牛磺酸对血管紧张素Ⅱ改变培养心肌细胞内游离 Ca2+浓度作用的影响
作者：葛慧 陶亮 刘培庆 马静 凌文华
单位：葛慧 马静 凌文华(中山医科大学公共卫生学院营养系)；陶亮(药理学教研室)；刘培庆(生理学教 研室，广州 510089)
关键词：牛磺酸；血管紧张素Ⅱ；心肌细胞；钙
中国应用生理学杂志000107 摘要 目的和方法：用Fura-2/AM.荧光显示测定细胞内游离Ca2+浓度([Ca 2+]i)的方法，我们研究了牛磺酸(Tau)对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)引起的培养心肌细胞 [Ca2+]i变化的影响。结果：在有Ca2+和无Ca2+的缓冲液 中，Ang Ⅱ(1,10，100，1 000 nmol/L)能浓度依赖性地引起[Ca2+]i升高。在含Ca 2+的缓冲液中，Tau(10,20 mol/L)可依浓度地抑制Ang Ⅱ(100 nmol/L)引起的[Ca 2+]i升高;但在无Ca2+的缓冲液中，牛磺酸无此作用。用ryanodine(Rya，1 μm ol/L)预先耗竭细胞内贮存的Ca2+后，Ang Ⅱ(100 nmol/L)仍能 引起[Ca2+]i进一步升高：Ang Ⅱ的这一作用能被Tau(20 mmol/L)显著抑制。 结论：在培养的乳鼠心肌细胞，Tau能够通过抑制Ang Ⅱ引起的Ca2+内流而拮抗 Ang Ⅱ升高[Ca2+]i的作用。
, http://www.100md.com
中图分类号： Q813.1文献标识码：A 文章编号 ：1000-6834(2000)01-0026-04
EFFECTS OF TAURINE ON CHANGES OF CYTOSOLIC FREE Ca2+ INDUCED BY ANGIOTENSIN Ⅱ IN CULTURED MYOCARDIAL CELLS
GE Hui1, TAO Liang2, LIU Pei-qing3, MA Jing1, LI NG Wen-hua1
(1.Department of Nutriology;2.Department of Pharmacology;3.Dea prtment of Physiology, Sun Yet-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 51 0089)
, 百拇医药
ABSTRACT
Aim and Methods: The effects of taurine (Tau) on the Ca2+ movement induced angiotensin Ⅱ were observed in cultured myocardial cells of neonatal r ats with the fura-2 probe. Results: Ang Ⅱ (1,10,100,1 000 nmo l/ L) increased [Ca2+]i dosedependently in both Ca2+ containing medi um and Ca2+ free medium. The rising [Ca2+]i evoked by AngⅡ (100 n mol/L) were decreased by Tau(10,20 mmol/L)in a concentration-dependent manner i n Ca2+ medium but not in Ca2+ free medium. After depletion of intrac ellular Ca2+ pools with ryanodine (1 μmol/L), AngⅡ caused another increa se in [Ca2+]i. This Ang Ⅱ-induced increase in [Ca2+]i was mark edly inhibited by Tau (20 mmol/L). Conclusion: These results indicat e that the mechanism of antagonistic effects of Tau on Ang Ⅱ-induced Ca2+ movement is related to Tau inhibitory action on the Ca2+ influx evoked b y Ang Ⅱ.
