一株TT病毒中国分离株结构区全基因的克隆及序列测定
作者：周育森 董京芳 何忠平 周乙华 王勇 王海涛
单位：周育森 董京芳 何忠平 周乙华 王勇 王海涛(100071 北京，军事医学科学院微生物流行病研究所)
关键词：肝炎病毒；基因；核苷酸序列
中华医学杂志000104 摘 要：目的 克隆和序列测定TT病毒(TTV)中国分离株全基因。方法 采用长片段PCR技术从一例临床非甲-非庚型肝炎病人血清中扩增TTV全基因，获得3个互相重叠的片段，分别长199、3269和434 bp。用标准的分子生物学方法测定这3个片段的序列，从而得到全长TTV基因序列。结果 TTV中国分离株全基因长3 739个核苷酸，含两个开放读码框架。第一个ORF位于589至2 901位核苷酸，编码770个氨基酸；第二个ORF位于107至715位核苷酸，编码202个氨基酸。在该基因A占31.24%，G占22.25%，C占25.54%，T占20.97%。 TTV中国分离株与日本分离株的核苷酸和氨基酸同源性均在94%以上。但在1 380 bp～1 800 bp间，两株间核苷酸同源性为88%，氨基酸同源性仅为81%。该区段可能是一个内部高变区。结论 这一TTV中国株和日本株属同一个基因型。在ORF1区段内可能存在一个内部高变区。
, 百拇医药
Cloning and sequencing of a Chinese complete TTV gene
ZHOU Yusen, DONG Jingfang, HE Zhongping, et al.
(Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, China Academy of Medical Sciences, Beijing 100071，China)
Abstract：Objective To obtain the complete TT virus gene from a Chinese isolate. Methods Long-PCR was performed for amplifying the TTV gene from the serum of a Chinese with non-A to non-G hepatitis. Three overlapped DNA fragments were obtained, which contained 199 bp (1-199), 3 269 bp (38～3 306) and 434 bp (3 306～3 739) separately. These PCR products were sequenced by the standard method. Results The complete TTV gene (named as TTV CHN1)consisting of 3 739 nucleotides contained two ORFs. The first ORF located at 589～2 901 nt, coding 770 amino acids; the second located at 107～715 nt, coding 202 amino acids. In this genome， G is 22.25%,C 25.54%,A 31.26% and T 20.97%. The homology of Chinese and Japanese TTV genes was more than 94% at both nucleotide and amino acid levels. There exists a hyper-variation region (HVR) spanning at 1 380～1 800 bp. In this region, the HVR homology of Chinese and Japanese TTV genes was 88% and 81% at nucleotide and amino acid levels, respectively. Conclusion Chinese and Japanese TTV isolates belong to the same genotype. There exists a hyper-variation region (HVR) spanning at 1 380～1 800 bp.
