重组人白介素2-卡介苗对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞体外杀伤活性的影响
作者：梅玉屏 曾星 黄羽 章国来
单位：梅玉屏 曾星 黄羽 章国来(广州中医药大学第二附属医院中心实验室 广州 510120)
关键词：重组白细胞介素2卡介苗；巨噬细胞；黑色素瘤细胞株；杀伤活性
中国肿瘤生物治疗杂志000110 摘 要 目的： 研究能分泌人白细胞介素2的重组卡介苗(rBCG-IL-2)对小鼠腹腔巨噬细胞体外杀伤活性功能的改变，探讨rBCG-IL-2对宿主免疫功能的影响。方法： 采用基因工程技术和电转化技术构建卡介苗，采用MTT法测定小鼠腹腔巨噬细胞体外的杀伤活性。结果： rBCG-IL-2组小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性明显大于rBCG组和对照组，且巨噬细胞的杀伤活性在一周内达到最大。结论： rBCG-IL-2能提高巨噬细胞的杀伤活性，是一种很有前景的生物制剂。
《中国图书资料分类法》分类号 R392.11
, 百拇医药
Effect of Recombinant BCG Secreting Human IL-2 on Cytotoxicity of Murine Peritoneal Macrophages
Mei Yuping， Zeng Xing， Huang Yu， Zhang Guolai
(The Key Laboratory, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510120)
Abstract Objective: To investigate the effect of recombinant BCG secreting IL-2 (rBCG-IL-2) on peritoneal macrophages of mouse and inquire into the effect of rBCG-IL-2 on immunity of host. Methods: Gene engineering technology, electricity transference and inoculation tumor cell are adopted; MTT assay is used to determine tumoricidal effect of macrophages. Results: Tumoricidal effect of macrophages of rBCG-IL-2 groups was higher than those of the control groups and BCG groups, and the tumoricidal effect of macrophages could reach a high state in a week. Conclusion: rBCG-IL-2 can raise tumoricidal effect of macrophages, improve immunity of host and is a prospect biological preparation.
, 百拇医药
Key words recombinant BCG; macrophages; melanocarcinoma cell strain; cytotoxicity
BCG治疗肿瘤和延缓肿瘤的复发取得了肯定的疗效，白细胞介素2(IL-2)由Th1细胞产生，是调节细胞介导免疫的关键因子，尤其在抗肿瘤免疫调节中起重要的作用，IL-2能有效地激活巨噬细胞(MΦ)[1]，而活化的巨噬细胞在维持机体内环境稳定，抗感染及抗肿瘤方面均起重要作用[2]。当IL-2和BCG同时起作用时，能显著增强宿主的免疫细胞活性[3]。本研究采用我们构建的一种能表达分泌人白介素2的重组BCG(recombinant BCG expressing and secreting human IL-2，rBCG-IL-2)和不能分泌人白介素2的重组BCG即未携带人白介素2外源基因的重组BCG(recombinant BCG without foreign gene，rBCG)对小鼠黑色素瘤动物模型进行实验研究，观察rBCG-IL-2，rBCG在接种肿瘤前后巨噬细胞体外杀伤活性的改变，进一步探讨rBCG-IL-2对荷瘤小鼠免疫功能的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料
DMEM培养液，pH7.3，脂多糖LPS浓度为100 μg/ml，四甲基偶氮唑蓝MTT浓度为5 mg/ml，二甲基亚砜DMSO用原液，Middlebrook 7H9, ADC均购自Promega公司和Sigma公司。磷酸缓冲液PBS，浓度为0.1 mol/L，pH6.4，BCG为成都和上海生物制品所产品。小鼠黑色素瘤细胞B16购自武汉大学ATCC中心。
1.2 BCG感受态细胞的制备及转化