, http://www.100md.com
KEY WORDS： taurine; angiotensin Ⅱ; myocardium cells; calcium
牛磺酸(taurine，Tau)是心脏中含量最丰富的游离氨基酸，近年来发现它有降低血压，保护缺血心肌，强心和抗心律失常等多种作用，但作用机理不明[1]。 我们的研究发现[2,3]：在肾性高血压大鼠，Tau能降低血压，并能降低电刺激引 起的心律失常发生率;并能减少心肌线粒体Ca2+的含量。在培养的心肌细胞，Tau能够 抑制血管紧张素 Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)加快心肌细胞搏动率和增加动作电位振幅、 复极时间及窦性周长的作用。这些结果表明：Tau能拮抗Ang Ⅱ的作用。Ang Ⅱ通过激活心 肌细胞表面的Ang Ⅱ 1受体(AT1受体)而影响心脏的多种功能(如：收缩、代谢、生长、 兴奋和传导等)，并在许多心血管疾病的发生和发展中起重要的作用[4]。我们认为 Tau对Ang Ⅱ的拮抗作用可能是通过干扰Ang Ⅱ对心肌细胞Ca2+代谢的影响而产生的 。为了证实这一推测，本文用fura-2荧光显示测定培养乳鼠心肌细胞内游离Ca2+浓 度([Ca2+]i)的方法，研究了Tau对Ang Ⅱ引起的Ca2+转运变化的影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 药品
fura-2/AM粉剂(sigma)，用DMSO溶解稀释为1 mmol/L的溶液，储存于-20℃冰箱内备 用。ryanodine(Rya)由香港大学生理系馈赠，Ang Ⅱ、Tau、bromodeoxy-uridine(BDU)购 于sigma公司。其余药品、试剂为市售分析纯。
1.2 心肌细胞培养
按文献[4]的方法，在无菌条件下取生后2～4 d的SD大鼠(中山医科大学实验动物中心 提供)的心室，置于Hank’s液中剪碎，用0.06%的胰蛋白酶溶液在磁力搅拌下分散细胞，温 度控制在(37±1)℃；每10 min收集一次细胞，离心后将所得的全部细胞置于含有10%胎牛血 清、青霉素100u、链霉素100 μg/100 ml的DMEM培养基中制成1.5×106cell/ml的悬 液，并加BDU(0.1 mmol/L)抑制非心肌细跑生长。将心肌细胞悬液接种于培养瓶中，送入 通 以5%CO2和95%空气的CO2培养箱中培养。每24 h用含10%胎牛血清的培养基换液一次 。本实验所采用的细胞为培养48 h，已开始出现自发性搏动的心肌细胞。
, http://www.100md.com
1.3 心肌细胞[Ca2+]i的测定[5]
1.3.1 培养心肌细胞fura-2/AM的负载 培养的心肌细胞用0.06%的胰蛋白酶消化后制成细跑悬液，加入2 μmolfura-2/AM，在37℃条件下孵育30 min后，加5倍体积的DMEM/F12(含0.05%BSA)在室温下静置5 min。500 r/min离心2 min，用BSS缓冲液(mmol/L:NaCl 130，KCl 5，MgCl2 1，CaCl2 1.5，HEPES 20，Glucose 10，BSA 1 g，pH 7.4)悬浮细胞，调节细胞密度至3×106cell/ml。将细胞转至石英测量杯中，移入RF-5000荧光分光光度计，在37℃恒温、磁力搅拌下测定细胞[Ca2+]i。若作细胞外无Ca 2+测定，样品最后一次离心前换成无Ca2+的BSS，离心后用无Ca2+的BSS悬 浮细胞，并于测量前1 min在样品中加入200 μmol的 EGTA。所有实验用试剂都经证明无荧 光干扰。
, http://www.100md.com
1.3.2 心肌细胞[Ca2+]i的测定 用RF-5000荧光分光光度计(日本岛津公司)测定心肌胞[Ca2+]i。激发光波长分别为340 nm和380 nm，发射光波长为505 nm，采样间隔为1 s。连续记录心肌细胞在给药前后的荧光强度。根据文献[6]，心肌细胞[Ca2+]i的计算公式为：
[Ca2+]i= Kd×Sb1/Sb2×(R-Rmin)/(Rmax-R)
