PCNA和nm23基因在肺癌中的表达及其临床意义
作者：赵行远 夏传生 刘运芳 吴建平
单位：赵行远 夏传生 刘运芳(解放军第457医院肿瘤科 武汉，430012)；吴建平(湖北省肿瘤医院)
关键词：
中国肺癌杂志000116
增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是反映细胞增殖分数和所处周期的客观指标，亦可用于判断恶性肿瘤的程度与预后[1]。已在多种人体肿瘤中检测出PCNA的高表达[2，3]。nm23被认为是一种癌转移抑制基因，由Steeg[4]1988年在鼠K-1735黑色素瘤中发现。目前，在人类已发现几种nm23基因，研究最多的是nm23-H1和nm23-H2[5]。早期研究显示其对癌细胞的运动能力和转移潜能有抑制作用。为探讨PCNA和nm23基因在肺癌发生、发展及转移过程中的作用，本实验采用免疫组织化学SABC法(Strept Avidin-Biotin enzyme Complet)检测了不同部位和不同性质肺组织中的PCNA和nm23基因的表达情况，并分析了上述基因表达与肺癌生物学行为的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集1995～1998年肺癌手术标本483例，经单纯随机抽样得到本组实验样本。肺癌癌旁组织12例，原发性肺癌78例。肺癌病例中，男56例，女22例，年龄34～71岁，平均56.1岁。全部病例标本均经HE染色，光镜检查证实为肺癌，其中鳞癌52例，腺癌20例，小细胞肺癌6例。72例非小细胞肺癌中，高分化22例，中分化19例，低分化31例。同时收集原发性肺癌转移淋巴结17例。全部标本采用常规福尔马林固定，石蜡包埋，切5?μm厚片备用，每例切片5张。
1.2 实验方法 免疫组织化学方法使用SABC法，所有试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司(Vetor产品)。具体方法如下：①切片常规脱蜡至水；②3%H2O2室温灭活内源性过氧化物酶5～10?min，蒸馏水洗3次；③微波抗原修复：切片浸入0.01?mol/L PBS、pH?7.2～7.4的磷酸盐缓冲液中，微波炉中加热至100℃，10?min，冷却后再加热至100℃?20?min，冷却；④滴加抗原修复液，室温10?min，PBS冲洗3次；⑤血清封闭，室温10?min；⑥滴加即用型一抗nm23、PCAN，25～35℃ 2?h，PBS洗2?min×3次。用PBS代替一抗作阴性对照，用已证明阳性的乳腺癌作阳性对照；⑦滴加生物素化山羊抗鼠IgG，25～35℃，20?min，0.01?mol/L PBS洗2?min×3次；⑧滴加试剂SABC，25～35℃ 20?min，0.01?mol/L PBS 5?min×4次(根据染色背景，洗涤时间可适当增减)；⑨DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。
, 百拇医药
1.3 结果判断 以细胞核呈清晰棕黄色为阳性(图1、2)。实验中统一PCNA和nm23阳性表达计数方法，随机计数5个高倍视野癌细胞(约500个)，计算平均阳性细胞率，分为Ⅰ～Ⅳ级，阳性细胞数<25%为Ⅰ级，≥25%且<50%为Ⅱ级，≥50%且<75%为Ⅲ级，≥75%为Ⅳ级。
图1 肺癌组织中PCNA的表达 SABC法 ×20
Fig 1 Expression of PCNA in lung cancer tissue by immunohistochemistry SABC method ×20
图2 肺癌组织中nm23的表达 SABC法 ×20
, 百拇医药
Fig 2 Expression of nm23 in lung cancer tissue by immunohistochemistry SABC method ×20
1.4 统计学处理 全部资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 PCNA表达水平的比较 癌旁组织中PCNA阳性表达Ⅲ+Ⅳ级占16.67%，而78例肺癌和17例肺癌转移淋巴结中，PCNAⅢ+Ⅳ级阳性表达率分别为62.82%(49/78)和76.47%(13/17)，两组与癌旁组织比较均有显著性差异(P均<0.05)。不同组织学类型肺癌组间无显著差异(P>0.05)(表1)。在不同细胞分化程度肺癌组织中，高分化组中Ⅲ+Ⅳ级占18.18%，中分化组为63.16%，低分化组为93.55%，各组间均有非常显著差异(P均<0.01)(表2)。
, 百拇医药
2.2 nm23表达水平的比较 从表1可见，nm23阳性表达Ⅲ+Ⅳ级在肺癌各组织学类型间无显著差异(P>0.05)，肺癌组与癌旁组织比较差异有显著性(P<0.05)。nm23表达水平与癌细胞分化程度有密切关系(P<0.01)(表2)。
