哮喘豚鼠肺组织中G蛋白的表达及胸腺素对其的影响
作者：熊仁平 周元国 曹国强
单位：
熊仁平(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所分子生物学中心，重庆 400042)；周元国(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所分子生物学中心，重庆 400042)；曹国强(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所分子生物学中心，重庆 400042)
关键词：G蛋白；肺组织；哮喘；豚鼠；胸腺素
中国危重病急救医学000105 摘 要：目的：研究哮喘豚鼠肺组织G蛋白α亚基含量的表达变化及胸腺素对其的影响。方法：用卵蛋白雾化吸入致敏的方法复制豚鼠哮喘模型，并用胸腺素治疗，Western blot杂交分析法测定Gα含量。结果：哮喘组豚鼠肺组织Giα(126%±11%)、Gqα(122%±12%)较正常对照组显著升高(P均<0.05)；而胸腺素组Giα、Gqα(分别为97%±9%和98%±11%)较哮喘组显著降低(P均<0.05)；胸腺素组Gsα(107%±6%和104%±5%)无显著变化(P均>0.05)。结论：哮喘肺组织Giα、Gqα表达增加在哮喘发病中可能占有一定地位，而胸腺素通过降低Giα、Gqα在哮喘豚鼠肺组织的表达变化达到了治疗或缓解哮喘的目的。
, http://www.100md.com
分类号：Q591.2;R562.25 文献标识码：A
文章编号：1003-0603(2000)01-0018-03
Effect of thymosin on the expression of Gproteins in asthmatic guinea pigs
XIONG Ren-ping,ZHOU Yuan-guo,CAO Guo-qiang
(Research Institute of Surgery and Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing 400042)
Abstract：Objective：To study the alteration in Gproteins in tissues in asthmatic guinea pigs.Methods：Guinea pigs were sensitized and challenged with ovalbumin and treated with thymosin.The levels of Gsα,Giα,Goα and Gqα in lung tissue were measured with Western blot analysis.Results：The levels of Giα and Gqα in asthmatic animals were increased significantly as compared with those in group NS (126%±11% and 122%±12% vs.100%,both P<0.05).The contents of Giα and Gqα in thymosin treated animals were significantly lower than those in asthmatic ones (97%±9% and 98%+11% vs. 126%±11% and 122%±12%).There was no significant change in the level of Gsα in both groups (both P>0.05).Conclusions：The changes in G-proteins and their subfamilies,such as Gqα and Giα in lungs may be involved in the development of asthma.Thymosin could be used to treat the asthma by influencing the level of G-proteins.
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Key words：G-proteins;lung tissue;asthma;thymosin▲
哮喘的发病机制复杂，已知有众多细胞因子、血管活性物质参与，但始终未能找到关键的致病因子或物质。G蛋白是联接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的重要蛋白质，其含量及活性变化调节着体内绝大多数生理、生化、免疫反应和与其相关的基因表达[1]。胸腺素含有促进和抑制等不同成分而调控机体免疫反应。本实验通过观察哮喘豚鼠肺组织G蛋白含量的变化，深入了解哮喘发病的分子机制，进而从分子水平探讨胸腺素治疗哮喘的理论基础。
1 材料与方法
1.1 动物模型：雄性豚鼠20只(本校实验动物中心提供)，体重300～450 g，随机均分为正常对照组(NS组)、致敏组(SE组)、哮喘组(AS组)和胸腺素组(TH组)。SE组、AS组和TH组分别用100 mg卵蛋白雾化吸入致敏豚鼠；TH组、AS组动物致敏后，分别于第9、10、13、14及15日重复激发；SE组用生理盐水重复激发；TH组于第16、17、18、19及20日按0.3 mg/kg肌注胸腺素(第三军医大学第三附属医院生产，批号980110)；NS组用生理盐水致敏且激发。戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。TH组动物第20日后活杀，其余3组于第15日活杀，取肺组织干冰速冻后-70 ℃冰箱备用。