式中R为实验记录到的两激发光波长的荧光比值(F340/F380)；Kd为fura-2/ Ca2+的解离常数。据文献[6]报道，在37℃下，其Kd值为224 nmol/L。Rmax 为胞内fura-2被Ca2+饱和时两激发光波长的比值。实验中通过加入triton X-100( 终浓度为0.09%)测得;Rmin为 fura-2完全游离，未与Ca2+结合时两激发光波长的 荧光值，通过加入EGTA(终浓度为6 mmol/L)测得；Sb1/Sb2：为Fura-2在无Ca2+以 及与Ca2+结合达到饱和时，于380 nm激发光处的荧光强度之比。细胞自身荧光在没有负载fura-2/AM时进行测定。计算[Ca2+]i前应减去细胞自身的荧光。Tau，Rya和Ang Ⅱ直接加入细胞悬液中，记录加药前后的荧光比值。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理
结果采用均数±标准差(
±s),并进行t检验。
2 结果
2.1 心肌细胞的静息[Ga2+]i
本实验测得心肌细脑内静息[Ca2+]i的平均浓度在含Ca2+的缓冲液中为( 84.2±3.4 nmol/L);在无Ca2+液中为(57±6.2 nmol/L)。Tau 5，10，20 mmol/L均不影响心肌细胞静息[Ca2+]i(表1)。
Tab.1 Effect of Tau on [Ca2+]i in cultured myocardialcells of neonetal rat (±s,n=6) Group
, 百拇医药
[Ca2+]i (nmol/L)
Ca2+ cantaning BSS
Ca2+ free BSS
Control
84.2±3.4
57.0±6.2
Tau(mmol/L)
5
82.8±4.1
57.9±3.8
10
, http://www.100md.com
81.6±5.4
56.6±3.2
20
80.5±3.5
55.3±4.5
2.2 Ang Ⅱ对心肌细胞[Ca2+]i的影响
Ang Ⅱ(1，10，100和1 000 nmol/L)呈浓度依赖性地增加心肌细胞[Ca2+]i(图1);在无Ca2+的BSS中，上述浓度的Ang Ⅱ也呈浓度依赖性地增加[Ca2+]i (图2)。在含Ca2+和无Ca2+的BSS中，特异的AT1受体拮抗剂[Sar1，Val 5，Ala8]-Ang Ⅱ可完全抑制Ang Ⅱ升高[Ca2+]i的作用。在含Ca2+B SS中，用Rya(1 μmol/L)预先处理心肌细胞，给药3 min后[Ca2+]i增加了73%； 在此基础上加Ang Ⅱ(100 nmol/L)，心肌细胞[Ca2+]i进一步增加80%(表2)。Tab.2 Effect of Rya (1 μmol/L), Tau (20 m mol/L) andAng Ⅱ (100 nmol/L) on [Ca2+]i in cultured myocar dialcells of neonetal rat (±s,n=6) Group
, http://www.100md.com
[Ca2+]i (nmol/L)
Control
85±13
Rya
147±16* *
Rya+Tau
144±19* *
Rya+AngⅡ
318±18* *
Rya+AngⅡ+Tau
267±21* *# #
, 百拇医药
* * P<0.01, vs control; # # P<0.01, vs Rya+AngⅡ
Fig.1 Effects of Ang Ⅱ (1,10, 100,1 000 nmol/L) and [Sar1, Val5, Ala3]-Ang Ⅱ (1 μmol/L) on [Ca2+]i in cultured rat myocardiac cells in Ca2+ medium (±s, n=6)
* * P<0.01, vs Ang Ⅱ 0 nmol/L;# # P<0.01,vs Ang Ⅱ
, 百拇医药
2.3 Tau对Ang Ⅱ诱导[Ca2+]i变化的影响
在有Ca2+的BSS中，Tau(10，20 mmol/L)能抑制Ang Ⅱ引起的[Ca2+]i 升高，抑制率分别为28%和38%。但在无Ca2+的BSS中，上述浓度的Tau对Ang Ⅱ引起的[Ca2+]i增加无显著影响。Tau(20 mmol/L)对Rya升高心肌细胞[Ca2+]i 的作用无影响，但能明显抑制用Rya预先处理后再加Ang Ⅱ引起的[Ca2+]i升高(图3 ，表2)。
