肺癌细胞的HLA抗原表达与组织类型及免疫修饰
作者：马晓春 胡雪君 张玲 康健 于润江
单位：马晓春 胡雪君 张玲 康健 于润江(中国医科大学呼吸疾病研究所 沈阳，110001)
关键词：HLA抗原；γ-干扰素；肺肿瘤
中国肺癌杂志000114 【摘要】目的 了解肺癌细胞的HLA抗原表达及肺癌的组织类型和免疫修饰对其的影响。方法 采用免疫组织化学方法和流式细胞术从体内外探讨肺癌组织的HLA-DR抗原表达。结果 在56例病理确诊的肺癌患者癌组织中，腺癌76%(22/29)，鳞癌8%(2/24)表现为HLA-DR抗原阳性，而3例小细胞癌均为阴性。腺癌的阳性率明显高于鳞癌和小细胞癌(P<0.05)。HLA-DR抗原阳性癌细胞周围可见较多的淋巴细胞浸润，二者呈明显的正相关(P<0.05)。HLA-DR抗原表达与患者的临床分期间未见明显相关。体外实验证明γ-干扰素能明显刺激肺癌细胞株的HLA-DR抗原表达，并呈明显的浓度依赖。结论 HLA抗原的表达与肺癌的组织分型及局部免疫状况明显相关，可能影响宿主对肿瘤的免疫反应。
, 百拇医药
Expression of HLA-DR antigen in lung cancer
MA Xiaochun,HU Xuejun,ZHANG Ling,KANG Jian,YU Runjiang
(The Institute of Respiratory Disease,China Medical University,Shenyang 110001,P.R.China)
【Abstract】Objective To investigate the expression of HLA-DR antigen in lung cancer and the relationship with histologic types and lymphocyte infiltration around tumor cells.Methods Cancer tissues from 56 patients with lung cancer were examined immunohistochemically,while the expression of HLA-DR antigen induced by recombinant IFN-gamma in two cells lines of lung cancer was examined with flowcytometry.Results Twenty two cases of adenocarcinoma (22/29，76%) and two cases of squamous cell carcinoma (2/24,8%) were positive for the HLA-DR antigen,and no positive expression showed in 3 cases of small cell carcinoma.The positive expression rate in adenocarcinoma was significantly higher than that in squamous cell carcinoma (P<0.05).Marked lymphocyte infiltration was seen around the tumor cells in HLA-DR antigen positive patients.In vitro,IFN-gamma could stimulate HLA-DR antigen expression in two lung cancer cell lines,which was dose-dependent.Conclusion The expression of HLA-DR antigen in lung cancer is correlated with histologic types and lymphocyte infiltration around the cancer cells ,and may influence the host immune response to tumor.
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【Key words】LHA IFN-gamma Lung neoplasms
HLA-DR抗原是人类白细胞抗原(HLA)D片段上的膜糖蛋白，主要表达在B淋巴细胞、巨噬细胞及一些间质细胞[1]。它在T淋巴细胞对抗原的免疫反应调控上扮演重要的角色。近年的研究证明人的消化道肿瘤、黑色素瘤、咽喉部肿瘤、乳腺肿瘤等亦部分表现为HLA-DR抗原阳性[2～5]。在胃癌及乳腺癌中HLA-DR抗原的表达与肿瘤周围的淋巴细胞浸润明显相关[2，5]，提示HLA-DR抗原的表达可能影响宿主的抗肿瘤免疫反应。为了探讨肺癌组织是否表达HLA抗原，其表达水平与肺癌组织类型的关系，以及HLA是否影响肿瘤组织周围的免疫环境等问题，我们应用免疫组织化学方法及流式细胞术检测肺癌细胞中HLA抗原的表达，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 病例资料 经病理确诊的肺癌患者56例，男性43例，年龄(63±8.1)岁；女性13例，年龄(61.62±7.27)岁。按WHO 1986年TNM分期标准，Ⅰ期19例，Ⅱ期4例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例；按WHO 1976年的组织分型标准，鳞癌24例，腺癌29例，小细胞癌3例。
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1.2 组织标本 肺癌组织均取于外科术后标本，用10%福尔马林固定，24～42?h后用石腊包埋做成5?μm的连续切片。
1.3 免疫组织化学染色 采用ABC法，第一抗体为LN3(Cloab,Biotest,DK)。室温下反应12?h。阴性对照为PBS置换第一抗体，阳性对照为B细胞。在高倍镜下分别观察4个视野，根据HLA-DR阳性细胞的数量将染色强度分为4个等级，大于80%为，50%～79%为，10%～49%为+，小于10%为阴性。淋巴细胞浸润分为3等，轻度的局部浸润为+，中度弥漫性浸润为，重度的弥漫浸润伴有明显的淋巴滤泡形成为。