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1.2 Western blot杂交分析：按参考文献[2]方法提取膜蛋白并定量。简要过程如下：将冷冻肺组织置于4 ℃预冷的含0.4 mmol/L甲苯黄酰氟(PMSF，Sigma公司)、1 mmol/L的1，10菲咯啉(1，10phenanthroline,Sigma公司)、1 mmol/L碘乙酰胺(瑞士Fluka公司)和1 μmol/L抑胃肽A(pepstatin A,Sigma公司)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中，匀浆制备膜蛋白，置-70℃储存备用。电泳用11%SDSPAGE，按每一样品25～50 μg分别上5块胶，1块用于染色确定上样量的一致性，另4块分别用电转移的方式转至醋酸纤维素膜上。将膜用5%的脱脂奶粉封闭后，分别与抗Gsα(按滴度1∶1 200稀释，以下相同)、Goα(1∶1 000)、Giα(1∶1 200)和Gqα(1∶1 200)抗体(均为美国NEN公司产品)反应1小时，洗去抗体后将膜置于1∶8 000的辣根过氧化物酶标记的IgG(英国Amersham公司)中反应1小时，用PBS充分洗涤后，用增强型化学发光(ECL)显影药盒(英国Amersham公司)显影，X线片记录影像。DUMAS图像分析系统对X线胶片进行定量分析，结果用测得目标带的吸光度×面积表示，然后按占对照组的百分比进行统计。
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1.3 统计学方法：实验结果用均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验，P<0.05为相差显著。
2 结 果
Western blot又叫免疫印迹，本实验用多克隆抗G蛋白抗体能有效地检出响应的目标带。交叉反应少而弱，而用增强型化学发光法检测辣根过氧化物酶标记的二抗，具有灵敏度高、耗时短、背景干净、操作及要求相对简单的特点。比较4种G蛋白亚型的杂交结果，可以看出肺组织中Goα为单一带，位于39000，因为含量很低，检出不稳定，定量困难。Giα、Gqα则比较稳定，二者均为1条带，相对分子质量分别为41000和42000。Gsα可见2条清晰带，相对分子质量分别为45000和52000(图1)。4组动物肺膜G蛋白水平见表1。SE组豚鼠肺膜组织α亚基未见显著改变。AS组豚鼠肺膜Gsα含量也未发现显著变化(为NS组的101%±8%，P>0.05)，而Giα、Gqα含量均较NS组显著提高(分别为对照组的126%±14%及122%±18%，P均<0.05)。胸腺素治疗后哮喘豚鼠的肺膜组织Gqα及Giα含量较AS组显著减少(P均<0.05)。Gsα含量也未发现显著变化(P>0.05)。
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表1 4组豚鼠肺组织Gα含量变化(±s) 组别
动物数
(只)
Gsα(%)
Giα(%)
Gqα(%)
带1
带2
NS组
5
100
, http://www.100md.com 100
100
100
SE组
5
98±8
97±9
101±5
107±3
AS组
5
108±8
102±6
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126±11*
122±12*
TH组
5
107±6
104±5
97±9△
98±11△
注：与NS组比较：*P<0.05；与AS组比较：△P<0.05
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图1 豚鼠肺组织Gα蛋白Western blot杂交分析
3 讨 论
哮喘的发病机制复杂，至今尚未阐述清楚。以往的工作多集中在参与哮喘发病的炎症介质表达变化以及炎症介质所介导的细胞之间的信息传导，但对其细胞内信号传导机制研究较少。G蛋白是近年来在生物细胞膜发现的一组与三磷酸腺苷(ATP)相结合的蛋白质，其主要功能是将激素或神经递质信息由细胞外表面的受体传递至细胞内的效应器，如腺苷酸环化酶等。G蛋白在细胞内外信息传导中有着极其重要的作用[3]，但在哮喘发病中的作用在文献中少见报道。本研究观察了Goα、Gqα、Giα及Gsα，发现Goα在肺组织含量虽低但仍可检测到，Gqα和Giα均为1条带，Gsα有2条带，与文献[35]报道的结果相类似，说明检出的结果是可靠的。本实验发现Gqα及Giα在哮喘豚鼠肺膜组织中的含量显著增加，而Gsα的含量无明显变化，该结果与文献[4]报道一致。具有创新意义的是，我们观察了胸腺素治疗哮喘豚鼠后的肺组织G蛋白含量的变化，其Gqα及Giα含量显著减少。
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研究证实，Gqα蛋白亚基耦联于血栓素A2(TXA2)、血小板活化因子(PAF)、内皮素(ET)、缓激肽和组织胺等众多的受体，Giα也是PAF、ET等众多受体于效应器耦联的通道。上述多种炎症介质的表达变化在哮喘的发生与发展中有着重要的作用，而Gqα及Giα的表达增加还会改变其与受体和效应器的耦联效率，进而改变气道对上述介质的反应能力。因此，我们认为Gqα和Giα的高表达可能在哮喘的发病中占有一定地位。如能在早期抑制或降低以传递有害信号为主的G蛋白(如Gqα和Giα等)，将可能减轻有害物质造成的损害，而后期则可阻止进一步恶化，使机体进一步恢复。胸腺素可抑制小鼠绵羊红细胞特异抗体产生，延缓移植皮肤排斥反应和迟发型变态反应，降低某些过敏介质的水平[6]。因此，应用胸腺素可能抑制或降低以传递有害信号为主的Gqα和Giα在哮喘豚鼠肺组织中的表达，从而减轻有害物质的损伤，达到治疗或缓解哮喘的目的。
基金项目：第三军医大学科研基金资助项目(98065)
