FHIT基因与肺癌
作者：陈军 周清华
单位：陈军 周清华(华西医科大学附属第一医院胸心外科 成都，610041)
关键词：
中国肺癌杂志000125 癌基因的激活在肺癌发生中起重要作用，但现有的激活方式并不能完全解释肺癌的发生。近年来，发现了另一类基因，由这类基因突变或缺失所引起的失活可最终导致肿瘤的发生，表明这类基因在正常情况下具有抑制肿瘤形成或生长的作用，被称为肿瘤抑制基因，如p53、Rb、p16等。但是，近年的研究发现上述肿瘤抑制基因在肿瘤发生的初始阶段常处于一种野生型功能状态，而仅在肿瘤的中晚期才发生功能和结构的异常。因此，人们一直试图寻找一种新的在肿瘤的初期，甚至在癌前期就有功能和结构异常的基因。1996年由Ohta等发现的FHIT(fragile histidine triad,FHIT)基因可能就属于此类肿瘤抑制基因。FHIT基因定位于染色体3p14.2，含10个外显子。其cDNA约1.1?kb，编码由147个氨基酸组成的16.8?ku蛋白质。1996年，Sozzi等[1]首次报道肺癌组织中80%?SCLC和40%?NSCLC存在FHIT基因的mRNA转录异常，76%存在FHIT等位基因的杂合缺失。随后的研究显示在肺癌癌前病变中也有FHIT基因的缺失和转录表达的异常[2]，提示FHIT基因异常可能是肺癌发生的早期分子事件。
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1 FHIT基因的确定
现有的研究表明：在肺癌、头颈部肿瘤、肾脏肿瘤和乳腺癌等上皮肿瘤中常有3号染色体短臂上染色体的缺失和等位基因的杂合缺失。在肿瘤中3p缺失形式多样，常与3p12-14、3p21和3p24-25等区域有关。1982年，Whang-Peng等[3]首次报道在16个SCLC细胞株中都有3号染色体短臂3p14-23区域的部分缺失。1991年，Sozzt等[4]报道3p的缺失可能是肿瘤发生的早期事件。随后一些作者也报道在肺癌癌变前期和良性增生的乳腺疾病中存在3p的缺失。这些资料提示3p上可能存在抑癌基因(tumor suppressor genes,TSG)。
在3p21区等位基因的纯合缺失部位分离到诸如ACY1(aminoacylase gene,20%SCLC细胞株表达降低)[5，6]、UBEIL[7](ubiquitin-activating enzyme E1，在SCLC细胞株中表达降低)，以及人类锌指基因ZnF16和ZnF3等。但随后的研究认为它们都不是抑癌基因，故目前在3p21区未发现明确的抑癌基因。
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迄今，在3p25区鉴定出的唯一抑癌基因是Von Hippel-Lindan(VHL)基因。VHL疾病是一个遗传因素占优势的家族性肿瘤综合征。具有这种素质的个体易患肾癌为主的各种肿瘤。1994年，Gnarra等[8]报道VHL基因在相当多的肾癌细胞中失活，但在肺癌中却异常罕见。
3p14区染色体在诸如肺癌、肾癌、乳腺癌和消化道肿瘤等多种原发性肿瘤和其衍生的肿瘤细胞中均易出现缺失。有关染色体3p14.2区域的细胞遗传学研究有两个里程碑。第一个是t(3；8)(p14.2；q24)易位断裂点的克隆[9]，而t(3；8)(p14.2；q24)染色体易位常与早发、双侧、多灶的肾透明细胞癌相关；第二个是脆性部位FRA3B的发现，而FRA3B又是人类基因组最常见的Apaphidicolin诱导的脆性部位[10]。此外，1991年，LaForgia等[11]还将γ蛋白质-酪氨酸磷酸酶基因(protein-tyrosin phosphatase γ gene,PTPRG)作为拟定的抑癌基因，定位靠近于3p14.2 t(3；8)断裂处的着丝粒侧，绝大多数肾透明细胞癌都有该断裂处一侧的0.5?Mb大小区域的丢失。以后通过啮齿动物—人类细胞杂交技术筛选出含部分3号染色体的亚克隆，再用特异性3p标记确定3p14.2的断裂处，结果显示3p14.2断裂处包含了FRA3B、t(3；8)和PTPRG基因的5′末端。1996年Ohta等[12]利用外显子捕捉法(exon trapping)确定了一个新的人类基因，由该基因cDNA推算的蛋白质和具有组氨酸三体结构的HIT(histidine triad)蛋白质高度同源，故定名为FHIT基因。
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2 FHIT基因的结构