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Key words：Hepatitis viruses；Gene；Nucleotide sequence▲
病毒性肝炎是危害人类健康的重要因素之一。除甲、乙、丙、丁及戊型肝炎等5种肝炎病毒感染、巨细胞病毒及EB病毒感染外，约有10%～20%的病毒性肝炎病人病因不明[1-3]，这些肝炎简称为非甲非戊型肝炎或隐原性肝炎。1995年美国科学家发现了己型肝炎病毒(HGV)[4，5]。但是，目前的研究表明，这种RNA病毒不是非甲非戊型肝炎主要病原[5，6]。1997年底，日本学者报道了一种与肝功能异常有关的DNA病毒，并将之命名为TT 病毒(TTV)。初步的研究表明，这种病毒可能是一种新的非甲非戊型肝炎的致病病原[7]。
为了解TTV在国内人群中的感染状况，分析TTV的基因结构与特征，建立适合我国人群的诊断方法和必要时为进一步研制预防TTV感染的疫苗， 我们测定了一株中国人TTV全基因序列。
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材料与方法
一、材料
用于克隆TTV基因的病人血清标本采自北京的1例临床诊断为非甲-非庚型肝炎的病人。
二、方法
1.克隆及测序常规材料：克隆载体(T载体)、XL1-Blue菌、Taq酶、dNTPs及T4 DNA连接酶购自华美公司。PCR引物由本院合成。其他试剂及材料为本实验室常规备用。
2.TTV全基因的克隆: 用片段PCR扩增技术扩增克隆TTV全基因并测定其核苷酸序列。其克隆策略见示意图1。
1.38-3 306 bp；2.1-199 bp；3.3 306-3 739 bp
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图1 TTV全基因克隆及序列测定示意图
3.PCR引物设计、扩增：参考日本已发表TTV的全基因序列(AB008394)设计一套引物。所设计合成的下述重叠引物贯穿了参考序列的全序列。引物序列为:P1(1-23)：5′-ATTTGCTACGTCACTAACCACG-3′；P2(3552-3571)： 5′-TGACCCGGAAGATGTTGTCC-3′；P3(39-58)： 5′-AACCGAATGCTATGTCATCC-3′；P4(3306-3325)：5′-TGACCCGGAAGATGTTGTCC-3′。这两对引物P1和P2为外引物，P3和P4为内引物，扩增出3.2 kb的基因片段1(如图1所示)。P1和P5(199-217)：5′-AATTGCCCCTTGACTTCGG-3′，扩增出5′端的基因片段2。采取半巢式PCR扩增TTV 3′端基因片段3：P6(2 885-2 902)：5′-TTCAAATAGC-ACCATAAA-3′和P7(3 719-3 739)：5′-GCCGACGGT-TTTTTGGCGCCT-3′为外引物，P7和P8(3 306-3 571)：5′-GCCATTGGACTCAGGAGCTA-3′为内引物。
, 百拇医药
采用STG试剂盒提取血清病毒DNA，具体方法见文献[8]。PCR的扩增按常规进行。
4.序列测定及分析方法:扩增产物纯化后，直接与T载体(pBluscript-Tvector)连接、转化鉴定、提取质粒DNA。长片段1采用常规方法进行亚克隆测定其序列。用ABI377型自动测序仪测序。
采用CLUSTAWL程序进行多个序列的比较，引物设计及分析使用GOLDKEY和OLIGO中的有关程序。
结果
一、中国人TTV全基因克隆及序列测定结果(图2)
用PCR技术扩增出3个互相重叠的基因片段，包含了ORF1和ORF2全长基因。我们将该株TTV病毒序列命名为TTVCHN1(GenBank注册号AF079173)。该序列全长3 739个核苷酸，有2个开放读码框架。基因组中A占31.24%，G占22.25%，C占25.54%，T占20.97%。
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图2 中国TTV全基因DNA核苷酸序列
二、中国株与日本TTV株核苷酸和氨基酸同源性比较
将测定的序列输入后用BLAST程序工具与GenBank中的序列进行比较。分析结果表明，我国的这一株TTV与日本发表的TTV全基因序列(AB008394)具有很高的同源性。核苷酸同源性大于94%，氨基酸同源性大于96%。表明两者属于同一基因型。 在1 380～1 800 nt间，两株TTV核苷酸和氨基酸的变异较大(图3)，核苷酸同源性为88%，氨基酸同源性为82%。该区可能是TTV的内部高变区。3′端也存在类似的趋势。
图3 中国株和日本株TTV高变区的核苷酸序列比较(NT1 380～1 800间)
讨论
, 百拇医药
TTV是新发现的一个3.7 kb长的无包膜单股DNA病毒。研究表明，TTV与转氨酶异常密切相关，TTV感染可能是引起肝炎的因素之一。Okamoto等[8]人测定了日本一株TTV的全基因序列。TTV基因含两个开放阅读框架ORF1和ORF2分别编码770个氨基酸和202个氨基酸的病毒蛋白。TTV全基因中有12个TATA序列，两个多腺苷酸化信号(AATAAA)，这些均是细小病毒科的病毒特征，可能归类于细小病毒科(Parvoviridae)。该病毒目前还无法在体外分离培养。
