基因表达上的差异，某些病毒在正常细胞内增殖所必需的基因，在肿瘤细胞内并不需要，因此，去除这些基因有望使病毒在肿瘤细胞内特异性复制及增殖，这方面突出的研究成果来自对腺病毒及单纯疱疹病毒的研究。在腺病毒方面，P53是宿主细胞抗病毒的主要蛋白，正常细胞受腺病毒感染后即激活P53，导致细胞凋亡，使病毒复制终止。然而,在极大多数情况下，正常细胞感染腺病毒后并没有立即出现凋亡，主要原因是野生型腺病毒尚存在着能抑制P53激活的蛋白,即E1B 55 kD蛋白，因此野生型腺病毒能在正常细胞内增殖。当腺病毒缺失E1B 55 kD蛋白时，正常细胞中的P53即被激活，使细胞很快凋亡，腺病毒不能再增殖，从而使感染终止，而在P53突变或失活的肿瘤细胞中，病毒感染后，P53不能被激活，因此缺乏E1B的腺病毒，仍能复制及增殖，使病毒在肿瘤细胞内大量复制，最终导致肿瘤细胞溶解死亡，并释放新的病毒感染其它肿瘤细胞。美国ONYX生化制药公司McCormick F领导的研究组将E1B区55 kD缺失的腺病毒命名为ONYX-015,其对5株P53正常的细胞株无明显的杀伤作用，而对P53功能异常的肿瘤细胞株具有很强的杀伤作用。同时发现ONYX-015 与化疗药物5-氟脲嘧啶(5-Fu)和顺铂具有明显的协同作用。尽管最近有数个研究组的结果认为ONYX-015的作用机制与P53突变无关，但ONYX-015治疗肿瘤的Ⅱ期临床结果令人鼓舞，对常规治疗无效的头颈部肿瘤病人，应用该病毒联合常规化疗可使63%病人肿瘤缩小一半以上，27%病人肿瘤完全消退，明显优于单用化疗组，1999年9月已开始进行Ⅲ期临床试验。另一个科研组Georgetown大学Martuza等首先将单纯疱疹病毒复制所必需的基因核糖核苷酸还原酶或胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(HSV-tk)失活，这样病毒只能在含有上述酶丰富的、分裂迅速的癌细胞内增殖，而在正常中枢神经细胞内则不能增殖，因此，该病毒能有效溶解胶质瘤细胞，而对正常细胞没有作用。为确保安全，他们又将导致脑炎的病毒基因剔除，称为G207，细胞培养和动物实验表明，这种单纯疱疹病毒G207几乎对所有实质性肿瘤均有效。目前该病毒正在进行Ⅰ期临床试验。
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2 其它几种特异性杀伤肿瘤的病毒
呼吸道肠道过滤性病毒(reovirus)：对人类的感染仅局限于呼吸道和胃肠道，通常无症状。该病毒感染后其早期病毒基因转录可激活双链RNA激活蛋白激酶(PKR)，而该激酶可抑制其它病毒基因的转录，从而使病毒不能有效复制，而当细胞中Ras处于激活状态则可抑制该激酶，从而使该病毒复制、增殖。Ras基因是一个癌基因，当它被不正常激活时，即可能发生癌变。加拿大Calgary大学Lee等应用该病毒治疗Ras高表达的人胶质瘤SCID小鼠模型，可使65%～80%小鼠肿瘤明显缩小或消退。在体外试验中，对Ras高表达的其它肿瘤如乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌具有相同的疗效。近期将进行临床试验。
新城疫病毒(NDV)：是一种鸡副黏液病毒，与一些人畜共患病有关。1955年首次发现它能在肿瘤细胞中增殖，并裂解肿瘤细胞。NDV的这种裂解细胞作用已在多种人类肿瘤细胞株的体内及体外实验中得到验证，但对数株人正常成纤维细胞则无毒性作用，其临床疗效尚无法判断。