首先用BE758-6，A6URA、A3和1300E3作探针从646D4 cosmid文库筛选克隆，分离克隆末端并用作下一轮的cosmid筛选，再用起始序列标记位点(starting sequence-tagged site,STS)的PCR构建cosmid图谱，而且每一新的STS和YAC contig对比，和细胞系中含纯合性缺失且啮齿动物—人类细胞杂交保留的3号染色体部分对比，最后6个纯合性丢失区域的cosmid构建成一个cosmid contig。利用外显子捕捉法从6个cosmid捕捉外显子，并同核苷酸序列数据库比较制图，同时以捕获的外显子制备寡聚核苷酸引物，从cosmid 76上产生内含子序列，这些序列依次用来制备引物和探针，将外显子定位于cosmid、YAC和含有缺失的癌细胞DNA上。随后确定FHIT cDNA全长约1.1?kb，共有10个外显子(图1)[12]。5′端含一超过350?bp的非编码区，紧跟着是一个蛋氨酸起始密码子及其周围符合Kozak规则的序列，一个编码147个氨基酸的开放阅读框(open reading frame,ORF)，3′端非编码区域，poly(A)共有序列(consensus sequence)和poly(A)尾。ORF起于外显子5，止于外显子9。FHIT基因在结构上有2个显著特点：①在脆性区域的端粒侧有很多Alu重复结构，在这经常发生缺失的同一区域有(TAA)15重复，重复的次数不尽相同[13]；②几乎所有外显子以AG序列结尾，而这恰恰是通常所见的基因剪接受体位点序列。令人感兴趣的是三个起始外显子E1、E2、E3分别位于t(3；8)断裂处的着丝粒侧、t(3；8)断裂处和PTPRG 5′端之间，明显提示FHIT参与了前述的家族性肾癌的发生，因为t(3；8)易位使FHIT基因的表达受到干扰[14]。
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图1 FHIT基因结构图。并标出了YAC克隆位置、STSs、质粒和HPV16整合位点，以及t(3；8)易位断裂点。
Fig 1 Structure of FHIT gene
迄今为止的研究表明，肿瘤中FHIT基因罕见点突变，而主要表现为一个或数个外显子缺失。Ohta等[12]通过对一系列肿瘤标本及细胞系的分析后将FHIT基因不正常转录大致分为两种类型：Ⅰ型以缺失外显子5为特征，因外显子5中包含有FHIT基因开放阅读框的蛋氨酸起始密码子，故外显子5的缺失将导致ORF完整性的丢失；Ⅱ型则以缺失外显子8为特征，外显子8编码组氨酸三体的结构域，且一些Ⅱ型转录中只缺失外显子8，因而表明外显子8是FHIT缺失的重要靶区。由于外显子6中有一个非开放阅读框的蛋氨酸密码子，或插入序列提供了一个蛋氨酸密码子，所以大部分异常转录能编码部分蛋白质，可带或不带HIT结构域。极少数不正常转录虽缺失外显子4或在外显子4和5之间的非编码区域插入了DNA片段，但仍保留完整的ORF。一般来说，无论Ⅰ型还是Ⅱ型转录都无法编码功能完整的蛋白质。
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3 FHIT蛋白及其生物特征
FHIT基因编码一个由147个氨基酸组成的16.8 ku蛋白质，同源性分析发现FHIT蛋白质与裂殖酵母菌S.Pombe蛋白质Ap4A(5′，5-P1，P4-tetraphosphate)水解酶的由109个氨基酸组成的核心区域52%相同，69%相似，提示FHIT蛋白质可能是一种类似S.Pombe Ap4A水解酶的酶[15～17]。Ap4A水解酶由182个氨基酸组成，在体外可催化含有Ap4A的二核苷酸多磷酸盐的水解。但是人类Ap4A水解酶与前两者皆无相似性，故人类FHIT蛋白质可能不是人类Ap4A水解酶。测序分析发现FHIT蛋白质和S.Pombe Ap4A水解酶都与HIT相似。HIT蛋白质是一个功能尚不清楚的蛋白家族，含4个保守的组氨酸，其中三个形成一个HXHXH为特征的组氨酸三体，X常为缬氨酸[15，16]。
随后的生物化学的研究证明，人类FHIT蛋白质在体外具有Ap3A脱氢酶的活性，是一种典型的Ap3A水解酶(5′，5″，-P1，P3-triphosphate hydrolase)，催化Ap3A的水解反应，使Ap3A水平下降。Ap3A是ApnAs家族的重要成员，而AMP是其常见的一个反应产物[18]。通过位点直接诱变法表明FHIT蛋白质的完整功能需4个保守的组氨酸，随着组氨酸诱变成为天门冬酰胺，Ap3A水解酶活性也逐渐下降，其中央组氨酸三体是Ap3A水解酶活性绝对必需的，Mn2+和Mg2+可刺激其活性，而Zn2+可抑制其活性[18]。由于外显子8编码组氨酸三体的结构域，从而认为外显子8的改变是影响FHIT蛋白质功能的关键所在。
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组氨酸三体核苷酸结合蛋白(histidine triad nucleotide-binding protein,HINT)的晶体结构表明了组氨酸三体蛋白是核苷酸结构蛋白[19]。HINT和核苷酸的复合物也证明了在HIT超家族中大部分的保守区域介导了核苷酸的结合，且HIT的结构也成为磷酸结合物的组成部分。因此，FHIT蛋白是HIT家族中的一个酶，FHIT基因是一个与核苷酸代谢有关的基因。在细菌中，FHIT基因的产物Ap4A和Ap3A被认为是细胞应激时产生的报警物质[20]。干扰素可诱导人的培养细胞产生Ap3A的积累[21]，而细胞的毒素应激和生长接触抑制可产生Ap4A[22]。因此，FHIT蛋白和蛋白与酶的复合体可能与细胞应激时的信号应答有关，并导致细胞周期停止。