Fig.2 Effects of Ang Ⅱ( 1,10, 100,1000 nmol/L) and [Sar1, Val5, Ala3]-Ang Ⅱ (1 μmol/L) on [C a2+]i in cultured rat myocardiac cells in Ca2+ free medium (+s,n=6)
, 百拇医药
* * P<0.01, vs Ang Ⅱ 0 nmol/L; # # P<0.01, vs Ang Ⅱ
Fig.3 Effects of Tau (5,10,2 0 mmol/L) on the changes of [Ca2+]i induced by Ang Ⅱ (100 nmol/L) (+s,n=6)
* * P<0.01, vs Tau 0 mmol/L
3 讨论
大量的研究表明：Ang Ⅱ是与许多心血管疾病(如高血压、充血性心力衰竭、心律失常等)的发生密切相关的体液因子。Ang Ⅱ对心脏功能和结构的作用，主要是通过影响心肌细胞内Ca2+代谢，升高[Ca2+]i而产生的[2]。 本研究证实：Ang Ⅱ能浓度依赖性的增加心肌细胞[Ca2+]i；Ang Ⅱ的这一作用能 被特异的AT1受体拮抗剂[Sar1，Val5，Ala8]-Ang Ⅱ所阻断，这表明Ang Ⅱ升 高[Ca2+]i的作用是由AT1受体介导的。在心肌细胞，受体激动主要通过两种途径 引起[Ca2+]i升高：细胞外Ca2+内流和细胞内肌浆网/内质网贮存的Ca2 +释放 。Rya为肌浆网/内质网膜上Rya敏感Ca2+释放通道的选择性激动剂，它持续开放Rya 敏感Ca2+释放通道，使肌浆网/内质网中的Ca2+流入胞浆，导致[Ca2+ ]i升高。
, 百拇医药
在Rya持续作用下，肌浆网/内质网中的Ca2+可被耗竭。本研究观察到，在 含Ca2+和无Ca2+的缓冲液中 Ang Ⅱ均能引起心肌细胞[Ca2+]i升高； 并且用Rya耗竭心肌细胞内Ca2+贮存池后，Ang Ⅱ仍然可以增加[Ca2+]i;这 表明：Ang Ⅱ可通过增加细胞外Ca2+内流和促进胞内Ca2+释放两种途径引起[ Ca2+]i升高。
我们以前的研究发现，牛磺酸在体内和体外都能抑制Ang Ⅱ对心肌细胞的作用；并推测：牛磺酸的这一作用可能是通过干扰Ang Ⅱ对心肌细胞Ca2+代谢的影响而产生的[3,4]。本研究的结果表明：牛磺酸能够依浓度地抑制Ang Ⅱ引起的心肌细胞[Ca2+]i升高：这一结果证实了我们的推测。本研究发现，牛磺酸在有Ca 2+的缓冲液中能抑制Ang Ⅱ升高[Ca2+]i的作用：而在细胞外无Ca2+时 ，牛磺酸则无此作用。牛磺酸对Rya引起的[Ca2+]i升高无影响，但能显著抑制用Ry a后Ang Ⅱ引起的[Ca2+]i升高。这证明牛磺酸不影响Ang Ⅱ引起的Ca2+释放 ；它可能是通过抑制Ang Ⅱ引起的Ca2+内流而降低心肌细胞[Ca2+]i的。
, 百拇医药
作者简介：葛 慧(1959-),女，青岛人，副教授，从事食品营养学研究
参考文献
[1] 宿燕岗，杨英珍.牛磺酸及其在心血管系统疾病中的应用[J].国外医学 心血管疾病分册，1996，23(3)：138-142.
[2] 陶 亮，王洪新，饶曼人.血管紧张素Ⅱ及牛磺酸对体外培养乳鼠肥大心肌细胞心 律失常的作用[J].药学学报，1995，30(5)：326-330.
[3] 陶 亮，饶曼人.依那普利和牛磺酸逆转肾性高血压大鼠左心室肥厚及抗心律失常 的作用[J].药学学报，1996，31(12)：891-893.
[4] Moser M. Angiotensin-converting enzyme inhibitors, angiotensin Ⅱ recep tor antagonists and calcium channel blocking agents: a review of potential benef its and possible adverse reactions[J]. J Am Coll Cardiol， 1997,29(7):141 4-1421.
, http://www.100md.com
[5] Tao L, Guan YY, He H， et al. Comparison of the Ca2+ movement b y ac tivation of α1-adrenoceptor subtypes in HEK-293 cells[J]. Life Sciences , 1997,61(21):2127-2136.