我们测定的一株中国人TTV全基因序列(3 739 bp)，与日本的TTV全序列比较，两者之间的核苷酸和氨基酸同源性都超过94%，两者属同一基因型。但是，在第1 350～1 800 bp间TTV中国株和日本株之间变异较大。两者的核苷酸同源性为88%，而氨基酸同源性仅为82%。该区段可能是TTV的内部高变区。
Okamoto等[8]分析了78株TTV 1 902～2 257位核苷酸之间的序列。根据其基因变异将其分为4个亚组，即G1a、G1b、G2a、G2b。这种基因分型的方法是根据部分序列进行的，很难反应全基因的变异。我们与国内其它合作单位又测定另外2株TTV全长序列(GenBank号AF116842和AF129887)。根据这4株(日本1株和中国3株)TTV的序列分析，核苷酸同源性大于85%，而氨基酸同源性大于90%(该文另发)。因此，TTV是否有多个基因型，有否高变区，还需更多的全基因比较。
, 百拇医药
TTV在国内外人群中均存在感染。TTV的感染传播可能是通过多途径进行的。除经血液途径外，粪口传播可能是一重要途径。Okamoto等[8]的研究表明，TTV分布甚为广泛。在非甲-非戊型暴发性肝炎中，47%(9/19)为TTV阳性；非甲-非戊型慢性肝病中，TTV阳性率为46%(41/90)；血友病病人TTV阳性率为46%(26/57)，献血员为12%(34/290)。欧洲、美洲等也存在TTV感染[4，5]。我们的研究表明：(1)我国50%左右的临床诊断为非甲至非庚型肝炎病人中可测出TTV DNA；(2)30%左右临床不明原因的转氨酶异常的献血员为TTV DNA阳性；(3)与HBsAg感染状态相似，正常人群中约有10%的“健康携带者”[9，10]。
由于TTV研究刚起步，目前对TTV的感染状况、TTV的致病性及病毒本身的特征等均缺乏深入的认识。我们的研究结果为国内的TTV变异研究提供了一些基本的资料。但是，我国幅员辽阔，TTV感染又分布广泛，继续开展TTV基因变异研究仍是必要的。■
, http://www.100md.com
基金项目：总后勤部医药卫生科研基金资助项目(98M138)
参考文献：
[1]Marcellin P, Martinot-Peignoux M, Gabriel F, et al. Chronic Non-B, Non-C hepatitis among blood donors assayed with HCV third generation test and polymerase chain reaction. J Hepatol, 1993, 19:167-170.
[2]Buti M, Jardi R, Rodriguez-Frias F, et al. Etiology of acute sporadic hepatitis in Spain. J Hepatol 1994, 20:589-592.
, 百拇医药 [3]Sallie R, King R, Silva E, et al. Hepatitis C and E in Non-A, Non-B fulminant hepatic failure. J Med Virol， 1994,20: 580-588.
[4]Leary TP, Muerhoff SA, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: A novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis. J Med Virol， 1996, 48: 60-68.
[5]Linnen J, Jr WagesJ, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular clobning and disease association of hepatitis G virus: A transfusion -transmissible agent. Science， 1996, 271: 505-509.
, http://www.100md.com
[6]周育森， 王海涛， 赵惠柳, 等. 中国庚型肝炎病毒(HGV)全基因结构特点及HGV感染的地理分布. 微生物学通报， 1997, 24:27-30.
[7]Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transamonase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun， 1997, 241: 92-97.
[8]Okamoto H, Nishizawa T, Kayto N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus ( TTV ) associated with posttransfusion hepatitis of unkown etiology. Hepatol Res, 1997，10：1-16.
[9]周育森, 何忠平, 董京芳, 等. 中国人TTV部分基因的克隆和序列测定.军事医学科学院院刊， 1997,22:107-109.