表1 不同组织PCNA、nm23基因的表达
Tab 1 Relative expressions of PCNA and nm23 genes in different tissues Tissues
n
PCNA
nm23
Ⅰ
Ⅱ
, 百拇医药
Ⅲ
Ⅳ
Ⅲ+Ⅳ(%)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅲ+Ⅳ(%)
Paracancerous tissues
12
4
6
1
, 百拇医药
1
2(16.67)a
0
2
6
4
10(83.33)d
Squamous cell carcinoma
52
7
12
17
, 百拇医药
16
33(63.46)b
12
19
11
10
21(40.38)e
Adenocarcinoma
20
3
5
8
, 百拇医药 4
12(60)c
4
9
5
2
7(35)e
Small cell lung cancer
6
0
2
3
1
, 百拇医药
4(66.67)c
1
3
2
0
2(33.33)f
Metastatic lymph nodes
17
1
3
9
4
, http://www.100md.com 13(76.47)b
3
8
4
2
6(35.29)f
a vs b,d vs e,P<0.01；a vs c,d vs f,P<0.05表2 非小细胞肺癌细胞分化程度与PCNA、nm23基因表达的关系
Tab 2 Relationship between differentiation grade and PCNA,nm23 genes expression in non-small cell lung cancer Differentiation grade
, 百拇医药
n
PCNA
nm23
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅲ+Ⅳ(%)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅲ+Ⅳ(%)
Well
, http://www.100md.com
22
9
9
3
1
4(18.18)a
1
2
9
10
19(86.36)d
Moderate
19
, 百拇医药
1
6
8
4
12(63.16)b
5
9
3
2
5(26.32)e
Poor
31
0
, 百拇医药
2
14
15
29(93.55)c
10
17
4
0
4(12.90)f
a vs b vs c,d vs e vs f,P<0.01
3 讨论
PCNA是DNA聚合酶δ的辅助因子，在DNA复制、细胞增殖及细胞周期调控中发挥重要作用。PCNA在许多肿瘤组织中都有高表达，其表达程度随肿瘤浸润深度增加及转移呈明显上升趋势[1]。Sakakura等[6]用18-mer PCNA反义OPN抑制了多种胃癌细胞系的生长，提示PCNA与肿瘤发生发展关系密切。PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助因子，不仅在DNA复制中起到关键作用，而且来自细胞内外的增殖信号都必须经过PCNA的参与，才能引发DNA的合成。众多研究表明，PCNA在几乎所有肿瘤组织中均有高表达[7]。Maeda等[1]在对胃癌的研究中发现，PCNA阳性细胞比例>50%者，其临床分期与预后明显差于小于50%者。在对乳腺癌、肝癌、肾盂输尿管癌的研究中也得到了相似的结果。本实验78例肺癌组织中，PCNA阳性表达Ⅲ、Ⅳ级49例，占62.82%；17例转移淋巴结组织中，Ⅲ、Ⅳ级13例，占76.47%。统计学处理表明，肺癌不同组织学类型间(包括转移淋巴结组)PCNA Ⅲ+Ⅳ级阳性表达率无显著差异(P>0.05)，说明其与肿瘤组织学类型无关。癌细胞高分化组中PCNA阳性表达Ⅲ+Ⅳ级占18.18%，中分化组为63.16%，低分化组为93.55%(P<0.01)，提示PCNA明显增高可能是低分化肺癌组织增殖能力强于高分化肺癌组织的物质基础。
, http://www.100md.com
nm23基因定位于人染色体17q21.3[8]，其蛋白质产物为核苷二磷酸激酶(NDPK)，早期研究显示其对癌细胞株的运动能力和转移潜能有抑制作用，被认为是一种癌转移抑制基因。有人发现NDPK至少有两个主要功能在细胞生长、肿瘤转移中发挥作用：①通过催化GTPGDP的转化，参与微管蛋白的聚合与解聚；②通过影响G蛋白来调节细胞内的信号传递[9]。在人乳腺癌、肝癌、胃癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌等恶性肿瘤中，nm23基因表达降低与肿瘤转移特性相关。但在以后各种临床肿瘤的广泛研究中，结果差异较大，支持和不支持其转移抑制特性的观点并存[10]。本实验通过对78例肺癌、17例肺癌淋巴结转移组织进行检测，发现nm23阳性表达率在肺癌不同组织类型及肺癌淋巴结转移组间无显著差异(P>0.05)，而在肺癌不同细胞分化程度组间存在非常显著差异(P<0.01)。因此，本实验结果表明，nm23基因在肺癌中未能显示抑制癌转移的作用，而支持nm23基因表达降低与肺癌组织低分化程度相关的观点，这与刘伦旭等[10，11]实验结果一致。