BCG菌种接种到Middlebrook 7H9，补加ADC(葡萄糖、牛血清白蛋白及盐的混合液)和20%Tween 80培养基中，37℃静止培养，待BCG培养至对数生长期(OD600约0.5)，停止培养，冰浴2.5 h后，用10%甘油洗涤2次，再分别加入PZSⅢ(未重组人白介素2基因)和PZSⅢ～Ⅰ(重组人白介素2基因)质粒DNA 1～5 μg，在电压2.5 KV，电流25 mA，电阻200 Ω条件下进行电穿孔转化，在含有卡那霉素的分枝杆菌固体培养基的平板上筛选转化子和鉴定最后获得rBCG和rBCG-IL-2菌株。
, 百拇医药
1.3 动物
昆明种近交系小鼠，6～8周龄，雌雄随机，体重28～32 g，购自中山医科大学动物实验中心，每次均选取体重相近的小鼠分成不同的组，总共30只。
1.4 动物的接种
取对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞B16，用无血清的DMEM培养液洗涤2次，再用PBS调整细胞浓度至5×106个/ml；分别取对数生长期的rBCG，rBCG-IL-2用PBS调整浓度至0.1 mg/μl。于小鼠左大腿外侧皮下接种200 μl瘤细胞，并在相同部位分别注射不同的药物：对照组，每只小鼠注射10 μl的生理盐水；rBCG组，每只小鼠注射10 μl的未携带IL-2外源基因的重组卡介苗；rBCG-IL-2组，每只小鼠注射10 μl的能分泌人白介素2的卡介苗。并且以后每3天补注射1 mg的药物加强，分别于第1次接种瘤细胞和注射药物后的第1周、第2周、第3周将小鼠引颈处死，同时小鼠于第1次给药前和处死前均称量体重。
, 百拇医药
1.5 巨噬细胞的收集及活性检测
①将小鼠引颈处死后，用75%的乙醇浸泡消毒，取出小鼠在无菌条件下暴露腹部，用碘酒和75%的乙醇局部消毒并从腹部消毒处注入3.5 ml DMEM培养液和1.5 ml的净化空气。②均匀敲打小鼠腹部，无菌洗出腹腔液，以1 500 r/min，离心10 min，用DMEM培养液洗1次，用常规细胞计数法计算巨噬细胞浓度，调整细胞浓度1×106个/ml，同时加入LPS，使LPS的终浓度为10 μg/ml。③将巨噬细胞种96孔板，每孔100 μl即105个细胞；同时设不经巨噬细胞杀伤的靶细胞组，每孔点100 μl的含LPS的浓度为10 μg/ml的含10%胎牛血清的 DMEM培养液；每组均设3复孔。④在37℃，5%CO2条件下，培养48 h，加入靶细胞B16，靶细胞的浓度为1×105个/ml，每孔点100 μl即104个细胞，使效靶比为10∶1。⑤分别于培养24 h,48 h后，加入MTT 20 μl，再培养4 h，加入DMSO 100 μl，放在微量震荡器上混匀，镜检结晶完全溶解后，在570 nm处测吸光值。⑥每组取OD值的平均值，计算巨噬细胞杀伤活性；巨噬细胞杀伤活性按下列公式计算：
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巨噬细胞杀伤活性=1-(OD(Mφ杀伤后的靶细胞))/(OD(未经Mφ杀伤的靶细胞)
1.6 rBCG-IL-2上清液的制备及其表达分泌IL-2的检测
将rBCG-IL-2和rBCG菌株接种到含有500 μg/ml卡那霉素的分枝杆菌液体培养基中继续培养，待其培养到对数生长期，取培养上清，采用放免平衡法测定IL-2的表达量。依次按缓冲液管，标准管和样品管编号，分别取缓冲液，标准液及样品100 μl，加入到已编号管内，然后再加抗血清100 μl，最后每管加125I-IL-2各100 μl，摇匀，4℃，2 500 r/min，20 min离心，吸弃上清夜，在γ计数器上测定并按固定程序直接给出有关参数，标准曲线及样品浓度；细菌菌落数采用倍比稀释法，稀释10倍，100倍，1 000倍，10 000倍，取菌落平均数乘以稀释倍数。
1.7 统计学分析
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全部数据输入电脑，采用PEMS软件包分析，数据采用t检验及配对t检验。
2 结 果
第1次给药后的第1周，第2周和第3周，小鼠腹腔巨噬细胞的浓度见表1；巨噬细胞在加入靶细胞再培养24 h和48 h后，其杀伤活性见表2。表1横向比较，即同一组不同时间巨噬细胞浓度比较，P>0.05；纵向比较，即同一周不同时间巨噬细胞浓度比较，P>0.05；表2同一周横向比较，即同一组同一周不同培养时间巨噬细胞杀伤活性相比较，P>0.05。
表1 不同时间巨噬细胞的浓度(
±S)×106个/毫升
Tab. 1 The density of MΦ in different time
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1W
2W
3W
Control groups
2.41±0.83
2.39±0.73
2.25±0.91
rBCG groups
2.37±0.69
2.43±0.87
2.35±0.89
rBCG-IL-2 groups
, 百拇医药
2.35±0.83
2.47±0.93
2.37±0.75
表2 巨噬细胞在不同时间的杀伤活性(±S，%)
Tab. 2 Tumoricidal effect of MΦ in different time
1W24h
1W48h
2W24h
2W48h
3W24h
, 百拇医药
3W48h
Control groups
69.57±2.77
68.87±3.23
64.57±1.75
65.37±3.36
68.70±0.82