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作者简介：熊仁平(1963-)，男(汉族)，重庆垫江人，高级实验师。主要从事创伤信息传导变化分子水平研究。发表学术论文23篇，有4篇药物论文被美国化学文摘收录；参加了4项军内指定课题和4项国家自然科学基金项目的研究。
参考文献：
[1]Raymond J R.Multiple mechanisms of receptors-G protein signaling [editorial].AM J Physiol,1995,269(2pt2):F141-F158.
[2]熊仁平，周元国.蛋白免疫印迹法在G蛋白检测中的运用.第三军医大学学报，1998，20(2)：145-147.
[3]周元国，王正国.G蛋白及其研究进展.生理科学进展，1996，27(3)：187-196.
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[4]Lee J Y,Uchida Y,Sakamoto T,et al.Alternation of G protein levels in antigen-challenged guinea pigs.J Pharmacol Exp Ther,1994,271:1713-1720.
[5]Emala C W,Yang J,Hirshean C A,et al.G protein subunits in lung cells.Life Sci,1994,55(8):593-602.
[6]袁淑琴，郭敏.应用胸腺免疫抑制提取物治疗小儿支气管哮喘63例报告.中国生化药物杂志，1992，13(3)：76-77.
收稿日期：1999-07-18 修稿日期：1999-11-03, http://www.100md.com
单位：
熊仁平(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所分子生物学中心，重庆 400042)；周元国(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所分子生物学中心，重庆 400042)；曹国强(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所分子生物学中心，重庆 400042)
关键词：G蛋白；肺组织；哮喘；豚鼠；胸腺素
中国危重病急救医学000105 摘 要：目的：研究哮喘豚鼠肺组织G蛋白α亚基含量的表达变化及胸腺素对其的影响。方法：用卵蛋白雾化吸入致敏的方法复制豚鼠哮喘模型，并用胸腺素治疗，Western blot杂交分析法测定Gα含量。结果：哮喘组豚鼠肺组织Giα(126%±11%)、Gqα(122%±12%)较正常对照组显著升高(P均<0.05)；而胸腺素组Giα、Gqα(分别为97%±9%和98%±11%)较哮喘组显著降低(P均<0.05)；胸腺素组Gsα(107%±6%和104%±5%)无显著变化(P均>0.05)。结论：哮喘肺组织Giα、Gqα表达增加在哮喘发病中可能占有一定地位，而胸腺素通过降低Giα、Gqα在哮喘豚鼠肺组织的表达变化达到了治疗或缓解哮喘的目的。
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分类号：Q591.2;R562.25 文献标识码：A
文章编号：1003-0603(2000)01-0018-03
Effect of thymosin on the expression of Gproteins in asthmatic guinea pigs
XIONG Ren-ping,ZHOU Yuan-guo,CAO Guo-qiang
(Research Institute of Surgery and Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing 400042)
Abstract：Objective：To study the alteration in Gproteins in tissues in asthmatic guinea pigs.Methods：Guinea pigs were sensitized and challenged with ovalbumin and treated with thymosin.The levels of Gsα,Giα,Goα and Gqα in lung tissue were measured with Western blot analysis.Results：The levels of Giα and Gqα in asthmatic animals were increased significantly as compared with those in group NS (126%±11% and 122%±12% vs.100%,both P<0.05).The contents of Giα and Gqα in thymosin treated animals were significantly lower than those in asthmatic ones (97%±9% and 98%+11% vs. 126%±11% and 122%±12%).There was no significant change in the level of Gsα in both groups (both P>0.05).Conclusions：The changes in G-proteins and their subfamilies,such as Gqα and Giα in lungs may be involved in the development of asthma.Thymosin could be used to treat the asthma by influencing the level of G-proteins.