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自主微小病毒：是一种无外壳单链DNA病毒，其基因组较小(约5 kb)，结构相对简单，这种病毒在转化的细胞(如癌变的细胞)中增殖力明显增强，其机制尚不清楚。这种病毒早在10年前己进行临床试验，但该病毒杀伤肿瘤细胞能力比较弱。德国癌症研究中心Jean R等用几年时间对病毒加以改变，如应用该病毒携带细胞因子基因以进一步提高疗效，最近的细胞培养和动物实验表明，病毒的抗肿瘤能力大大增强。
3 有关增殖病毒研究值得关注的几个方向
增殖病毒携带目的基因：目前己有多个研究所开始应用肿瘤特异性增殖病毒携带一些目的基因如HSV-tk、白细胞介素-2、白细胞介素-5及细胞色素P450等，可明显增强病毒的抗癌能力。我们科研组应用ONYX-015类似物携带大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD) 基因可明显提高病毒对肝癌细胞的杀伤。
减少病毒的免疫原性：由于机体抗病毒免疫(包括中和抗体及激活T细胞)决定增殖病毒疗效和毒性，为使病毒再次感染时不被体内抗体中和，有以下几种方法：一种是更换不同血清型的腺病毒载体；另一种应用IL-12和干扰素γ抑制中和抗体产生。
, 百拇医药
寻找肿瘤特异性增强子及启动子控制病毒增殖必需基因，产生新型肿瘤特异性增殖病毒。
增殖病毒治疗肿瘤在临床上己取得了初步成功，但大量经验表明，许多治疗肿瘤的新方法在研究早期均有明确疗效，最终往往令人失望。虽然可以肯定增殖病毒可使肿瘤萎缩甚至消失，但其最终对肿瘤的疗效的判断还需要更长时间。另外，病毒治疗的长期副作用尚不得而知，这个方面应需谨慎对待，因此在选择研究增殖性病毒时，该病毒应具有以下特征：必须能在肿瘤细胞内选择性增殖, 并导致被感染细胞的裂解；病毒所导致的人类疾病必须是轻微的并己熟知的，如果有致病性，必须有有效的抗病毒治疗方法；该病毒增殖和致病的基因均己相当清楚；具有遗传稳定性，极少可能回复为野生型病毒；不整合到人的基因组；容易产生高滴度的病毒，易于生产及纯化；体内能感染多种组织及细胞；有一个理想的动物模型来进行临床前毒性研究。
(1999-11-08收稿； 1999-12-20修回), 百拇医药
单位：钱其军(第二军医大学东方肝胆外科医院 上海 200438)
关键词：肿瘤；病毒；基因治疗
中国肿瘤生物治疗杂志000101 《中国图书资料分类法》分类号 R730.5； R373
近百年以来偶有肿瘤病人在某种病毒感染后会出现肿瘤暂时性消退的现象，引起医学家的关注，开始寻找能杀灭肿瘤细胞的病毒。至1970年，人们已发现了38种在动物或人体体内具有抗肿瘤活性的病毒，并开始在晚期肿瘤病人中进行临床试验，但当时只能应用病毒的粗提物，其疗效并不显著，治疗后病人平均生存期很短。
近三十年来，由于病毒学、分子生物学及肿瘤学的飞速发展，人们己完成了多个病毒全部基因测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对病毒基因进行结构改造，使改造后的病毒能在肿瘤细胞中特异性增殖，而在正常细胞内不增殖，这样，病毒一旦感染肿瘤细胞即可在细胞内增殖并裂解肿瘤细胞，细胞裂解后释放的病毒颗粒再次感染其它肿瘤细胞，直到将全部肿瘤细胞杀灭，由于该病毒不能在正常细胞内增殖，故对正常细胞损害不大，这种病毒被称为肿瘤特异性增殖病毒。与此同时，对各种病毒的纯化及浓集方案也日趋成熟，从而能够大量制备高纯度、高效价的病毒用于肿瘤治疗。最近几年多种增殖病毒已进入临床试验，为肿瘤的研究开辟了一个新的研究领域。
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1 根据病毒在肿瘤内特异性增殖机制分为三大类
1.1 选择性进入细胞
某些病毒具有组织亲和性(例如逆转录病毒，腺病毒) ，改变它们表面的结合蛋白可使其与某些特定的肿瘤组织结合，从而使病毒只能感染特定的肿瘤组织，但在这方面研究未取得重大进展。