67.57±0.64
rBCG groups
74.87±1.23△
76.17±2.78▲
, 百拇医药
77.43±2.22□
75.01±1.35□
79.10±2.21□
80.23±1.23
rBCG-IL-2 groups
87.27±1.96▲
87.97±1.51□■
83.07±1.07□■
82.60±1.71□■
, 百拇医药
84.90±1.65□■
85.23±1.41□■
△ P>0.05; ▲P<0.05 and □P<0.01, compaired with control groups； ■P<0.01, compaired with rBCG-IL-2 groups 从实验可知道，在前提条件相同的情况下，能分泌人白介素2的rBCG-IL-2组小鼠巨噬细胞的杀伤活性比对照组巨噬细胞杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)，也比不能分泌人白介素2的 rBCG组巨噬细胞杀伤活性显著地增强(P<0.05或P<0.01)；除了给药后第1周，加入靶细胞培养24 h，rBCG组巨噬细胞杀伤活性与对照组巨噬细胞杀伤活性无差别外(P>0.05)，其余rBCG组巨噬细胞杀伤活性比对照组巨噬细胞杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。给药后的第1周，第2周和第3周，巨噬细胞的浓度没有显著差异(P>0.05)，并且，不管加靶细胞后培养24 h，还是培养48 h，巨噬细胞杀伤活性也无显著地差异(P>0.05)。但是，用显微镜观察每组腹腔巨噬细胞，在放大相同的倍数下，rBCG-IL-2组相对于rBCG组和对照组的巨噬细胞的体积偏大，表现在细胞的长径和短径都偏长。
, 百拇医药
3 讨 论
rBCG-IL-2组小鼠腹腔巨噬细胞的体外杀伤活性明显高于rBCG组和对照组，是由于rBCG-IL-2既能起BCG的作用，又能分泌IL-2，BCG能参与免疫细胞的增殖与分化[4]，而IL-2在活化巨噬细胞的同时，又能产生多种淋巴因子如IFN-γ，IL-4，IL-6及GM-CSF等。IL-4促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能；IL-6诱导巨噬细胞的分化；IFN-γ促进巨噬细胞FcγR表达，促进巨噬细胞杀伤作用，促进T细胞IL-2R表达；GM-CSF能刺激巨噬细胞祖细胞的增殖[2]。所以，能分泌人白介素2的重组卡介苗提高了巨噬细胞的杀伤活性。
90年代初，人们既开始了以肿瘤细胞为靶细胞的IL-2的基因研究，IL-2转基因瘤苗能抑制肿瘤的形成[5，6]，致瘤性明显地减低或消除[7，8]治疗已形成的肿瘤[9]；但是，由IL-2基因修饰的肿瘤细胞分泌IL-2量少，在经过体循环后，远不足以维持进一步激活肿瘤局部的淋巴细胞，限制了IL-2基因治疗的疗效[10]。我们将IL-2基因重组到卡介苗内，不但发挥了BCG治疗肿瘤和延缓肿瘤复发的效果，最重要的是 IL-2的分泌量达到了每毫克(湿重，约1×106 CFU)2.47 ng，高水平的IL-2缩短了刺激机体免疫功能时间，表现在rBCG-IL-2组巨噬细胞杀伤活性在第1周就达到最大，对其他指标的研究也表明了rBCG-IL-2大大增强了宿主的免疫功能：如rBCG-IL-2组小鼠瘤体体积明显小于rBCG组和对照组，脾淋巴细胞活性显著高于rBCG组和对照组，病理结果也显示rBCG-IL-2组小鼠瘤体周围具有大量的淋巴细胞浸润(另文报道)。rBCG-IL-2组在给药后的第1周，第2周和第3周，不管加靶细胞培养24 h，还是培养48 h，巨噬细胞杀伤活性差别不大，说明巨噬细胞的活性并不是可以无止境地增加，而是有一定的限度。
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rBCG-IL-2 使腹腔巨噬细胞的体积变大，而没有使巨噬细胞的数量明显地增加，这一点尚待进一步研究。
参 考 文 献
1，金伯泉. 细胞和分子免疫学. 西安： 世界图书出版社， 1998. 103
2，Zembala M, Siedlar M, Ruggiero I， et al. The MHC class-Ⅱ and CD44 moleculars are involved in the induction of tumor necrosis factor (TNF) gene expression by human monocytes stimulated with tumor cells. Int J Cancer, 1994, 56: 269
3，Fujimoto T, O’Donnell MA, Szilvasi A， et al. Bacillus Calmette-Guerin plus interleukin-2 and/or gran μlocyte/macrophage-colony-stimulating factor enhances immunocompetent cell production of interferon-y, wich inhibits B16F10 melanoma cell groth in vitro. Cancer Immunol, 1996, 42: 280