4 FHIT基因异常与肺癌
首先对肺癌中FHIT基因异常的研究做一归纳，见表1。
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为了确定FHIT基因在肺癌中的作用，Sozzi等[1]应用RT-PCR、DNA序列分析、LOH、Southern Blot和免疫组化法对100多例原发性肺癌组织中FHIT基因异常进行了分析。80% SCLC和40%的NSCLC存在FHIT基因转录异常。DNA测序分析发现最常见的异常转录为外显子4或5～8缺失。SCLC有两种缺失类型，第一种类型为丢失外显子4～6，或4～8，两者都丢失外显子5；第二种类型为丢失外显子8，导致组氨酸三体结构域异常。而NSCLC的异常转录也分为两种类型，即丢失外显子8和在外显子4下游插入-218?bp片段。此外大部分肿瘤组织在转录表达异常的同时也有一正常的FHIT基因转录产物，多认为是肿瘤组织中混有正常组织的原因。63%肿瘤标本在易脆区微卫星灶D3S1300、D3S4103和3′末端微卫星灶D3S1234等处存在LOH。为了确定特定FHIT位点异常在FHIT基因转录产物和蛋白表达异常中的作用，有人应用Southern Blot，RT-PCR，Western Blot和免疫组化方法对11个肺癌细胞株进行了研究[13]。Southern印迹杂交显示3株细胞存在外显子3、4、6、7和内含子5的杂合缺失或重排，1株细胞存在内含子5的纯合缺失。RT-PCR分析显示3株细胞只有FHIT基因异常转录本存在，其中1株仅有外显子4缺失而另外2株则有3～9多个外显子的缺失；6株细胞同时有FHIT基因的正常转录本存在；而另外2株细胞则仅有FHIT基因的正常转录本存在。通过对几株有FHIT基因正常大小转录本的肺癌细胞测序显示：FHIT基因转录本大小虽与正常相同，但缺失了关键性的编码外显子5～8，而插入了不同大小片段的内含子，因此编码的蛋白质常由于插入片段增加了新的氨基酸序列或改变了基因的阅读框架而缺乏了野生型蛋白的功能部分。Western Blot分析示11株细胞中有9株不产生FHIT蛋白；免疫组化结果也与此相同，仅有2株Western杂交阳性的细胞显示了细胞浆的阳性。以上结果显示：由于FHIT基
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表1 肺癌中FHIT基因的异常
Tab 1 FHIT gene abnormality in lung cancer Specimens
FHIT abnormality(%) & method
Reference
14 SCLC(T)
11/14(79)，RT-PCR
Sozzi， et al.(1996)
45 NSCLC(T)
18/45(40)，RT-PCR；
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Sozzi， et al.(1996)
63%～92% LOH，PCR
17 SCLC(CL)
0/17(0)，DNA-PCR，SB，RT-PCR
Yanagisawa,et al.(1996)
24 NSCLC(CL)
7/24(29)，DNA-PCR，SB，RT-PCR
Yanagisawa,et al.(1996)
15 SCLC(CL)
100% LOH，PCR；73%，RT-PCR
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Fong,et al.(1997)
17 NSCLC(CL)
88% LOH，PCR；77%，RT-PCR
Fong,et al.(1997)
8 SCLC(T)
100% LOH，PCR
Fong,et al.(1997)
108 NSCLC(T)
45% LOH，PCR；59%，RT-PCR
Fong,et al.(1997)
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8 CIS
6/8(75) LOH，PCR
Fong,et al.(1997)
106 NSCLC(T)
38% LOH，PCR
Burke,et al.(1998)
51 BAC(T)
22/51(43) LOH，PCR
Marchetti,et al.(1998)
105 NSCLC(T)
36/105(34)，Immunohistochemical methods
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Tomizawa,et al.(1998)
NSCLC(T)
73%，Immunohistochemical methods
Sozzi,et al.(1998)
Precancerous
93%,Immunohistochemical methods
Sozzi,et al.(1998)
lesions
88 primary lung
59% and 35%，RT-PCR