1.2 选择性转录病毒增殖必需基因
用肿瘤组织特异性启动子或增强子插入病毒增殖必需基因的上游，使其表达限制于肿瘤细胞，通过这一方案有望达到病毒只能在肿瘤细胞内特异性增殖的目标。如Johns Hopkins大学Henderson等应用前列腺素特异性抗原启动子控制腺病毒增殖必需基因E1A，从而使腺病毒只能在分泌前列腺素特异性抗原细胞中增殖并特异性杀灭前列腺癌细胞，己进入Ⅰ期临床试验。为进一步增强其特异性，减少其全身毒性作用，最近该研究组应用了对前列腺细胞相对特异性的人腺血管舒缓素启动子与前列腺素特异性抗原启动子,分别控制腺病毒增殖必需基因E1B及E1A区，该病毒杀灭前列腺癌细胞的能力比杀灭正常细胞的能力高10 000倍。Georgetown大学Martuza等应用数十种肿瘤组织特异性启动子分别控制单纯疱疹病毒增殖必需基因ICP4，使单纯疱疹病毒只能在相关肿瘤中增殖并杀灭肿瘤细胞。我们科研组利用EB病毒与多种肿瘤如鼻咽癌、淋巴瘤及胃癌等密切相关的特性，应用EB病毒潜伏感染细胞特异性激活的增强子及启动子来控制腺病毒增殖必需基因E1A，E1B或单纯疱疹病毒的ICP4等，使上述腺病毒或单纯疱疹病毒只能在EB病毒潜伏感染的细胞内复制及增殖，从而特异性杀灭鼻咽癌、淋巴瘤及胃癌细胞，达到应用病毒治疗病毒相关肿瘤的目的。
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1.3 将病毒在正常细胞中复制所必需而在肿瘤细胞中非必需的病毒基因选择性地缺失
正常细胞与肿瘤存在着某些基因表达上的差异，某些病毒在正常细胞内增殖所必需的基因，在肿瘤细胞内并不需要，因此，去除这些基因有望使病毒在肿瘤细胞内特异性复制及增殖，这方面突出的研究成果来自对腺病毒及单纯疱疹病毒的研究。在腺病毒方面，P53是宿主细胞抗病毒的主要蛋白，正常细胞受腺病毒感染后即激活P53，导致细胞凋亡，使病毒复制终止。然而,在极大多数情况下，正常细胞感染腺病毒后并没有立即出现凋亡，主要原因是野生型腺病毒尚存在着能抑制P53激活的蛋白,即E1B 55 kD蛋白，因此野生型腺病毒能在正常细胞内增殖。当腺病毒缺失E1B 55 kD蛋白时，正常细胞中的P53即被激活，使细胞很快凋亡，腺病毒不能再增殖，从而使感染终止，而在P53突变或失活的肿瘤细胞中，病毒感染后，P53不能被激活，因此缺乏E1B的腺病毒，仍能复制及增殖，使病毒在肿瘤细胞内大量复制，最终导致肿瘤细胞溶解死亡，并释放新的病毒感染其它肿瘤细胞。美国ONYX生化制药公司McCormick F领导的研究组将E1B区55 kD缺失的腺病毒命名为ONYX-015,其对5株P53正常的细胞株无明显的杀伤作用，而对P53功能异常的肿瘤细胞株具有很强的杀伤作用。同时发现ONYX-015 与化疗药物5-氟脲嘧啶(5-Fu)和顺铂具有明显的协同作用。尽管最近有数个研究组的结果认为ONYX-015的作用机制与P53突变无关，但ONYX-015治疗肿瘤的Ⅱ期临床结果令人鼓舞，对常规治疗无效的头颈部肿瘤病人，应用该病毒联合常规化疗可使63%病人肿瘤缩小一半以上，27%病人肿瘤完全消退，明显优于单用化疗组，1999年9月已开始进行Ⅲ期临床试验。另一个科研组Georgetown大学Martuza等首先将单纯疱疹病毒复制所必需的基因核糖核苷酸还原酶或胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(HSV-tk)失活，这样病毒只能在含有上述酶丰富的、分裂迅速的癌细胞内增殖，而在正常中枢神经细胞内则不能增殖，因此，该病毒能有效溶解胶质瘤细胞，而对正常细胞没有作用。为确保安全，他们又将导致脑炎的病毒基因剔除，称为G207，细胞培养和动物实验表明，这种单纯疱疹病毒G207几乎对所有实质性肿瘤均有效。目前该病毒正在进行Ⅰ期临床试验。