[6] Grynkienwicz K, Poenie M，Tsien R Y. A new generation of Ca2+ indic ators with greatly improved fluorescence properties[J]. JBiod Chem, 1985 ,260(12):3340-3350.
收稿日期：1998年10月15日；修回日期：1999年7月29日, http://www.100md.com
单位：葛慧 马静 凌文华(中山医科大学公共卫生学院营养系)；陶亮(药理学教研室)；刘培庆(生理学教 研室，广州 510089)
关键词：牛磺酸；血管紧张素Ⅱ；心肌细胞；钙
中国应用生理学杂志000107 摘要 目的和方法：用Fura-2/AM.荧光显示测定细胞内游离Ca2+浓度([Ca 2+]i)的方法，我们研究了牛磺酸(Tau)对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)引起的培养心肌细胞 [Ca2+]i变化的影响。结果：在有Ca2+和无Ca2+的缓冲液 中，Ang Ⅱ(1,10，100，1 000 nmol/L)能浓度依赖性地引起[Ca2+]i升高。在含Ca 2+的缓冲液中，Tau(10,20 mol/L)可依浓度地抑制Ang Ⅱ(100 nmol/L)引起的[Ca 2+]i升高;但在无Ca2+的缓冲液中，牛磺酸无此作用。用ryanodine(Rya，1 μm ol/L)预先耗竭细胞内贮存的Ca2+后，Ang Ⅱ(100 nmol/L)仍能 引起[Ca2+]i进一步升高：Ang Ⅱ的这一作用能被Tau(20 mmol/L)显著抑制。 结论：在培养的乳鼠心肌细胞，Tau能够通过抑制Ang Ⅱ引起的Ca2+内流而拮抗 Ang Ⅱ升高[Ca2+]i的作用。
, http://www.100md.com
中图分类号： Q813.1文献标识码：A 文章编号 ：1000-6834(2000)01-0026-04
EFFECTS OF TAURINE ON CHANGES OF CYTOSOLIC FREE Ca2+ INDUCED BY ANGIOTENSIN Ⅱ IN CULTURED MYOCARDIAL CELLS
GE Hui1, TAO Liang2, LIU Pei-qing3, MA Jing1, LI NG Wen-hua1
(1.Department of Nutriology;2.Department of Pharmacology;3.Dea prtment of Physiology, Sun Yet-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 51 0089)
, 百拇医药
ABSTRACT
Aim and Methods: The effects of taurine (Tau) on the Ca2+ movement induced angiotensin Ⅱ were observed in cultured myocardial cells of neonatal r ats with the fura-2 probe. Results: Ang Ⅱ (1,10,100,1 000 nmo l/ L) increased [Ca2+]i dosedependently in both Ca2+ containing medi um and Ca2+ free medium. The rising [Ca2+]i evoked by AngⅡ (100 n mol/L) were decreased by Tau(10,20 mmol/L)in a concentration-dependent manner i n Ca2+ medium but not in Ca2+ free medium. After depletion of intrac ellular Ca2+ pools with ryanodine (1 μmol/L), AngⅡ caused another increa se in [Ca2+]i. This Ang Ⅱ-induced increase in [Ca2+]i was mark edly inhibited by Tau (20 mmol/L). Conclusion: These results indicat e that the mechanism of antagonistic effects of Tau on Ang Ⅱ-induced Ca2+ movement is related to Tau inhibitory action on the Ca2+ influx evoked b y Ang Ⅱ.