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Tokuchi,et al.(1999)
cancers and paired
normal lung tissues
22 normal control
64%，RT-PCR
Tokuchi,et al.(1999)
lung tissues
T：Tumors；CL：Cell line；CIS：Carcinoma in situ；RT-PCR：Reverse transcription-polymerase chain reaction；LOH：Loss of heterozygosity；SB：Southern Blot；DNA-PCR：Genomic polymerase chain reaction.因的重排，对于检测DNA或RNA而未发现FHIT基因异常的肺癌而言，采用免疫组化法检测FHIT基因蛋白的表达可能是一种较好的方法。 1996年，Yanagisawa等[23]观察24株NSCLC细胞株，发现7株细胞存在FHIT表达异常、LOH和基因内的纯合缺失。1997年，Fong等[2]对原发性肺癌组织、细胞株和癌前支气管病变的FHIT基因进行了分析，结果显示绝大多数肺癌存在FHIT/FRA3B等位基因缺失和转录表达的异常(原位癌亦存在FHIT基因异常)，证实FHIT/FRA3B异常与肺癌的发生有密切关系。经Northern Blot分析显示肿瘤细胞仅有FHIT基因mRNA的野生型低表达或异常表达。
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综上所述，FHIT基因在肺癌中的频发异常多由于包含易被致癌物质诱导断裂的易碎片段FRA3B所致。诸如呼吸道和消化道的肿瘤，由于常暴露于致癌剂中，FHIT基因多有异常改变。尤其是肺癌，各种化学物质诸如烟草等可直接干扰DNA的复制，导致基因的异常。1996年，Virgilio等[24]的研究提示由于吸烟、饮酒等外在致癌剂的作用，在肺部、、头颈部和消化道的肿瘤中，FHIT基因的异常发生频率最高。
1997年，Sozzi等[25]研究吸烟与FHIT基因微卫星灶(D3S1300、D3S4103、D3S1234)的关系发现：吸烟组中80%(41/51)存在FHIT基因的一个或多个微卫星灶的LOH，而不吸烟组仅有23%(9/40)(P<0.001)，而其它染色体上的微卫星灶(如D10S197、D3S1339等)则未发现诸如此类的变化，从而提示：FHIT基因可能是烟草致肺癌的靶点，而且可能是肺癌发生学上的早期分子现象，检测FHIT基因微卫星灶有助于重度吸烟人群早期肺癌的预测。相似的结论也出现在1998年Nelson等的报道中[26]。1998年，Tomizawa等[27]对105例Ⅰ期NSCLC组织进行了免疫组化检测，结果示34%(36/105)肿瘤组织FHIT基因蛋白表达明显降低，且不同组织类型肺癌中FHIT蛋白降低的百分率不同，在肺鳞癌中有86%(24/28)FHIT蛋白表达降低，而腺癌仅有10%(7/67)的降低(P<0.001)；吸烟组中40%(32/80)存在FHIT蛋白表达降低，而不吸烟组仅有16%(4/25，P＝0.013)，结果示FHIT基因改变主要发生在肺鳞癌和吸烟患者中。进一步随访发现，在Ⅰ期NSCLC患者中，FHIT蛋白低表达患者预后明显较FHIT蛋白表达正常的患者差，从而也提示FHIT基因的异常与肺癌患者的预后有关。1998年，Sozzi等[28]也对NSCLC进行免疫组化检测，结果示73%NSCLC和93%的癌前病变有FHIT蛋白的表达降低，且肺鳞癌中FHIT蛋白降低发生率(87%)明显高于腺癌(57%)(P<0.0001)，吸烟组亦明显高于不吸烟组(75% versus 39%)(P<0.005)。这进一步证实了FHIT基因异常在控制支气管上皮细胞的转化中起重要作用，且检测FHIT蛋白有助于早期肺癌的诊断。
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然而，FHIT基因在肺癌中的研究也有不一致的意见。1999年，Tokuchi等[29]用RT-PCR方法发现在88例原发性肺癌和其相应正常肺组织中，59%的肺癌和35%相应正常肺组织有FHIT基因的转录异常，而22例正常肺组织中亦有64%存在FHIT基因转录异常，提示FHIT基因转录本异常不仅存在于肿瘤组织中，亦存在于正常组织中，从而认为FHIT基因转录本异常是由于转录过程中错误的拼接和加工造成，而且FHIT基因转录本异常仅是结构的改变而不是基因功能上的变化。
5 展望
肿瘤中FHIT基因异常的发现是将易脆位点的不稳定性与肿瘤联系起来的第一个分子事件[30]。由于不同的肿瘤组织和肿瘤细胞株中FHIT基因的频发均异常，所以FHIT基因被拟定为一个抑癌基因而在各种组织的肿瘤中得到广泛的研究，FHIT基因的异常也成为肿瘤发生过程中最常见的一个遗传学改变。FHIT蛋白具有脱氢酶的活性，在细胞应激的应答中起重要作用。FHIT基因的异常必将导致FHIT蛋白的缺乏或功能的丧失而影响细胞的应激，而这种影响又是肿瘤发生学中的早期分子事件。对FHIT蛋白的功能研究和体内将野生型FHIT基因导入有FHIT基因异常的癌前病变组织和肺癌组织中来逆转肿瘤细胞的研究，将证实FHIT基因是否是一个抑癌基因，而且也将为肿瘤的基因治疗提供新的策略。