1.4 流式细胞计数 实验所用的肺癌细胞有2株，ABC(腺癌)，SBC(鳞癌)，均由日本国立癌中心提供。MEN+5%FCS作为培养基，常规培养。每皿中含细胞5×105，加入γ-干扰素(SHIONOGI产品)1～1?000?u/ml，24?h后用PBS洗净，冰浴下添加第一抗体(IOT2，Cosmobio产品)，反应20?min，PBS洗净后再与免疫荧光标记后的第二抗体(Sigma产品)反应20?min，PBS洗净后用流式细胞仪(FACScan)测定细胞的HLA-DR阳性率。
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1.5 数据处理 统计学处理采用χ2检验，P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 肺癌组织中HLA-DR抗原表达水平 56例肺癌组织中有24例表现为HLA-DR抗原染色阳性，阳性率为43%(24/56)，其中腺癌阳性率为76%(22/29)，明显高于鳞癌(2/24，8%)(P<0.05)，3例小细胞癌均未检测到HLA-DR抗原。
2.2 HLA-DR抗原表达与肺癌病理分期的关系 Ⅰ期肺癌的HLA-DR抗原表达阳性率为32%(6/19)，Ⅱ期为50%(2/4)，Ⅲ期为41%(9/22)，Ⅳ期为64%(7/11)。抗原阳性表达率在不同病期肺癌组间均无显著性差异(P>0.05)。
2.3 HLA-DR抗原表达与肿瘤周围淋巴细胞浸润强度的关系 HLA抗原阳性染色强度与肿瘤组织淋巴细胞浸润强度有明显关系(P<0.05)(表1)。
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表1 HLA-DR抗原表达与淋巴细胞浸润的关系
Tab 1 Correlation between HLA-DR antigen expression
and lymphocyte infiltration HLA-DR expression degree
Degree of lymphocyte infiltration
+
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21
11
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0
+
1
6
2
1
1
4
0
2
7
2.4 γ-干扰素对肺癌细胞HLA抗原表达的影响 在体外培养的肺癌细胞株中添加γ-干扰素可明显增加HLA-DR抗原的表达，其表达阳性率与γ-干扰素浓度呈明显的剂量依赖性(图1)。
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图1 γ-干扰素诱导的人肺癌细胞HLA-DR抗原表达
Fig 1 Induction of HLA-DR antigen in human lung cancer cells by IFN-gamma
3 讨论
HLA-DR抗原是HLA-Ⅱ抗原族中的一员，它参与细胞毒性T淋巴细胞和T辅助淋巴细胞的活化和免疫应答的调控。癌组织中HLA-DR的表达并非均一，其表达的阳性率与癌组织类型明显相关[5]。胃癌的阳性率可达67%，其中分化型腺癌可高达80%[2]。本研究中肺癌细胞的HLA-DR抗原表达阳性率为43%，其中腺癌的阳性率为76%，明显高于鳞癌和小细胞癌。本研究观察到HLA-DR抗原染色较强的癌细胞周围有较多的淋巴细胞浸润，而体外实验证实γ-干扰素可明显增加肺癌细胞HLA-DR抗原的表达。由此可以推测，由于淋巴细胞的浸润释放出的如γ-干扰素之类的淋巴因子引起了肺癌细胞的HLA-DR抗原表达。然而，部分病例癌组织中虽有较多的淋巴细胞浸润，但却不表达HLA-DR抗原。这说明HLA-DR抗原在肺癌细胞的表达机制是很复杂的，需从多方面进行深入研究。HLA-DR抗原的表达可能受多种因素的影响，除局部免疫环境外，肿瘤自身的基因型也可能扮演重要的角色。
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此研究受辽宁省自然科学基金资助
参考文献
1，Doar AS,Fuggle SV,Fabre JW,et al.The detailed distribution of MHC class Ⅱ antigens in normal human organs.Transplantation,1984,28(3)∶293-298.
2，Ma XC,Hattori T,Kushima R,et al.Expression of HLA-class Ⅱ antigen in gastric carcinomas.Acta Oncolog,1994,33(2)∶187-190.
3，Holzmann B,Brocker EB,Lehmann JM,et al.Tumor progression in human malignant melanoma.Int J Cancer,1987,39(5)∶466-471.
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4，Esteban F,Concha A,Heulin C,et al.Histocompatibility antigens in primary and metastatic squamous cell carcinoma of the larynx.Int J Cancer,1989,43(5)∶436-442.
5，Christina A,Brunner JM,Gokel GR,et al.Expression of HLA-D subloci DR and DQ by breast carcinoma is correlated with distinct parameters of favourable prognosis.Eur J Cancer,1991,27(4)∶411-416.