[10]孟庆华， 周育森， 刘得恭，等. TTV在肝炎患者中的检测及临床意义探讨.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12：91-93.
收稿日期：1998-10-15, 百拇医药
单位：周育森 董京芳 何忠平 周乙华 王勇 王海涛(100071 北京，军事医学科学院微生物流行病研究所)
关键词：肝炎病毒；基因；核苷酸序列
中华医学杂志000104 摘 要：目的 克隆和序列测定TT病毒(TTV)中国分离株全基因。方法 采用长片段PCR技术从一例临床非甲-非庚型肝炎病人血清中扩增TTV全基因，获得3个互相重叠的片段，分别长199、3269和434 bp。用标准的分子生物学方法测定这3个片段的序列，从而得到全长TTV基因序列。结果 TTV中国分离株全基因长3 739个核苷酸，含两个开放读码框架。第一个ORF位于589至2 901位核苷酸，编码770个氨基酸；第二个ORF位于107至715位核苷酸，编码202个氨基酸。在该基因A占31.24%，G占22.25%，C占25.54%，T占20.97%。 TTV中国分离株与日本分离株的核苷酸和氨基酸同源性均在94%以上。但在1 380 bp～1 800 bp间，两株间核苷酸同源性为88%，氨基酸同源性仅为81%。该区段可能是一个内部高变区。结论 这一TTV中国株和日本株属同一个基因型。在ORF1区段内可能存在一个内部高变区。
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Cloning and sequencing of a Chinese complete TTV gene
ZHOU Yusen, DONG Jingfang, HE Zhongping, et al.
(Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, China Academy of Medical Sciences, Beijing 100071，China)
Abstract：Objective To obtain the complete TT virus gene from a Chinese isolate. Methods Long-PCR was performed for amplifying the TTV gene from the serum of a Chinese with non-A to non-G hepatitis. Three overlapped DNA fragments were obtained, which contained 199 bp (1-199), 3 269 bp (38～3 306) and 434 bp (3 306～3 739) separately. These PCR products were sequenced by the standard method. Results The complete TTV gene (named as TTV CHN1)consisting of 3 739 nucleotides contained two ORFs. The first ORF located at 589～2 901 nt, coding 770 amino acids; the second located at 107～715 nt, coding 202 amino acids. In this genome， G is 22.25%,C 25.54%,A 31.26% and T 20.97%. The homology of Chinese and Japanese TTV genes was more than 94% at both nucleotide and amino acid levels. There exists a hyper-variation region (HVR) spanning at 1 380～1 800 bp. In this region, the HVR homology of Chinese and Japanese TTV genes was 88% and 81% at nucleotide and amino acid levels, respectively. Conclusion Chinese and Japanese TTV isolates belong to the same genotype. There exists a hyper-variation region (HVR) spanning at 1 380～1 800 bp.