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本课题受国家自然科学基金(39870299)资助
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收稿日期：1999-09-27
修回日期：1999-12-13, http://www.100md.com
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1 FHIT基因的确定
现有的研究表明：在肺癌、头颈部肿瘤、肾脏肿瘤和乳腺癌等上皮肿瘤中常有3号染色体短臂上染色体的缺失和等位基因的杂合缺失。在肿瘤中3p缺失形式多样，常与3p12-14、3p21和3p24-25等区域有关。1982年，Whang-Peng等[3]首次报道在16个SCLC细胞株中都有3号染色体短臂3p14-23区域的部分缺失。1991年，Sozzt等[4]报道3p的缺失可能是肿瘤发生的早期事件。随后一些作者也报道在肺癌癌变前期和良性增生的乳腺疾病中存在3p的缺失。这些资料提示3p上可能存在抑癌基因(tumor suppressor genes,TSG)。
在3p21区等位基因的纯合缺失部位分离到诸如ACY1(aminoacylase gene,20%SCLC细胞株表达降低)[5，6]、UBEIL[7](ubiquitin-activating enzyme E1，在SCLC细胞株中表达降低)，以及人类锌指基因ZnF16和ZnF3等。但随后的研究认为它们都不是抑癌基因，故目前在3p21区未发现明确的抑癌基因。
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迄今，在3p25区鉴定出的唯一抑癌基因是Von Hippel-Lindan(VHL)基因。VHL疾病是一个遗传因素占优势的家族性肿瘤综合征。具有这种素质的个体易患肾癌为主的各种肿瘤。1994年，Gnarra等[8]报道VHL基因在相当多的肾癌细胞中失活，但在肺癌中却异常罕见。
3p14区染色体在诸如肺癌、肾癌、乳腺癌和消化道肿瘤等多种原发性肿瘤和其衍生的肿瘤细胞中均易出现缺失。有关染色体3p14.2区域的细胞遗传学研究有两个里程碑。第一个是t(3；8)(p14.2；q24)易位断裂点的克隆[9]，而t(3；8)(p14.2；q24)染色体易位常与早发、双侧、多灶的肾透明细胞癌相关；第二个是脆性部位FRA3B的发现，而FRA3B又是人类基因组最常见的Apaphidicolin诱导的脆性部位[10]。此外，1991年，LaForgia等[11]还将γ蛋白质-酪氨酸磷酸酶基因(protein-tyrosin phosphatase γ gene,PTPRG)作为拟定的抑癌基因，定位靠近于3p14.2 t(3；8)断裂处的着丝粒侧，绝大多数肾透明细胞癌都有该断裂处一侧的0.5?Mb大小区域的丢失。以后通过啮齿动物—人类细胞杂交技术筛选出含部分3号染色体的亚克隆，再用特异性3p标记确定3p14.2的断裂处，结果显示3p14.2断裂处包含了FRA3B、t(3；8)和PTPRG基因的5′末端。1996年Ohta等[12]利用外显子捕捉法(exon trapping)确定了一个新的人类基因，由该基因cDNA推算的蛋白质和具有组氨酸三体结构的HIT(histidine triad)蛋白质高度同源，故定名为FHIT基因。
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2 FHIT基因的结构
首先用BE758-6，A6URA、A3和1300E3作探针从646D4 cosmid文库筛选克隆，分离克隆末端并用作下一轮的cosmid筛选，再用起始序列标记位点(starting sequence-tagged site,STS)的PCR构建cosmid图谱，而且每一新的STS和YAC contig对比，和细胞系中含纯合性缺失且啮齿动物—人类细胞杂交保留的3号染色体部分对比，最后6个纯合性丢失区域的cosmid构建成一个cosmid contig。利用外显子捕捉法从6个cosmid捕捉外显子，并同核苷酸序列数据库比较制图，同时以捕获的外显子制备寡聚核苷酸引物，从cosmid 76上产生内含子序列，这些序列依次用来制备引物和探针，将外显子定位于cosmid、YAC和含有缺失的癌细胞DNA上。随后确定FHIT cDNA全长约1.1?kb，共有10个外显子(图1)[12]。5′端含一超过350?bp的非编码区，紧跟着是一个蛋氨酸起始密码子及其周围符合Kozak规则的序列，一个编码147个氨基酸的开放阅读框(open reading frame,ORF)，3′端非编码区域，poly(A)共有序列(consensus sequence)和poly(A)尾。ORF起于外显子5，止于外显子9。FHIT基因在结构上有2个显著特点：①在脆性区域的端粒侧有很多Alu重复结构，在这经常发生缺失的同一区域有(TAA)15重复，重复的次数不尽相同[13]；②几乎所有外显子以AG序列结尾，而这恰恰是通常所见的基因剪接受体位点序列。令人感兴趣的是三个起始外显子E1、E2、E3分别位于t(3；8)断裂处的着丝粒侧、t(3；8)断裂处和PTPRG 5′端之间，明显提示FHIT参与了前述的家族性肾癌的发生，因为t(3；8)易位使FHIT基因的表达受到干扰[14]。