, 百拇医药
4，Bohle A, Thanhauser A, Ulmer AJ. Dissecting the immunobiological effects of bacillus Calmette-Guerin (BCG) in vitro: Evidence of a distinct BCG activated killer (BAK) cell phenomenon. J Urol, 1993, 150: 1932
5，Meazza R, Marciano S, Sforzini S, et al. Analysis of receptor expression and of the biological effects of IL-2 gene transfection in small-cell lung cancer. B J Cancer, 1996, 74: 78
6，靳风烁， 于茂生， 宏 襄， 等. 膀胱肿瘤基因瘤苗诱导的抗肿瘤作用. 中华秘尿外科杂志， 1996， 179(5)： 267
, 百拇医药
7，陈国友， 曹雪涛， 刘江秋， 等. IL-2，IL-4基因转染后肿瘤细胞表面ICMA-1分子的表达及其作用. 中国免疫学杂志， 1996， 12(1)： 20
8，Lee SS, Eisenlohr LC, Mclue PA, et al. Intravesical gene therapy: In vivo gene transfer using recombinant vaccinia virus vectors. Cancer Res, 1994, 54(13): 3325
9，王全兴， 曹雪涛， 章卫平， 等. 瘤体内注射脂质体包裹的IL-2基因的抗肿瘤作用及其局部免疫机理分析. 中国免疫学杂志， 1995， 11(5)： 290
10，万 涛， 曹雪涛， 刘江秋， 等. 重组痘苗病毒载体介导的IL-2基因局部转染对小鼠黑色素瘤的治疗作用. 中国免疫学杂志， 1997， 13(4)： 211
(1999-03-29收稿； 1999-06-02修回), 百拇医药
单位：梅玉屏 曾星 黄羽 章国来(广州中医药大学第二附属医院中心实验室 广州 510120)
关键词：重组白细胞介素2卡介苗；巨噬细胞；黑色素瘤细胞株；杀伤活性
中国肿瘤生物治疗杂志000110 摘 要 目的： 研究能分泌人白细胞介素2的重组卡介苗(rBCG-IL-2)对小鼠腹腔巨噬细胞体外杀伤活性功能的改变，探讨rBCG-IL-2对宿主免疫功能的影响。方法： 采用基因工程技术和电转化技术构建卡介苗，采用MTT法测定小鼠腹腔巨噬细胞体外的杀伤活性。结果： rBCG-IL-2组小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性明显大于rBCG组和对照组，且巨噬细胞的杀伤活性在一周内达到最大。结论： rBCG-IL-2能提高巨噬细胞的杀伤活性，是一种很有前景的生物制剂。
《中国图书资料分类法》分类号 R392.11
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Effect of Recombinant BCG Secreting Human IL-2 on Cytotoxicity of Murine Peritoneal Macrophages
Mei Yuping， Zeng Xing， Huang Yu， Zhang Guolai
(The Key Laboratory, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510120)
Abstract Objective: To investigate the effect of recombinant BCG secreting IL-2 (rBCG-IL-2) on peritoneal macrophages of mouse and inquire into the effect of rBCG-IL-2 on immunity of host. Methods: Gene engineering technology, electricity transference and inoculation tumor cell are adopted; MTT assay is used to determine tumoricidal effect of macrophages. Results: Tumoricidal effect of macrophages of rBCG-IL-2 groups was higher than those of the control groups and BCG groups, and the tumoricidal effect of macrophages could reach a high state in a week. Conclusion: rBCG-IL-2 can raise tumoricidal effect of macrophages, improve immunity of host and is a prospect biological preparation.