, http://www.100md.com
KEY WORDS： taurine; angiotensin Ⅱ; myocardium cells; calcium
牛磺酸(taurine，Tau)是心脏中含量最丰富的游离氨基酸，近年来发现它有降低血压，保护缺血心肌，强心和抗心律失常等多种作用，但作用机理不明[1]。 我们的研究发现[2,3]：在肾性高血压大鼠，Tau能降低血压，并能降低电刺激引 起的心律失常发生率;并能减少心肌线粒体Ca2+的含量。在培养的心肌细胞，Tau能够 抑制血管紧张素 Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)加快心肌细胞搏动率和增加动作电位振幅、 复极时间及窦性周长的作用。这些结果表明：Tau能拮抗Ang Ⅱ的作用。Ang Ⅱ通过激活心 肌细胞表面的Ang Ⅱ 1受体(AT1受体)而影响心脏的多种功能(如：收缩、代谢、生长、 兴奋和传导等)，并在许多心血管疾病的发生和发展中起重要的作用[4]。我们认为 Tau对Ang Ⅱ的拮抗作用可能是通过干扰Ang Ⅱ对心肌细胞Ca2+代谢的影响而产生的 。为了证实这一推测，本文用fura-2荧光显示测定培养乳鼠心肌细胞内游离Ca2+浓 度([Ca2+]i)的方法，研究了Tau对Ang Ⅱ引起的Ca2+转运变化的影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 药品
fura-2/AM粉剂(sigma)，用DMSO溶解稀释为1 mmol/L的溶液，储存于-20℃冰箱内备 用。ryanodine(Rya)由香港大学生理系馈赠，Ang Ⅱ、Tau、bromodeoxy-uridine(BDU)购 于sigma公司。其余药品、试剂为市售分析纯。
1.2 心肌细胞培养
按文献[4]的方法，在无菌条件下取生后2～4 d的SD大鼠(中山医科大学实验动物中心 提供)的心室，置于Hank’s液中剪碎，用0.06%的胰蛋白酶溶液在磁力搅拌下分散细胞，温 度控制在(37±1)℃；每10 min收集一次细胞，离心后将所得的全部细胞置于含有10%胎牛血 清、青霉素100u、链霉素100 μg/100 ml的DMEM培养基中制成1.5×106cell/ml的悬 液，并加BDU(0.1 mmol/L)抑制非心肌细跑生长。将心肌细胞悬液接种于培养瓶中，送入 通 以5%CO2和95%空气的CO2培养箱中培养。每24 h用含10%胎牛血清的培养基换液一次 。本实验所采用的细胞为培养48 h，已开始出现自发性搏动的心肌细胞。
, http://www.100md.com
1.3 心肌细胞[Ca2+]i的测定[5]
1.3.1 培养心肌细胞fura-2/AM的负载 培养的心肌细胞用0.06%的胰蛋白酶消化后制成细跑悬液，加入2 μmolfura-2/AM，在37℃条件下孵育30 min后，加5倍体积的DMEM/F12(含0.05%BSA)在室温下静置5 min。500 r/min离心2 min，用BSS缓冲液(mmol/L:NaCl 130，KCl 5，MgCl2 1，CaCl2 1.5，HEPES 20，Glucose 10，BSA 1 g，pH 7.4)悬浮细胞，调节细胞密度至3×106cell/ml。将细胞转至石英测量杯中，移入RF-5000荧光分光光度计，在37℃恒温、磁力搅拌下测定细胞[Ca2+]i。若作细胞外无Ca 2+测定，样品最后一次离心前换成无Ca2+的BSS，离心后用无Ca2+的BSS悬 浮细胞，并于测量前1 min在样品中加入200 μmol的 EGTA。所有实验用试剂都经证明无荧 光干扰。
, http://www.100md.com
1.3.2 心肌细胞[Ca2+]i的测定 用RF-5000荧光分光光度计(日本岛津公司)测定心肌胞[Ca2+]i。激发光波长分别为340 nm和380 nm，发射光波长为505 nm，采样间隔为1 s。连续记录心肌细胞在给药前后的荧光强度。根据文献[6]，心肌细胞[Ca2+]i的计算公式为：
[Ca2+]i= Kd×Sb1/Sb2×(R-Rmin)/(Rmax-R)