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图1 FHIT基因结构图。并标出了YAC克隆位置、STSs、质粒和HPV16整合位点，以及t(3；8)易位断裂点。
Fig 1 Structure of FHIT gene
迄今为止的研究表明，肿瘤中FHIT基因罕见点突变，而主要表现为一个或数个外显子缺失。Ohta等[12]通过对一系列肿瘤标本及细胞系的分析后将FHIT基因不正常转录大致分为两种类型：Ⅰ型以缺失外显子5为特征，因外显子5中包含有FHIT基因开放阅读框的蛋氨酸起始密码子，故外显子5的缺失将导致ORF完整性的丢失；Ⅱ型则以缺失外显子8为特征，外显子8编码组氨酸三体的结构域，且一些Ⅱ型转录中只缺失外显子8，因而表明外显子8是FHIT缺失的重要靶区。由于外显子6中有一个非开放阅读框的蛋氨酸密码子，或插入序列提供了一个蛋氨酸密码子，所以大部分异常转录能编码部分蛋白质，可带或不带HIT结构域。极少数不正常转录虽缺失外显子4或在外显子4和5之间的非编码区域插入了DNA片段，但仍保留完整的ORF。一般来说，无论Ⅰ型还是Ⅱ型转录都无法编码功能完整的蛋白质。
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3 FHIT蛋白及其生物特征
FHIT基因编码一个由147个氨基酸组成的16.8 ku蛋白质，同源性分析发现FHIT蛋白质与裂殖酵母菌S.Pombe蛋白质Ap4A(5′，5-P1，P4-tetraphosphate)水解酶的由109个氨基酸组成的核心区域52%相同，69%相似，提示FHIT蛋白质可能是一种类似S.Pombe Ap4A水解酶的酶[15～17]。Ap4A水解酶由182个氨基酸组成，在体外可催化含有Ap4A的二核苷酸多磷酸盐的水解。但是人类Ap4A水解酶与前两者皆无相似性，故人类FHIT蛋白质可能不是人类Ap4A水解酶。测序分析发现FHIT蛋白质和S.Pombe Ap4A水解酶都与HIT相似。HIT蛋白质是一个功能尚不清楚的蛋白家族，含4个保守的组氨酸，其中三个形成一个HXHXH为特征的组氨酸三体，X常为缬氨酸[15，16]。
随后的生物化学的研究证明，人类FHIT蛋白质在体外具有Ap3A脱氢酶的活性，是一种典型的Ap3A水解酶(5′，5″，-P1，P3-triphosphate hydrolase)，催化Ap3A的水解反应，使Ap3A水平下降。Ap3A是ApnAs家族的重要成员，而AMP是其常见的一个反应产物[18]。通过位点直接诱变法表明FHIT蛋白质的完整功能需4个保守的组氨酸，随着组氨酸诱变成为天门冬酰胺，Ap3A水解酶活性也逐渐下降，其中央组氨酸三体是Ap3A水解酶活性绝对必需的，Mn2+和Mg2+可刺激其活性，而Zn2+可抑制其活性[18]。由于外显子8编码组氨酸三体的结构域，从而认为外显子8的改变是影响FHIT蛋白质功能的关键所在。
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组氨酸三体核苷酸结合蛋白(histidine triad nucleotide-binding protein,HINT)的晶体结构表明了组氨酸三体蛋白是核苷酸结构蛋白[19]。HINT和核苷酸的复合物也证明了在HIT超家族中大部分的保守区域介导了核苷酸的结合，且HIT的结构也成为磷酸结合物的组成部分。因此，FHIT蛋白是HIT家族中的一个酶，FHIT基因是一个与核苷酸代谢有关的基因。在细菌中，FHIT基因的产物Ap4A和Ap3A被认为是细胞应激时产生的报警物质[20]。干扰素可诱导人的培养细胞产生Ap3A的积累[21]，而细胞的毒素应激和生长接触抑制可产生Ap4A[22]。因此，FHIT蛋白和蛋白与酶的复合体可能与细胞应激时的信号应答有关，并导致细胞周期停止。
4 FHIT基因异常与肺癌
首先对肺癌中FHIT基因异常的研究做一归纳，见表1。