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Key words：G-proteins;lung tissue;asthma;thymosin▲
哮喘的发病机制复杂，已知有众多细胞因子、血管活性物质参与，但始终未能找到关键的致病因子或物质。G蛋白是联接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的重要蛋白质，其含量及活性变化调节着体内绝大多数生理、生化、免疫反应和与其相关的基因表达[1]。胸腺素含有促进和抑制等不同成分而调控机体免疫反应。本实验通过观察哮喘豚鼠肺组织G蛋白含量的变化，深入了解哮喘发病的分子机制，进而从分子水平探讨胸腺素治疗哮喘的理论基础。
1 材料与方法
1.1 动物模型：雄性豚鼠20只(本校实验动物中心提供)，体重300～450 g，随机均分为正常对照组(NS组)、致敏组(SE组)、哮喘组(AS组)和胸腺素组(TH组)。SE组、AS组和TH组分别用100 mg卵蛋白雾化吸入致敏豚鼠；TH组、AS组动物致敏后，分别于第9、10、13、14及15日重复激发；SE组用生理盐水重复激发；TH组于第16、17、18、19及20日按0.3 mg/kg肌注胸腺素(第三军医大学第三附属医院生产，批号980110)；NS组用生理盐水致敏且激发。戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。TH组动物第20日后活杀，其余3组于第15日活杀，取肺组织干冰速冻后-70 ℃冰箱备用。
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1.2 Western blot杂交分析：按参考文献[2]方法提取膜蛋白并定量。简要过程如下：将冷冻肺组织置于4 ℃预冷的含0.4 mmol/L甲苯黄酰氟(PMSF，Sigma公司)、1 mmol/L的1，10菲咯啉(1，10phenanthroline,Sigma公司)、1 mmol/L碘乙酰胺(瑞士Fluka公司)和1 μmol/L抑胃肽A(pepstatin A,Sigma公司)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中，匀浆制备膜蛋白，置-70℃储存备用。电泳用11%SDSPAGE，按每一样品25～50 μg分别上5块胶，1块用于染色确定上样量的一致性，另4块分别用电转移的方式转至醋酸纤维素膜上。将膜用5%的脱脂奶粉封闭后，分别与抗Gsα(按滴度1∶1 200稀释，以下相同)、Goα(1∶1 000)、Giα(1∶1 200)和Gqα(1∶1 200)抗体(均为美国NEN公司产品)反应1小时，洗去抗体后将膜置于1∶8 000的辣根过氧化物酶标记的IgG(英国Amersham公司)中反应1小时，用PBS充分洗涤后，用增强型化学发光(ECL)显影药盒(英国Amersham公司)显影，X线片记录影像。DUMAS图像分析系统对X线胶片进行定量分析，结果用测得目标带的吸光度×面积表示，然后按占对照组的百分比进行统计。
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1.3 统计学方法：实验结果用均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验，P<0.05为相差显著。2 结 果
Western blot又叫免疫印迹，本实验用多克隆抗G蛋白抗体能有效地检出响应的目标带。交叉反应少而弱，而用增强型化学发光法检测辣根过氧化物酶标记的二抗，具有灵敏度高、耗时短、背景干净、操作及要求相对简单的特点。比较4种G蛋白亚型的杂交结果，可以看出肺组织中Goα为单一带，位于39000，因为含量很低，检出不稳定，定量困难。Giα、Gqα则比较稳定，二者均为1条带，相对分子质量分别为41000和42000。Gsα可见2条清晰带，相对分子质量分别为45000和52000(图1)。4组动物肺膜G蛋白水平见表1。SE组豚鼠肺膜组织α亚基未见显著改变。AS组豚鼠肺膜Gsα含量也未发现显著变化(为NS组的101%±8%，P>0.05)，而Giα、Gqα含量均较NS组显著提高(分别为对照组的126%±14%及122%±18%，P均<0.05)。胸腺素治疗后哮喘豚鼠的肺膜组织Gqα及Giα含量较AS组显著减少(P均<0.05)。Gsα含量也未发现显著变化(P>0.05)。
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表1 4组豚鼠肺组织Gα含量变化(
±s) 组别动物数
(只)
Gsα(%)
Giα(%)
Gqα(%)
带1
带2
NS组
5
100