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Key words recombinant BCG; macrophages; melanocarcinoma cell strain; cytotoxicity
BCG治疗肿瘤和延缓肿瘤的复发取得了肯定的疗效，白细胞介素2(IL-2)由Th1细胞产生，是调节细胞介导免疫的关键因子，尤其在抗肿瘤免疫调节中起重要的作用，IL-2能有效地激活巨噬细胞(MΦ)[1]，而活化的巨噬细胞在维持机体内环境稳定，抗感染及抗肿瘤方面均起重要作用[2]。当IL-2和BCG同时起作用时，能显著增强宿主的免疫细胞活性[3]。本研究采用我们构建的一种能表达分泌人白介素2的重组BCG(recombinant BCG expressing and secreting human IL-2，rBCG-IL-2)和不能分泌人白介素2的重组BCG即未携带人白介素2外源基因的重组BCG(recombinant BCG without foreign gene，rBCG)对小鼠黑色素瘤动物模型进行实验研究，观察rBCG-IL-2，rBCG在接种肿瘤前后巨噬细胞体外杀伤活性的改变，进一步探讨rBCG-IL-2对荷瘤小鼠免疫功能的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料
DMEM培养液，pH7.3，脂多糖LPS浓度为100 μg/ml，四甲基偶氮唑蓝MTT浓度为5 mg/ml，二甲基亚砜DMSO用原液，Middlebrook 7H9, ADC均购自Promega公司和Sigma公司。磷酸缓冲液PBS，浓度为0.1 mol/L，pH6.4，BCG为成都和上海生物制品所产品。小鼠黑色素瘤细胞B16购自武汉大学ATCC中心。
1.2 BCG感受态细胞的制备及转化
BCG菌种接种到Middlebrook 7H9，补加ADC(葡萄糖、牛血清白蛋白及盐的混合液)和20%Tween 80培养基中，37℃静止培养，待BCG培养至对数生长期(OD600约0.5)，停止培养，冰浴2.5 h后，用10%甘油洗涤2次，再分别加入PZSⅢ(未重组人白介素2基因)和PZSⅢ～Ⅰ(重组人白介素2基因)质粒DNA 1～5 μg，在电压2.5 KV，电流25 mA，电阻200 Ω条件下进行电穿孔转化，在含有卡那霉素的分枝杆菌固体培养基的平板上筛选转化子和鉴定最后获得rBCG和rBCG-IL-2菌株。
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1.3 动物
昆明种近交系小鼠，6～8周龄，雌雄随机，体重28～32 g，购自中山医科大学动物实验中心，每次均选取体重相近的小鼠分成不同的组，总共30只。
1.4 动物的接种
取对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞B16，用无血清的DMEM培养液洗涤2次，再用PBS调整细胞浓度至5×106个/ml；分别取对数生长期的rBCG，rBCG-IL-2用PBS调整浓度至0.1 mg/μl。于小鼠左大腿外侧皮下接种200 μl瘤细胞，并在相同部位分别注射不同的药物：对照组，每只小鼠注射10 μl的生理盐水；rBCG组，每只小鼠注射10 μl的未携带IL-2外源基因的重组卡介苗；rBCG-IL-2组，每只小鼠注射10 μl的能分泌人白介素2的卡介苗。并且以后每3天补注射1 mg的药物加强，分别于第1次接种瘤细胞和注射药物后的第1周、第2周、第3周将小鼠引颈处死，同时小鼠于第1次给药前和处死前均称量体重。
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1.5 巨噬细胞的收集及活性检测