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为了确定FHIT基因在肺癌中的作用，Sozzi等[1]应用RT-PCR、DNA序列分析、LOH、Southern Blot和免疫组化法对100多例原发性肺癌组织中FHIT基因异常进行了分析。80% SCLC和40%的NSCLC存在FHIT基因转录异常。DNA测序分析发现最常见的异常转录为外显子4或5～8缺失。SCLC有两种缺失类型，第一种类型为丢失外显子4～6，或4～8，两者都丢失外显子5；第二种类型为丢失外显子8，导致组氨酸三体结构域异常。而NSCLC的异常转录也分为两种类型，即丢失外显子8和在外显子4下游插入-218?bp片段。此外大部分肿瘤组织在转录表达异常的同时也有一正常的FHIT基因转录产物，多认为是肿瘤组织中混有正常组织的原因。63%肿瘤标本在易脆区微卫星灶D3S1300、D3S4103和3′末端微卫星灶D3S1234等处存在LOH。为了确定特定FHIT位点异常在FHIT基因转录产物和蛋白表达异常中的作用，有人应用Southern Blot，RT-PCR，Western Blot和免疫组化方法对11个肺癌细胞株进行了研究[13]。Southern印迹杂交显示3株细胞存在外显子3、4、6、7和内含子5的杂合缺失或重排，1株细胞存在内含子5的纯合缺失。RT-PCR分析显示3株细胞只有FHIT基因异常转录本存在，其中1株仅有外显子4缺失而另外2株则有3～9多个外显子的缺失；6株细胞同时有FHIT基因的正常转录本存在；而另外2株细胞则仅有FHIT基因的正常转录本存在。通过对几株有FHIT基因正常大小转录本的肺癌细胞测序显示：FHIT基因转录本大小虽与正常相同，但缺失了关键性的编码外显子5～8，而插入了不同大小片段的内含子，因此编码的蛋白质常由于插入片段增加了新的氨基酸序列或改变了基因的阅读框架而缺乏了野生型蛋白的功能部分。Western Blot分析示11株细胞中有9株不产生FHIT蛋白；免疫组化结果也与此相同，仅有2株Western杂交阳性的细胞显示了细胞浆的阳性。以上结果显示：由于FHIT基
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表1 肺癌中FHIT基因的异常
Tab 1 FHIT gene abnormality in lung cancer Specimens
FHIT abnormality(%) & method
Reference
14 SCLC(T)
11/14(79)，RT-PCR
Sozzi， et al.(1996)
45 NSCLC(T)
18/45(40)，RT-PCR；
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Sozzi， et al.(1996)
63%～92% LOH，PCR
17 SCLC(CL)
0/17(0)，DNA-PCR，SB，RT-PCR
Yanagisawa,et al.(1996)
24 NSCLC(CL)
7/24(29)，DNA-PCR，SB，RT-PCR
Yanagisawa,et al.(1996)
15 SCLC(CL)
100% LOH，PCR；73%，RT-PCR
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Fong,et al.(1997)
17 NSCLC(CL)
88% LOH，PCR；77%，RT-PCR
Fong,et al.(1997)
8 SCLC(T)
100% LOH，PCR
Fong,et al.(1997)
108 NSCLC(T)
45% LOH，PCR；59%，RT-PCR
Fong,et al.(1997)
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8 CIS
6/8(75) LOH，PCR
Fong,et al.(1997)
106 NSCLC(T)
38% LOH，PCR
Burke,et al.(1998)
51 BAC(T)
22/51(43) LOH，PCR
Marchetti,et al.(1998)
105 NSCLC(T)
36/105(34)，Immunohistochemical methods
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Tomizawa,et al.(1998)
NSCLC(T)
73%，Immunohistochemical methods
Sozzi,et al.(1998)
Precancerous
93%,Immunohistochemical methods
Sozzi,et al.(1998)
lesions
88 primary lung
59% and 35%，RT-PCR
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Tokuchi,et al.(1999)
cancers and paired
normal lung tissues
22 normal control
64%，RT-PCR
Tokuchi,et al.(1999)
lung tissues