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100
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SE组
5
98±8
97±9
101±5
107±3
AS组
5
108±8
102±6
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126±11*
122±12*
TH组
5
107±6
104±5
97±9△
98±11△
注：与NS组比较：*P<0.05；与AS组比较：△P<0.05
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图1 豚鼠肺组织Gα蛋白Western blot杂交分析
3 讨 论
哮喘的发病机制复杂，至今尚未阐述清楚。以往的工作多集中在参与哮喘发病的炎症介质表达变化以及炎症介质所介导的细胞之间的信息传导，但对其细胞内信号传导机制研究较少。G蛋白是近年来在生物细胞膜发现的一组与三磷酸腺苷(ATP)相结合的蛋白质，其主要功能是将激素或神经递质信息由细胞外表面的受体传递至细胞内的效应器，如腺苷酸环化酶等。G蛋白在细胞内外信息传导中有着极其重要的作用[3]，但在哮喘发病中的作用在文献中少见报道。本研究观察了Goα、Gqα、Giα及Gsα，发现Goα在肺组织含量虽低但仍可检测到，Gqα和Giα均为1条带，Gsα有2条带，与文献[35]报道的结果相类似，说明检出的结果是可靠的。本实验发现Gqα及Giα在哮喘豚鼠肺膜组织中的含量显著增加，而Gsα的含量无明显变化，该结果与文献[4]报道一致。具有创新意义的是，我们观察了胸腺素治疗哮喘豚鼠后的肺组织G蛋白含量的变化，其Gqα及Giα含量显著减少。
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研究证实，Gqα蛋白亚基耦联于血栓素A2(TXA2)、血小板活化因子(PAF)、内皮素(ET)、缓激肽和组织胺等众多的受体，Giα也是PAF、ET等众多受体于效应器耦联的通道。上述多种炎症介质的表达变化在哮喘的发生与发展中有着重要的作用，而Gqα及Giα的表达增加还会改变其与受体和效应器的耦联效率，进而改变气道对上述介质的反应能力。因此，我们认为Gqα和Giα的高表达可能在哮喘的发病中占有一定地位。如能在早期抑制或降低以传递有害信号为主的G蛋白(如Gqα和Giα等)，将可能减轻有害物质造成的损害，而后期则可阻止进一步恶化，使机体进一步恢复。胸腺素可抑制小鼠绵羊红细胞特异抗体产生，延缓移植皮肤排斥反应和迟发型变态反应，降低某些过敏介质的水平[6]。因此，应用胸腺素可能抑制或降低以传递有害信号为主的Gqα和Giα在哮喘豚鼠肺组织中的表达，从而减轻有害物质的损伤，达到治疗或缓解哮喘的目的。
基金项目：第三军医大学科研基金资助项目(98065)
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作者简介：熊仁平(1963-)，男(汉族)，重庆垫江人，高级实验师。主要从事创伤信息传导变化分子水平研究。发表学术论文23篇，有4篇药物论文被美国化学文摘收录；参加了4项军内指定课题和4项国家自然科学基金项目的研究。
参考文献：
[1]Raymond J R.Multiple mechanisms of receptors-G protein signaling [editorial].AM J Physiol,1995,269(2pt2):F141-F158.
[2]熊仁平，周元国.蛋白免疫印迹法在G蛋白检测中的运用.第三军医大学学报，1998，20(2)：145-147.
[3]周元国，王正国.G蛋白及其研究进展.生理科学进展，1996，27(3)：187-196.
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[4]Lee J Y,Uchida Y,Sakamoto T,et al.Alternation of G protein levels in antigen-challenged guinea pigs.J Pharmacol Exp Ther,1994,271:1713-1720.
[5]Emala C W,Yang J,Hirshean C A,et al.G protein subunits in lung cells.Life Sci,1994,55(8):593-602.
[6]袁淑琴，郭敏.应用胸腺免疫抑制提取物治疗小儿支气管哮喘63例报告.中国生化药物杂志，1992，13(3)：76-77.
收稿日期：1999-07-18 修稿日期：1999-11-03, http://www.100md.com