式中R为实验记录到的两激发光波长的荧光比值(F340/F380)；Kd为fura-2/ Ca2+的解离常数。据文献[6]报道，在37℃下，其Kd值为224 nmol/L。Rmax 为胞内fura-2被Ca2+饱和时两激发光波长的比值。实验中通过加入triton X-100( 终浓度为0.09%)测得;Rmin为 fura-2完全游离，未与Ca2+结合时两激发光波长的 荧光值，通过加入EGTA(终浓度为6 mmol/L)测得；Sb1/Sb2：为Fura-2在无Ca2+以 及与Ca2+结合达到饱和时，于380 nm激发光处的荧光强度之比。细胞自身荧光在没有负载fura-2/AM时进行测定。计算[Ca2+]i前应减去细胞自身的荧光。Tau，Rya和Ang Ⅱ直接加入细胞悬液中，记录加药前后的荧光比值。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理
结果采用均数±标准差(
±s),并进行t检验。2 结果
2.1 心肌细胞的静息[Ga2+]i
本实验测得心肌细脑内静息[Ca2+]i的平均浓度在含Ca2+的缓冲液中为( 84.2±3.4 nmol/L);在无Ca2+液中为(57±6.2 nmol/L)。Tau 5，10，20 mmol/L均不影响心肌细胞静息[Ca2+]i(表1)。
Tab.1 Effect of Tau on [Ca2+]i in cultured myocardialcells of neonetal rat (
±s,n=6) Group, 百拇医药
[Ca2+]i (nmol/L)
Ca2+ cantaning BSS
Ca2+ free BSS
Control
84.2±3.4
57.0±6.2
Tau(mmol/L)
5
82.8±4.1
57.9±3.8
10
, http://www.100md.com
81.6±5.4
56.6±3.2
20
80.5±3.5
55.3±4.5
2.2 Ang Ⅱ对心肌细胞[Ca2+]i的影响
Ang Ⅱ(1，10，100和1 000 nmol/L)呈浓度依赖性地增加心肌细胞[Ca2+]i(图1);在无Ca2+的BSS中，上述浓度的Ang Ⅱ也呈浓度依赖性地增加[Ca2+]i (图2)。在含Ca2+和无Ca2+的BSS中，特异的AT1受体拮抗剂[Sar1，Val 5，Ala8]-Ang Ⅱ可完全抑制Ang Ⅱ升高[Ca2+]i的作用。在含Ca2+B SS中，用Rya(1 μmol/L)预先处理心肌细胞，给药3 min后[Ca2+]i增加了73%； 在此基础上加Ang Ⅱ(100 nmol/L)，心肌细胞[Ca2+]i进一步增加80%(表2)。Tab.2 Effect of Rya (1 μmol/L), Tau (20 m mol/L) andAng Ⅱ (100 nmol/L) on [Ca2+]i in cultured myocar dialcells of neonetal rat (
±s,n=6) Group, http://www.100md.com
[Ca2+]i (nmol/L)
Control
85±13
Rya
147±16* *
Rya+Tau
144±19* *
Rya+AngⅡ
318±18* *
Rya+AngⅡ+Tau
267±21* *# #
, 百拇医药
* * P<0.01, vs control; # # P<0.01, vs Rya+AngⅡ
Fig.1 Effects of Ang Ⅱ (1,10, 100,1 000 nmol/L) and [Sar1, Val5, Ala3]-Ang Ⅱ (1 μmol/L) on [Ca2+]i in cultured rat myocardiac cells in Ca2+ medium (
±s, n=6)* * P<0.01, vs Ang Ⅱ 0 nmol/L;# # P<0.01,vs Ang Ⅱ
, 百拇医药
2.3 Tau对Ang Ⅱ诱导[Ca2+]i变化的影响
在有Ca2+的BSS中，Tau(10，20 mmol/L)能抑制Ang Ⅱ引起的[Ca2+]i 升高，抑制率分别为28%和38%。但在无Ca2+的BSS中，上述浓度的Tau对Ang Ⅱ引起的[Ca2+]i增加无显著影响。Tau(20 mmol/L)对Rya升高心肌细胞[Ca2+]i 的作用无影响，但能明显抑制用Rya预先处理后再加Ang Ⅱ引起的[Ca2+]i升高(图3 ，表2)。