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Key words：Hepatitis viruses；Gene；Nucleotide sequence▲
病毒性肝炎是危害人类健康的重要因素之一。除甲、乙、丙、丁及戊型肝炎等5种肝炎病毒感染、巨细胞病毒及EB病毒感染外，约有10%～20%的病毒性肝炎病人病因不明[1-3]，这些肝炎简称为非甲非戊型肝炎或隐原性肝炎。1995年美国科学家发现了己型肝炎病毒(HGV)[4，5]。但是，目前的研究表明，这种RNA病毒不是非甲非戊型肝炎主要病原[5，6]。1997年底，日本学者报道了一种与肝功能异常有关的DNA病毒，并将之命名为TT 病毒(TTV)。初步的研究表明，这种病毒可能是一种新的非甲非戊型肝炎的致病病原[7]。
为了解TTV在国内人群中的感染状况，分析TTV的基因结构与特征，建立适合我国人群的诊断方法和必要时为进一步研制预防TTV感染的疫苗， 我们测定了一株中国人TTV全基因序列。
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材料与方法
一、材料
用于克隆TTV基因的病人血清标本采自北京的1例临床诊断为非甲-非庚型肝炎的病人。
二、方法
1.克隆及测序常规材料：克隆载体(T载体)、XL1-Blue菌、Taq酶、dNTPs及T4 DNA连接酶购自华美公司。PCR引物由本院合成。其他试剂及材料为本实验室常规备用。
2.TTV全基因的克隆: 用片段PCR扩增技术扩增克隆TTV全基因并测定其核苷酸序列。其克隆策略见示意图1。
1.38-3 306 bp；2.1-199 bp；3.3 306-3 739 bp
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图1 TTV全基因克隆及序列测定示意图
3.PCR引物设计、扩增：参考日本已发表TTV的全基因序列(AB008394)设计一套引物。所设计合成的下述重叠引物贯穿了参考序列的全序列。引物序列为:P1(1-23)：5′-ATTTGCTACGTCACTAACCACG-3′；P2(3552-3571)： 5′-TGACCCGGAAGATGTTGTCC-3′；P3(39-58)： 5′-AACCGAATGCTATGTCATCC-3′；P4(3306-3325)：5′-TGACCCGGAAGATGTTGTCC-3′。这两对引物P1和P2为外引物，P3和P4为内引物，扩增出3.2 kb的基因片段1(如图1所示)。P1和P5(199-217)：5′-AATTGCCCCTTGACTTCGG-3′，扩增出5′端的基因片段2。采取半巢式PCR扩增TTV 3′端基因片段3：P6(2 885-2 902)：5′-TTCAAATAGC-ACCATAAA-3′和P7(3 719-3 739)：5′-GCCGACGGT-TTTTTGGCGCCT-3′为外引物，P7和P8(3 306-3 571)：5′-GCCATTGGACTCAGGAGCTA-3′为内引物。
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采用STG试剂盒提取血清病毒DNA，具体方法见文献[8]。PCR的扩增按常规进行。
4.序列测定及分析方法:扩增产物纯化后，直接与T载体(pBluscript-Tvector)连接、转化鉴定、提取质粒DNA。长片段1采用常规方法进行亚克隆测定其序列。用ABI377型自动测序仪测序。
采用CLUSTAWL程序进行多个序列的比较，引物设计及分析使用GOLDKEY和OLIGO中的有关程序。
结果
一、中国人TTV全基因克隆及序列测定结果(图2)
用PCR技术扩增出3个互相重叠的基因片段，包含了ORF1和ORF2全长基因。我们将该株TTV病毒序列命名为TTVCHN1(GenBank注册号AF079173)。该序列全长3 739个核苷酸，有2个开放读码框架。基因组中A占31.24%，G占22.25%，C占25.54%，T占20.97%。
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图2 中国TTV全基因DNA核苷酸序列
二、中国株与日本TTV株核苷酸和氨基酸同源性比较
将测定的序列输入后用BLAST程序工具与GenBank中的序列进行比较。分析结果表明，我国的这一株TTV与日本发表的TTV全基因序列(AB008394)具有很高的同源性。核苷酸同源性大于94%，氨基酸同源性大于96%。表明两者属于同一基因型。 在1 380～1 800 nt间，两株TTV核苷酸和氨基酸的变异较大(图3)，核苷酸同源性为88%，氨基酸同源性为82%。该区可能是TTV的内部高变区。3′端也存在类似的趋势。
图3 中国株和日本株TTV高变区的核苷酸序列比较(NT1 380～1 800间)
讨论
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TTV是新发现的一个3.7 kb长的无包膜单股DNA病毒。研究表明，TTV与转氨酶异常密切相关，TTV感染可能是引起肝炎的因素之一。Okamoto等[8]人测定了日本一株TTV的全基因序列。TTV基因含两个开放阅读框架ORF1和ORF2分别编码770个氨基酸和202个氨基酸的病毒蛋白。TTV全基因中有12个TATA序列，两个多腺苷酸化信号(AATAAA)，这些均是细小病毒科的病毒特征，可能归类于细小病毒科(Parvoviridae)。该病毒目前还无法在体外分离培养。