, 百拇医药
联合检测PCNA和nm23基因结果显示：PCNA和nm23基因与肺癌的发生发展及组织分化程度有密切关系，与组织学类型及转移与否无明显关系。我们认为，联合检测PCNA和nm23基因的表达情况，将有助于进一步认识肿瘤的发生、发展及恶性程度。
参考文献
1，Maeda K,Chung YS,Onoda N,et al.Proliferating cell nuclear antigen labeling index of preoperative specimens in gastric carcinoma with special reference to prognosis.Cancer,1994,73(3)∶528-533.
2，Aaltomaa S,Lipponer P,Syrianen K.Prognostic value of cell proliferation in breast cancer as determined by proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunostaining.Anticancer Res,1992,12(4)∶1281.
, http://www.100md.com
3，Mayer A,Takimoto M,Fritz E,et al.The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen,epidermal growth factor receptor and mdr gene expression in colorectal cancer.Cancer,1993,71(8)∶2454.
4，Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastasis potential.J Natl Cancer Inst,1988,80(3)∶200-204.
5，Stahl JA,Leone A,Rosengard AM,et al.Identification of a second human nm23 gene,nm23-H2.Cancer Res,1991,51(1)∶445-449.
, 百拇医药
6，Sakakura C,Hagiwara A,Tsujimotok,et al.Inhibition of gastric cancer cell proliferation by antisense oligonucleotides targeting the messenger RNA encoding proliferating cell nuclear antigen.Br J Cancer,1994,70(6)∶1060-1066.
7，Wietheqe T,Voss B,Muller KM.p53 accumulation and proliferating cell nuclear antigen expression in human lung cancer.J Cancer Res Clin Oncol,1995,121(4)∶371-377.
8，Gilles AM,Presecan E,Vonica A,et al.Nucleoside diphosphate kinase from human erythrocytes.J Biol Chem,1991,266(14)∶8784-8789.
, 百拇医药
9，Liotta LA,Steeg PS.Clues to the function of nm23 and Awd proteins in development,signal transtuction and tumor metastasis provided by studies of dictyostelium discoideum.J Natl Cancer Inst,1990,82(14)∶1170-1172.
10，刘伦旭，周清华，石应康，等.Northern印迹杂交分析nm23基因在人肺癌中的表达研究.中华肿瘤杂志，1998，20(5)∶342-344.
11，刘伦旭，周清华，石应康，等.癌转移抑制基因nm23在人肺癌中的转录表达研究.肺癌杂志，1999，2(1)∶1-4.