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2 其它几种特异性杀伤肿瘤的病毒
呼吸道肠道过滤性病毒(reovirus)：对人类的感染仅局限于呼吸道和胃肠道，通常无症状。该病毒感染后其早期病毒基因转录可激活双链RNA激活蛋白激酶(PKR)，而该激酶可抑制其它病毒基因的转录，从而使病毒不能有效复制，而当细胞中Ras处于激活状态则可抑制该激酶，从而使该病毒复制、增殖。Ras基因是一个癌基因，当它被不正常激活时，即可能发生癌变。加拿大Calgary大学Lee等应用该病毒治疗Ras高表达的人胶质瘤SCID小鼠模型，可使65%～80%小鼠肿瘤明显缩小或消退。在体外试验中，对Ras高表达的其它肿瘤如乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌具有相同的疗效。近期将进行临床试验。
新城疫病毒(NDV)：是一种鸡副黏液病毒，与一些人畜共患病有关。1955年首次发现它能在肿瘤细胞中增殖，并裂解肿瘤细胞。NDV的这种裂解细胞作用已在多种人类肿瘤细胞株的体内及体外实验中得到验证，但对数株人正常成纤维细胞则无毒性作用，其临床疗效尚无法判断。
, http://www.100md.com
自主微小病毒：是一种无外壳单链DNA病毒，其基因组较小(约5 kb)，结构相对简单，这种病毒在转化的细胞(如癌变的细胞)中增殖力明显增强，其机制尚不清楚。这种病毒早在10年前己进行临床试验，但该病毒杀伤肿瘤细胞能力比较弱。德国癌症研究中心Jean R等用几年时间对病毒加以改变，如应用该病毒携带细胞因子基因以进一步提高疗效，最近的细胞培养和动物实验表明，病毒的抗肿瘤能力大大增强。
3 有关增殖病毒研究值得关注的几个方向
增殖病毒携带目的基因：目前己有多个研究所开始应用肿瘤特异性增殖病毒携带一些目的基因如HSV-tk、白细胞介素-2、白细胞介素-5及细胞色素P450等，可明显增强病毒的抗癌能力。我们科研组应用ONYX-015类似物携带大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD) 基因可明显提高病毒对肝癌细胞的杀伤。
减少病毒的免疫原性：由于机体抗病毒免疫(包括中和抗体及激活T细胞)决定增殖病毒疗效和毒性，为使病毒再次感染时不被体内抗体中和，有以下几种方法：一种是更换不同血清型的腺病毒载体；另一种应用IL-12和干扰素γ抑制中和抗体产生。
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寻找肿瘤特异性增强子及启动子控制病毒增殖必需基因，产生新型肿瘤特异性增殖病毒。
增殖病毒治疗肿瘤在临床上己取得了初步成功，但大量经验表明，许多治疗肿瘤的新方法在研究早期均有明确疗效，最终往往令人失望。虽然可以肯定增殖病毒可使肿瘤萎缩甚至消失，但其最终对肿瘤的疗效的判断还需要更长时间。另外，病毒治疗的长期副作用尚不得而知，这个方面应需谨慎对待，因此在选择研究增殖性病毒时，该病毒应具有以下特征：必须能在肿瘤细胞内选择性增殖, 并导致被感染细胞的裂解；病毒所导致的人类疾病必须是轻微的并己熟知的，如果有致病性，必须有有效的抗病毒治疗方法；该病毒增殖和致病的基因均己相当清楚；具有遗传稳定性，极少可能回复为野生型病毒；不整合到人的基因组；容易产生高滴度的病毒，易于生产及纯化；体内能感染多种组织及细胞；有一个理想的动物模型来进行临床前毒性研究。
(1999-11-08收稿； 1999-12-20修回), 百拇医药