T：Tumors；CL：Cell line；CIS：Carcinoma in situ；RT-PCR：Reverse transcription-polymerase chain reaction；LOH：Loss of heterozygosity；SB：Southern Blot；DNA-PCR：Genomic polymerase chain reaction.因的重排，对于检测DNA或RNA而未发现FHIT基因异常的肺癌而言，采用免疫组化法检测FHIT基因蛋白的表达可能是一种较好的方法。 1996年，Yanagisawa等[23]观察24株NSCLC细胞株，发现7株细胞存在FHIT表达异常、LOH和基因内的纯合缺失。1997年，Fong等[2]对原发性肺癌组织、细胞株和癌前支气管病变的FHIT基因进行了分析，结果显示绝大多数肺癌存在FHIT/FRA3B等位基因缺失和转录表达的异常(原位癌亦存在FHIT基因异常)，证实FHIT/FRA3B异常与肺癌的发生有密切关系。经Northern Blot分析显示肿瘤细胞仅有FHIT基因mRNA的野生型低表达或异常表达。
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综上所述，FHIT基因在肺癌中的频发异常多由于包含易被致癌物质诱导断裂的易碎片段FRA3B所致。诸如呼吸道和消化道的肿瘤，由于常暴露于致癌剂中，FHIT基因多有异常改变。尤其是肺癌，各种化学物质诸如烟草等可直接干扰DNA的复制，导致基因的异常。1996年，Virgilio等[24]的研究提示由于吸烟、饮酒等外在致癌剂的作用，在肺部、、头颈部和消化道的肿瘤中，FHIT基因的异常发生频率最高。
1997年，Sozzi等[25]研究吸烟与FHIT基因微卫星灶(D3S1300、D3S4103、D3S1234)的关系发现：吸烟组中80%(41/51)存在FHIT基因的一个或多个微卫星灶的LOH，而不吸烟组仅有23%(9/40)(P<0.001)，而其它染色体上的微卫星灶(如D10S197、D3S1339等)则未发现诸如此类的变化，从而提示：FHIT基因可能是烟草致肺癌的靶点，而且可能是肺癌发生学上的早期分子现象，检测FHIT基因微卫星灶有助于重度吸烟人群早期肺癌的预测。相似的结论也出现在1998年Nelson等的报道中[26]。1998年，Tomizawa等[27]对105例Ⅰ期NSCLC组织进行了免疫组化检测，结果示34%(36/105)肿瘤组织FHIT基因蛋白表达明显降低，且不同组织类型肺癌中FHIT蛋白降低的百分率不同，在肺鳞癌中有86%(24/28)FHIT蛋白表达降低，而腺癌仅有10%(7/67)的降低(P<0.001)；吸烟组中40%(32/80)存在FHIT蛋白表达降低，而不吸烟组仅有16%(4/25，P＝0.013)，结果示FHIT基因改变主要发生在肺鳞癌和吸烟患者中。进一步随访发现，在Ⅰ期NSCLC患者中，FHIT蛋白低表达患者预后明显较FHIT蛋白表达正常的患者差，从而也提示FHIT基因的异常与肺癌患者的预后有关。1998年，Sozzi等[28]也对NSCLC进行免疫组化检测，结果示73%NSCLC和93%的癌前病变有FHIT蛋白的表达降低，且肺鳞癌中FHIT蛋白降低发生率(87%)明显高于腺癌(57%)(P<0.0001)，吸烟组亦明显高于不吸烟组(75% versus 39%)(P<0.005)。这进一步证实了FHIT基因异常在控制支气管上皮细胞的转化中起重要作用，且检测FHIT蛋白有助于早期肺癌的诊断。
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然而，FHIT基因在肺癌中的研究也有不一致的意见。1999年，Tokuchi等[29]用RT-PCR方法发现在88例原发性肺癌和其相应正常肺组织中，59%的肺癌和35%相应正常肺组织有FHIT基因的转录异常，而22例正常肺组织中亦有64%存在FHIT基因转录异常，提示FHIT基因转录本异常不仅存在于肿瘤组织中，亦存在于正常组织中，从而认为FHIT基因转录本异常是由于转录过程中错误的拼接和加工造成，而且FHIT基因转录本异常仅是结构的改变而不是基因功能上的变化。
5 展望
肿瘤中FHIT基因异常的发现是将易脆位点的不稳定性与肿瘤联系起来的第一个分子事件[30]。由于不同的肿瘤组织和肿瘤细胞株中FHIT基因的频发均异常，所以FHIT基因被拟定为一个抑癌基因而在各种组织的肿瘤中得到广泛的研究，FHIT基因的异常也成为肿瘤发生过程中最常见的一个遗传学改变。FHIT蛋白具有脱氢酶的活性，在细胞应激的应答中起重要作用。FHIT基因的异常必将导致FHIT蛋白的缺乏或功能的丧失而影响细胞的应激，而这种影响又是肿瘤发生学中的早期分子事件。对FHIT蛋白的功能研究和体内将野生型FHIT基因导入有FHIT基因异常的癌前病变组织和肺癌组织中来逆转肿瘤细胞的研究，将证实FHIT基因是否是一个抑癌基因，而且也将为肿瘤的基因治疗提供新的策略。
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本课题受国家自然科学基金(39870299)资助
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