收稿日期：1999-06-28
修回日期：1999-12-30, 百拇医药
单位：赵行远 夏传生 刘运芳(解放军第457医院肿瘤科 武汉，430012)；吴建平(湖北省肿瘤医院)
关键词：
中国肺癌杂志000116
增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是反映细胞增殖分数和所处周期的客观指标，亦可用于判断恶性肿瘤的程度与预后[1]。已在多种人体肿瘤中检测出PCNA的高表达[2，3]。nm23被认为是一种癌转移抑制基因，由Steeg[4]1988年在鼠K-1735黑色素瘤中发现。目前，在人类已发现几种nm23基因，研究最多的是nm23-H1和nm23-H2[5]。早期研究显示其对癌细胞的运动能力和转移潜能有抑制作用。为探讨PCNA和nm23基因在肺癌发生、发展及转移过程中的作用，本实验采用免疫组织化学SABC法(Strept Avidin-Biotin enzyme Complet)检测了不同部位和不同性质肺组织中的PCNA和nm23基因的表达情况，并分析了上述基因表达与肺癌生物学行为的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集1995～1998年肺癌手术标本483例，经单纯随机抽样得到本组实验样本。肺癌癌旁组织12例，原发性肺癌78例。肺癌病例中，男56例，女22例，年龄34～71岁，平均56.1岁。全部病例标本均经HE染色，光镜检查证实为肺癌，其中鳞癌52例，腺癌20例，小细胞肺癌6例。72例非小细胞肺癌中，高分化22例，中分化19例，低分化31例。同时收集原发性肺癌转移淋巴结17例。全部标本采用常规福尔马林固定，石蜡包埋，切5?μm厚片备用，每例切片5张。
1.2 实验方法 免疫组织化学方法使用SABC法，所有试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司(Vetor产品)。具体方法如下：①切片常规脱蜡至水；②3%H2O2室温灭活内源性过氧化物酶5～10?min，蒸馏水洗3次；③微波抗原修复：切片浸入0.01?mol/L PBS、pH?7.2～7.4的磷酸盐缓冲液中，微波炉中加热至100℃，10?min，冷却后再加热至100℃?20?min，冷却；④滴加抗原修复液，室温10?min，PBS冲洗3次；⑤血清封闭，室温10?min；⑥滴加即用型一抗nm23、PCAN，25～35℃ 2?h，PBS洗2?min×3次。用PBS代替一抗作阴性对照，用已证明阳性的乳腺癌作阳性对照；⑦滴加生物素化山羊抗鼠IgG，25～35℃，20?min，0.01?mol/L PBS洗2?min×3次；⑧滴加试剂SABC，25～35℃ 20?min，0.01?mol/L PBS 5?min×4次(根据染色背景，洗涤时间可适当增减)；⑨DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。
, 百拇医药
1.3 结果判断 以细胞核呈清晰棕黄色为阳性(图1、2)。实验中统一PCNA和nm23阳性表达计数方法，随机计数5个高倍视野癌细胞(约500个)，计算平均阳性细胞率，分为Ⅰ～Ⅳ级，阳性细胞数<25%为Ⅰ级，≥25%且<50%为Ⅱ级，≥50%且<75%为Ⅲ级，≥75%为Ⅳ级。
图1 肺癌组织中PCNA的表达 SABC法 ×20
Fig 1 Expression of PCNA in lung cancer tissue by immunohistochemistry SABC method ×20
图2 肺癌组织中nm23的表达 SABC法 ×20
, 百拇医药
Fig 2 Expression of nm23 in lung cancer tissue by immunohistochemistry SABC method ×20
1.4 统计学处理 全部资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 PCNA表达水平的比较 癌旁组织中PCNA阳性表达Ⅲ+Ⅳ级占16.67%，而78例肺癌和17例肺癌转移淋巴结中，PCNAⅢ+Ⅳ级阳性表达率分别为62.82%(49/78)和76.47%(13/17)，两组与癌旁组织比较均有显著性差异(P均<0.05)。不同组织学类型肺癌组间无显著差异(P>0.05)(表1)。在不同细胞分化程度肺癌组织中，高分化组中Ⅲ+Ⅳ级占18.18%，中分化组为63.16%，低分化组为93.55%，各组间均有非常显著差异(P均<0.01)(表2)。
, 百拇医药
2.2 nm23表达水平的比较 从表1可见，nm23阳性表达Ⅲ+Ⅳ级在肺癌各组织学类型间无显著差异(P>0.05)，肺癌组与癌旁组织比较差异有显著性(P<0.05)。nm23表达水平与癌细胞分化程度有密切关系(P<0.01)(表2)。
表1 不同组织PCNA、nm23基因的表达
Tab 1 Relative expressions of PCNA and nm23 genes in different tissues Tissues
n
PCNA
nm23
Ⅰ
Ⅱ
, 百拇医药
Ⅲ