我们测定的一株中国人TTV全基因序列(3 739 bp)，与日本的TTV全序列比较，两者之间的核苷酸和氨基酸同源性都超过94%，两者属同一基因型。但是，在第1 350～1 800 bp间TTV中国株和日本株之间变异较大。两者的核苷酸同源性为88%，而氨基酸同源性仅为82%。该区段可能是TTV的内部高变区。
Okamoto等[8]分析了78株TTV 1 902～2 257位核苷酸之间的序列。根据其基因变异将其分为4个亚组，即G1a、G1b、G2a、G2b。这种基因分型的方法是根据部分序列进行的，很难反应全基因的变异。我们与国内其它合作单位又测定另外2株TTV全长序列(GenBank号AF116842和AF129887)。根据这4株(日本1株和中国3株)TTV的序列分析，核苷酸同源性大于85%，而氨基酸同源性大于90%(该文另发)。因此，TTV是否有多个基因型，有否高变区，还需更多的全基因比较。
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TTV在国内外人群中均存在感染。TTV的感染传播可能是通过多途径进行的。除经血液途径外，粪口传播可能是一重要途径。Okamoto等[8]的研究表明，TTV分布甚为广泛。在非甲-非戊型暴发性肝炎中，47%(9/19)为TTV阳性；非甲-非戊型慢性肝病中，TTV阳性率为46%(41/90)；血友病病人TTV阳性率为46%(26/57)，献血员为12%(34/290)。欧洲、美洲等也存在TTV感染[4，5]。我们的研究表明：(1)我国50%左右的临床诊断为非甲至非庚型肝炎病人中可测出TTV DNA；(2)30%左右临床不明原因的转氨酶异常的献血员为TTV DNA阳性；(3)与HBsAg感染状态相似，正常人群中约有10%的“健康携带者”[9，10]。
由于TTV研究刚起步，目前对TTV的感染状况、TTV的致病性及病毒本身的特征等均缺乏深入的认识。我们的研究结果为国内的TTV变异研究提供了一些基本的资料。但是，我国幅员辽阔，TTV感染又分布广泛，继续开展TTV基因变异研究仍是必要的。■
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参考文献：
[1]Marcellin P, Martinot-Peignoux M, Gabriel F, et al. Chronic Non-B, Non-C hepatitis among blood donors assayed with HCV third generation test and polymerase chain reaction. J Hepatol, 1993, 19:167-170.
[2]Buti M, Jardi R, Rodriguez-Frias F, et al. Etiology of acute sporadic hepatitis in Spain. J Hepatol 1994, 20:589-592.
, 百拇医药 [3]Sallie R, King R, Silva E, et al. Hepatitis C and E in Non-A, Non-B fulminant hepatic failure. J Med Virol， 1994,20: 580-588.
[4]Leary TP, Muerhoff SA, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: A novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis. J Med Virol， 1996, 48: 60-68.
[5]Linnen J, Jr WagesJ, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular clobning and disease association of hepatitis G virus: A transfusion -transmissible agent. Science， 1996, 271: 505-509.
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[6]周育森， 王海涛， 赵惠柳, 等. 中国庚型肝炎病毒(HGV)全基因结构特点及HGV感染的地理分布. 微生物学通报， 1997, 24:27-30.
[7]Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transamonase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun， 1997, 241: 92-97.
[8]Okamoto H, Nishizawa T, Kayto N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus ( TTV ) associated with posttransfusion hepatitis of unkown etiology. Hepatol Res, 1997，10：1-16.
[9]周育森, 何忠平, 董京芳, 等. 中国人TTV部分基因的克隆和序列测定.军事医学科学院院刊， 1997,22:107-109.
[10]孟庆华， 周育森， 刘得恭，等. TTV在肝炎患者中的检测及临床意义探讨.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12：91-93.
收稿日期：1998-10-15, 百拇医药