收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-02-14, http://www.100md.com
单位：马晓春 胡雪君 张玲 康健 于润江(中国医科大学呼吸疾病研究所 沈阳，110001)
关键词：HLA抗原；γ-干扰素；肺肿瘤
中国肺癌杂志000114 【摘要】目的 了解肺癌细胞的HLA抗原表达及肺癌的组织类型和免疫修饰对其的影响。方法 采用免疫组织化学方法和流式细胞术从体内外探讨肺癌组织的HLA-DR抗原表达。结果 在56例病理确诊的肺癌患者癌组织中，腺癌76%(22/29)，鳞癌8%(2/24)表现为HLA-DR抗原阳性，而3例小细胞癌均为阴性。腺癌的阳性率明显高于鳞癌和小细胞癌(P<0.05)。HLA-DR抗原阳性癌细胞周围可见较多的淋巴细胞浸润，二者呈明显的正相关(P<0.05)。HLA-DR抗原表达与患者的临床分期间未见明显相关。体外实验证明γ-干扰素能明显刺激肺癌细胞株的HLA-DR抗原表达，并呈明显的浓度依赖。结论 HLA抗原的表达与肺癌的组织分型及局部免疫状况明显相关，可能影响宿主对肿瘤的免疫反应。
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Expression of HLA-DR antigen in lung cancer
MA Xiaochun,HU Xuejun,ZHANG Ling,KANG Jian,YU Runjiang
(The Institute of Respiratory Disease,China Medical University,Shenyang 110001,P.R.China)
【Abstract】Objective To investigate the expression of HLA-DR antigen in lung cancer and the relationship with histologic types and lymphocyte infiltration around tumor cells.Methods Cancer tissues from 56 patients with lung cancer were examined immunohistochemically,while the expression of HLA-DR antigen induced by recombinant IFN-gamma in two cells lines of lung cancer was examined with flowcytometry.Results Twenty two cases of adenocarcinoma (22/29，76%) and two cases of squamous cell carcinoma (2/24,8%) were positive for the HLA-DR antigen,and no positive expression showed in 3 cases of small cell carcinoma.The positive expression rate in adenocarcinoma was significantly higher than that in squamous cell carcinoma (P<0.05).Marked lymphocyte infiltration was seen around the tumor cells in HLA-DR antigen positive patients.In vitro,IFN-gamma could stimulate HLA-DR antigen expression in two lung cancer cell lines,which was dose-dependent.Conclusion The expression of HLA-DR antigen in lung cancer is correlated with histologic types and lymphocyte infiltration around the cancer cells ,and may influence the host immune response to tumor.
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【Key words】LHA IFN-gamma Lung neoplasms
HLA-DR抗原是人类白细胞抗原(HLA)D片段上的膜糖蛋白，主要表达在B淋巴细胞、巨噬细胞及一些间质细胞[1]。它在T淋巴细胞对抗原的免疫反应调控上扮演重要的角色。近年的研究证明人的消化道肿瘤、黑色素瘤、咽喉部肿瘤、乳腺肿瘤等亦部分表现为HLA-DR抗原阳性[2～5]。在胃癌及乳腺癌中HLA-DR抗原的表达与肿瘤周围的淋巴细胞浸润明显相关[2，5]，提示HLA-DR抗原的表达可能影响宿主的抗肿瘤免疫反应。为了探讨肺癌组织是否表达HLA抗原，其表达水平与肺癌组织类型的关系，以及HLA是否影响肿瘤组织周围的免疫环境等问题，我们应用免疫组织化学方法及流式细胞术检测肺癌细胞中HLA抗原的表达，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 病例资料 经病理确诊的肺癌患者56例，男性43例，年龄(63±8.1)岁；女性13例，年龄(61.62±7.27)岁。按WHO 1986年TNM分期标准，Ⅰ期19例，Ⅱ期4例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例；按WHO 1976年的组织分型标准，鳞癌24例，腺癌29例，小细胞癌3例。
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1.2 组织标本 肺癌组织均取于外科术后标本，用10%福尔马林固定，24～42?h后用石腊包埋做成5?μm的连续切片。