①将小鼠引颈处死后，用75%的乙醇浸泡消毒，取出小鼠在无菌条件下暴露腹部，用碘酒和75%的乙醇局部消毒并从腹部消毒处注入3.5 ml DMEM培养液和1.5 ml的净化空气。②均匀敲打小鼠腹部，无菌洗出腹腔液，以1 500 r/min，离心10 min，用DMEM培养液洗1次，用常规细胞计数法计算巨噬细胞浓度，调整细胞浓度1×106个/ml，同时加入LPS，使LPS的终浓度为10 μg/ml。③将巨噬细胞种96孔板，每孔100 μl即105个细胞；同时设不经巨噬细胞杀伤的靶细胞组，每孔点100 μl的含LPS的浓度为10 μg/ml的含10%胎牛血清的 DMEM培养液；每组均设3复孔。④在37℃，5%CO2条件下，培养48 h，加入靶细胞B16，靶细胞的浓度为1×105个/ml，每孔点100 μl即104个细胞，使效靶比为10∶1。⑤分别于培养24 h,48 h后，加入MTT 20 μl，再培养4 h，加入DMSO 100 μl，放在微量震荡器上混匀，镜检结晶完全溶解后，在570 nm处测吸光值。⑥每组取OD值的平均值，计算巨噬细胞杀伤活性；巨噬细胞杀伤活性按下列公式计算：
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巨噬细胞杀伤活性=1-(OD(Mφ杀伤后的靶细胞))/(OD(未经Mφ杀伤的靶细胞)
1.6 rBCG-IL-2上清液的制备及其表达分泌IL-2的检测
将rBCG-IL-2和rBCG菌株接种到含有500 μg/ml卡那霉素的分枝杆菌液体培养基中继续培养，待其培养到对数生长期，取培养上清，采用放免平衡法测定IL-2的表达量。依次按缓冲液管，标准管和样品管编号，分别取缓冲液，标准液及样品100 μl，加入到已编号管内，然后再加抗血清100 μl，最后每管加125I-IL-2各100 μl，摇匀，4℃，2 500 r/min，20 min离心，吸弃上清夜，在γ计数器上测定并按固定程序直接给出有关参数，标准曲线及样品浓度；细菌菌落数采用倍比稀释法，稀释10倍，100倍，1 000倍，10 000倍，取菌落平均数乘以稀释倍数。
1.7 统计学分析
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全部数据输入电脑，采用PEMS软件包分析，数据采用t检验及配对t检验。
2 结 果
第1次给药后的第1周，第2周和第3周，小鼠腹腔巨噬细胞的浓度见表1；巨噬细胞在加入靶细胞再培养24 h和48 h后，其杀伤活性见表2。表1横向比较，即同一组不同时间巨噬细胞浓度比较，P>0.05；纵向比较，即同一周不同时间巨噬细胞浓度比较，P>0.05；表2同一周横向比较，即同一组同一周不同培养时间巨噬细胞杀伤活性相比较，P>0.05。
表1 不同时间巨噬细胞的浓度(
±S)×106个/毫升Tab. 1 The density of MΦ in different time
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1W
2W
3W
Control groups
2.41±0.83
2.39±0.73
2.25±0.91
rBCG groups
2.37±0.69
2.43±0.87
2.35±0.89
rBCG-IL-2 groups
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2.35±0.83
2.47±0.93
2.37±0.75
表2 巨噬细胞在不同时间的杀伤活性(
±S，%)Tab. 2 Tumoricidal effect of MΦ in different time
1W24h
1W48h
2W24h
2W48h
3W24h
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3W48h
Control groups
69.57±2.77
68.87±3.23
64.57±1.75
65.37±3.36
68.70±0.82
67.57±0.64
rBCG groups
74.87±1.23△
76.17±2.78▲
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77.43±2.22□
75.01±1.35□
79.10±2.21□
80.23±1.23
rBCG-IL-2 groups
87.27±1.96▲