Ⅳ
Ⅲ+Ⅳ(%)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅲ+Ⅳ(%)
Paracancerous tissues
12
4
6
1
, 百拇医药
1
2(16.67)a
0
2
6
4
10(83.33)d
Squamous cell carcinoma
52
7
12
17
, 百拇医药
16
33(63.46)b
12
19
11
10
21(40.38)e
Adenocarcinoma
20
3
5
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12(60)c
4
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2
7(35)e
Small cell lung cancer
6
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2
3
1
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4(66.67)c
1
3
2
0
2(33.33)f
Metastatic lymph nodes
17
1
3
9
4
, http://www.100md.com 13(76.47)b
3
8
4
2
6(35.29)f
a vs b,d vs e,P<0.01；a vs c,d vs f,P<0.05表2 非小细胞肺癌细胞分化程度与PCNA、nm23基因表达的关系
Tab 2 Relationship between differentiation grade and PCNA,nm23 genes expression in non-small cell lung cancer Differentiation grade
, 百拇医药
n
PCNA
nm23
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅲ+Ⅳ(%)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅲ+Ⅳ(%)
Well
, http://www.100md.com
22
9
9
3
1
4(18.18)a
1
2
9
10
19(86.36)d
Moderate
19
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1
6
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4
12(63.16)b
5
9
3
2
5(26.32)e
Poor
31
0
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2
14
15
29(93.55)c
10
17
4
0
4(12.90)f
a vs b vs c,d vs e vs f,P<0.01
3 讨论
PCNA是DNA聚合酶δ的辅助因子，在DNA复制、细胞增殖及细胞周期调控中发挥重要作用。PCNA在许多肿瘤组织中都有高表达，其表达程度随肿瘤浸润深度增加及转移呈明显上升趋势[1]。Sakakura等[6]用18-mer PCNA反义OPN抑制了多种胃癌细胞系的生长，提示PCNA与肿瘤发生发展关系密切。PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助因子，不仅在DNA复制中起到关键作用，而且来自细胞内外的增殖信号都必须经过PCNA的参与，才能引发DNA的合成。众多研究表明，PCNA在几乎所有肿瘤组织中均有高表达[7]。Maeda等[1]在对胃癌的研究中发现，PCNA阳性细胞比例>50%者，其临床分期与预后明显差于小于50%者。在对乳腺癌、肝癌、肾盂输尿管癌的研究中也得到了相似的结果。本实验78例肺癌组织中，PCNA阳性表达Ⅲ、Ⅳ级49例，占62.82%；17例转移淋巴结组织中，Ⅲ、Ⅳ级13例，占76.47%。统计学处理表明，肺癌不同组织学类型间(包括转移淋巴结组)PCNA Ⅲ+Ⅳ级阳性表达率无显著差异(P>0.05)，说明其与肿瘤组织学类型无关。癌细胞高分化组中PCNA阳性表达Ⅲ+Ⅳ级占18.18%，中分化组为63.16%，低分化组为93.55%(P<0.01)，提示PCNA明显增高可能是低分化肺癌组织增殖能力强于高分化肺癌组织的物质基础。
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nm23基因定位于人染色体17q21.3[8]，其蛋白质产物为核苷二磷酸激酶(NDPK)，早期研究显示其对癌细胞株的运动能力和转移潜能有抑制作用，被认为是一种癌转移抑制基因。有人发现NDPK至少有两个主要功能在细胞生长、肿瘤转移中发挥作用：①通过催化GTPGDP的转化，参与微管蛋白的聚合与解聚；②通过影响G蛋白来调节细胞内的信号传递[9]。在人乳腺癌、肝癌、胃癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌等恶性肿瘤中，nm23基因表达降低与肿瘤转移特性相关。但在以后各种临床肿瘤的广泛研究中，结果差异较大，支持和不支持其转移抑制特性的观点并存[10]。本实验通过对78例肺癌、17例肺癌淋巴结转移组织进行检测，发现nm23阳性表达率在肺癌不同组织类型及肺癌淋巴结转移组间无显著差异(P>0.05)，而在肺癌不同细胞分化程度组间存在非常显著差异(P<0.01)。因此，本实验结果表明，nm23基因在肺癌中未能显示抑制癌转移的作用，而支持nm23基因表达降低与肺癌组织低分化程度相关的观点，这与刘伦旭等[10，11]实验结果一致。