1.3 免疫组织化学染色 采用ABC法，第一抗体为LN3(Cloab,Biotest,DK)。室温下反应12?h。阴性对照为PBS置换第一抗体，阳性对照为B细胞。在高倍镜下分别观察4个视野，根据HLA-DR阳性细胞的数量将染色强度分为4个等级，大于80%为，50%～79%为，10%～49%为+，小于10%为阴性。淋巴细胞浸润分为3等，轻度的局部浸润为+，中度弥漫性浸润为，重度的弥漫浸润伴有明显的淋巴滤泡形成为。
1.4 流式细胞计数 实验所用的肺癌细胞有2株，ABC(腺癌)，SBC(鳞癌)，均由日本国立癌中心提供。MEN+5%FCS作为培养基，常规培养。每皿中含细胞5×105，加入γ-干扰素(SHIONOGI产品)1～1?000?u/ml，24?h后用PBS洗净，冰浴下添加第一抗体(IOT2，Cosmobio产品)，反应20?min，PBS洗净后再与免疫荧光标记后的第二抗体(Sigma产品)反应20?min，PBS洗净后用流式细胞仪(FACScan)测定细胞的HLA-DR阳性率。
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1.5 数据处理 统计学处理采用χ2检验，P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 肺癌组织中HLA-DR抗原表达水平 56例肺癌组织中有24例表现为HLA-DR抗原染色阳性，阳性率为43%(24/56)，其中腺癌阳性率为76%(22/29)，明显高于鳞癌(2/24，8%)(P<0.05)，3例小细胞癌均未检测到HLA-DR抗原。
2.2 HLA-DR抗原表达与肺癌病理分期的关系 Ⅰ期肺癌的HLA-DR抗原表达阳性率为32%(6/19)，Ⅱ期为50%(2/4)，Ⅲ期为41%(9/22)，Ⅳ期为64%(7/11)。抗原阳性表达率在不同病期肺癌组间均无显著性差异(P>0.05)。
2.3 HLA-DR抗原表达与肿瘤周围淋巴细胞浸润强度的关系 HLA抗原阳性染色强度与肿瘤组织淋巴细胞浸润强度有明显关系(P<0.05)(表1)。
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表1 HLA-DR抗原表达与淋巴细胞浸润的关系
Tab 1 Correlation between HLA-DR antigen expression
and lymphocyte infiltration HLA-DR expression degree
Degree of lymphocyte infiltration
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2.4 γ-干扰素对肺癌细胞HLA抗原表达的影响 在体外培养的肺癌细胞株中添加γ-干扰素可明显增加HLA-DR抗原的表达，其表达阳性率与γ-干扰素浓度呈明显的剂量依赖性(图1)。
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图1 γ-干扰素诱导的人肺癌细胞HLA-DR抗原表达
Fig 1 Induction of HLA-DR antigen in human lung cancer cells by IFN-gamma
3 讨论
HLA-DR抗原是HLA-Ⅱ抗原族中的一员，它参与细胞毒性T淋巴细胞和T辅助淋巴细胞的活化和免疫应答的调控。癌组织中HLA-DR的表达并非均一，其表达的阳性率与癌组织类型明显相关[5]。胃癌的阳性率可达67%，其中分化型腺癌可高达80%[2]。本研究中肺癌细胞的HLA-DR抗原表达阳性率为43%，其中腺癌的阳性率为76%，明显高于鳞癌和小细胞癌。本研究观察到HLA-DR抗原染色较强的癌细胞周围有较多的淋巴细胞浸润，而体外实验证实γ-干扰素可明显增加肺癌细胞HLA-DR抗原的表达。由此可以推测，由于淋巴细胞的浸润释放出的如γ-干扰素之类的淋巴因子引起了肺癌细胞的HLA-DR抗原表达。然而，部分病例癌组织中虽有较多的淋巴细胞浸润，但却不表达HLA-DR抗原。这说明HLA-DR抗原在肺癌细胞的表达机制是很复杂的，需从多方面进行深入研究。HLA-DR抗原的表达可能受多种因素的影响，除局部免疫环境外，肿瘤自身的基因型也可能扮演重要的角色。
, 百拇医药
此研究受辽宁省自然科学基金资助
参考文献
1，Doar AS,Fuggle SV,Fabre JW,et al.The detailed distribution of MHC class Ⅱ antigens in normal human organs.Transplantation,1984,28(3)∶293-298.
2，Ma XC,Hattori T,Kushima R,et al.Expression of HLA-class Ⅱ antigen in gastric carcinomas.Acta Oncolog,1994,33(2)∶187-190.
3，Holzmann B,Brocker EB,Lehmann JM,et al.Tumor progression in human malignant melanoma.Int J Cancer,1987,39(5)∶466-471.
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4，Esteban F,Concha A,Heulin C,et al.Histocompatibility antigens in primary and metastatic squamous cell carcinoma of the larynx.Int J Cancer,1989,43(5)∶436-442.
5，Christina A,Brunner JM,Gokel GR,et al.Expression of HLA-D subloci DR and DQ by breast carcinoma is correlated with distinct parameters of favourable prognosis.Eur J Cancer,1991,27(4)∶411-416.
收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-02-14, http://www.100md.com