87.97±1.51□■
83.07±1.07□■
82.60±1.71□■
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84.90±1.65□■
85.23±1.41□■
△ P>0.05; ▲P<0.05 and □P<0.01, compaired with control groups； ■P<0.01, compaired with rBCG-IL-2 groups 从实验可知道，在前提条件相同的情况下，能分泌人白介素2的rBCG-IL-2组小鼠巨噬细胞的杀伤活性比对照组巨噬细胞杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)，也比不能分泌人白介素2的 rBCG组巨噬细胞杀伤活性显著地增强(P<0.05或P<0.01)；除了给药后第1周，加入靶细胞培养24 h，rBCG组巨噬细胞杀伤活性与对照组巨噬细胞杀伤活性无差别外(P>0.05)，其余rBCG组巨噬细胞杀伤活性比对照组巨噬细胞杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。给药后的第1周，第2周和第3周，巨噬细胞的浓度没有显著差异(P>0.05)，并且，不管加靶细胞后培养24 h，还是培养48 h，巨噬细胞杀伤活性也无显著地差异(P>0.05)。但是，用显微镜观察每组腹腔巨噬细胞，在放大相同的倍数下，rBCG-IL-2组相对于rBCG组和对照组的巨噬细胞的体积偏大，表现在细胞的长径和短径都偏长。
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3 讨 论
rBCG-IL-2组小鼠腹腔巨噬细胞的体外杀伤活性明显高于rBCG组和对照组，是由于rBCG-IL-2既能起BCG的作用，又能分泌IL-2，BCG能参与免疫细胞的增殖与分化[4]，而IL-2在活化巨噬细胞的同时，又能产生多种淋巴因子如IFN-γ，IL-4，IL-6及GM-CSF等。IL-4促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能；IL-6诱导巨噬细胞的分化；IFN-γ促进巨噬细胞FcγR表达，促进巨噬细胞杀伤作用，促进T细胞IL-2R表达；GM-CSF能刺激巨噬细胞祖细胞的增殖[2]。所以，能分泌人白介素2的重组卡介苗提高了巨噬细胞的杀伤活性。
90年代初，人们既开始了以肿瘤细胞为靶细胞的IL-2的基因研究，IL-2转基因瘤苗能抑制肿瘤的形成[5，6]，致瘤性明显地减低或消除[7，8]治疗已形成的肿瘤[9]；但是，由IL-2基因修饰的肿瘤细胞分泌IL-2量少，在经过体循环后，远不足以维持进一步激活肿瘤局部的淋巴细胞，限制了IL-2基因治疗的疗效[10]。我们将IL-2基因重组到卡介苗内，不但发挥了BCG治疗肿瘤和延缓肿瘤复发的效果，最重要的是 IL-2的分泌量达到了每毫克(湿重，约1×106 CFU)2.47 ng，高水平的IL-2缩短了刺激机体免疫功能时间，表现在rBCG-IL-2组巨噬细胞杀伤活性在第1周就达到最大，对其他指标的研究也表明了rBCG-IL-2大大增强了宿主的免疫功能：如rBCG-IL-2组小鼠瘤体体积明显小于rBCG组和对照组，脾淋巴细胞活性显著高于rBCG组和对照组，病理结果也显示rBCG-IL-2组小鼠瘤体周围具有大量的淋巴细胞浸润(另文报道)。rBCG-IL-2组在给药后的第1周，第2周和第3周，不管加靶细胞培养24 h，还是培养48 h，巨噬细胞杀伤活性差别不大，说明巨噬细胞的活性并不是可以无止境地增加，而是有一定的限度。
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rBCG-IL-2 使腹腔巨噬细胞的体积变大，而没有使巨噬细胞的数量明显地增加，这一点尚待进一步研究。
参 考 文 献
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(1999-03-29收稿； 1999-06-02修回), 百拇医药