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联合检测PCNA和nm23基因结果显示：PCNA和nm23基因与肺癌的发生发展及组织分化程度有密切关系，与组织学类型及转移与否无明显关系。我们认为，联合检测PCNA和nm23基因的表达情况，将有助于进一步认识肿瘤的发生、发展及恶性程度。
参考文献
1，Maeda K,Chung YS,Onoda N,et al.Proliferating cell nuclear antigen labeling index of preoperative specimens in gastric carcinoma with special reference to prognosis.Cancer,1994,73(3)∶528-533.
2，Aaltomaa S,Lipponer P,Syrianen K.Prognostic value of cell proliferation in breast cancer as determined by proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunostaining.Anticancer Res,1992,12(4)∶1281.
, http://www.100md.com
3，Mayer A,Takimoto M,Fritz E,et al.The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen,epidermal growth factor receptor and mdr gene expression in colorectal cancer.Cancer,1993,71(8)∶2454.
4，Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastasis potential.J Natl Cancer Inst,1988,80(3)∶200-204.
5，Stahl JA,Leone A,Rosengard AM,et al.Identification of a second human nm23 gene,nm23-H2.Cancer Res,1991,51(1)∶445-449.
, 百拇医药
6，Sakakura C,Hagiwara A,Tsujimotok,et al.Inhibition of gastric cancer cell proliferation by antisense oligonucleotides targeting the messenger RNA encoding proliferating cell nuclear antigen.Br J Cancer,1994,70(6)∶1060-1066.
7，Wietheqe T,Voss B,Muller KM.p53 accumulation and proliferating cell nuclear antigen expression in human lung cancer.J Cancer Res Clin Oncol,1995,121(4)∶371-377.
8，Gilles AM,Presecan E,Vonica A,et al.Nucleoside diphosphate kinase from human erythrocytes.J Biol Chem,1991,266(14)∶8784-8789.
, 百拇医药
9，Liotta LA,Steeg PS.Clues to the function of nm23 and Awd proteins in development,signal transtuction and tumor metastasis provided by studies of dictyostelium discoideum.J Natl Cancer Inst,1990,82(14)∶1170-1172.
10，刘伦旭，周清华，石应康，等.Northern印迹杂交分析nm23基因在人肺癌中的表达研究.中华肿瘤杂志，1998，20(5)∶342-344.
11，刘伦旭，周清华，石应康，等.癌转移抑制基因nm23在人肺癌中的转录表达研究.肺癌杂志，1999，2(1)∶1-4.
收稿日期：1999-06-28
修回日期：1999-12-30, 百拇医药