Fig.2 Effects of Ang Ⅱ( 1,10, 100,1000 nmol/L) and [Sar1, Val5, Ala3]-Ang Ⅱ (1 μmol/L) on [C a2+]i in cultured rat myocardiac cells in Ca2+ free medium (
+s,n=6), 百拇医药
* * P<0.01, vs Ang Ⅱ 0 nmol/L; # # P<0.01, vs Ang Ⅱ
Fig.3 Effects of Tau (5,10,2 0 mmol/L) on the changes of [Ca2+]i induced by Ang Ⅱ (100 nmol/L) (
+s,n=6)* * P<0.01, vs Tau 0 mmol/L
3 讨论
大量的研究表明：Ang Ⅱ是与许多心血管疾病(如高血压、充血性心力衰竭、心律失常等)的发生密切相关的体液因子。Ang Ⅱ对心脏功能和结构的作用，主要是通过影响心肌细胞内Ca2+代谢，升高[Ca2+]i而产生的[2]。 本研究证实：Ang Ⅱ能浓度依赖性的增加心肌细胞[Ca2+]i；Ang Ⅱ的这一作用能 被特异的AT1受体拮抗剂[Sar1，Val5，Ala8]-Ang Ⅱ所阻断，这表明Ang Ⅱ升 高[Ca2+]i的作用是由AT1受体介导的。在心肌细胞，受体激动主要通过两种途径 引起[Ca2+]i升高：细胞外Ca2+内流和细胞内肌浆网/内质网贮存的Ca2 +释放 。Rya为肌浆网/内质网膜上Rya敏感Ca2+释放通道的选择性激动剂，它持续开放Rya 敏感Ca2+释放通道，使肌浆网/内质网中的Ca2+流入胞浆，导致[Ca2+ ]i升高。
, 百拇医药
在Rya持续作用下，肌浆网/内质网中的Ca2+可被耗竭。本研究观察到，在 含Ca2+和无Ca2+的缓冲液中 Ang Ⅱ均能引起心肌细胞[Ca2+]i升高； 并且用Rya耗竭心肌细胞内Ca2+贮存池后，Ang Ⅱ仍然可以增加[Ca2+]i;这 表明：Ang Ⅱ可通过增加细胞外Ca2+内流和促进胞内Ca2+释放两种途径引起[ Ca2+]i升高。
我们以前的研究发现，牛磺酸在体内和体外都能抑制Ang Ⅱ对心肌细胞的作用；并推测：牛磺酸的这一作用可能是通过干扰Ang Ⅱ对心肌细胞Ca2+代谢的影响而产生的[3,4]。本研究的结果表明：牛磺酸能够依浓度地抑制Ang Ⅱ引起的心肌细胞[Ca2+]i升高：这一结果证实了我们的推测。本研究发现，牛磺酸在有Ca 2+的缓冲液中能抑制Ang Ⅱ升高[Ca2+]i的作用：而在细胞外无Ca2+时 ，牛磺酸则无此作用。牛磺酸对Rya引起的[Ca2+]i升高无影响，但能显著抑制用Ry a后Ang Ⅱ引起的[Ca2+]i升高。这证明牛磺酸不影响Ang Ⅱ引起的Ca2+释放 ；它可能是通过抑制Ang Ⅱ引起的Ca2+内流而降低心肌细胞[Ca2+]i的。
, 百拇医药
作者简介：葛 慧(1959-),女，青岛人，副教授，从事食品营养学研究
参考文献
[1] 宿燕岗，杨英珍.牛磺酸及其在心血管系统疾病中的应用[J].国外医学 心血管疾病分册，1996，23(3)：138-142.
[2] 陶 亮，王洪新，饶曼人.血管紧张素Ⅱ及牛磺酸对体外培养乳鼠肥大心肌细胞心 律失常的作用[J].药学学报，1995，30(5)：326-330.
[3] 陶 亮，饶曼人.依那普利和牛磺酸逆转肾性高血压大鼠左心室肥厚及抗心律失常 的作用[J].药学学报，1996，31(12)：891-893.
[4] Moser M. Angiotensin-converting enzyme inhibitors, angiotensin Ⅱ recep tor antagonists and calcium channel blocking agents: a review of potential benef its and possible adverse reactions[J]. J Am Coll Cardiol， 1997,29(7):141 4-1421.
, http://www.100md.com
[5] Tao L, Guan YY, He H， et al. Comparison of the Ca2+ movement b y ac tivation of α1-adrenoceptor subtypes in HEK-293 cells[J]. Life Sciences , 1997,61(21):2127-2136.
[6] Grynkienwicz K, Poenie M，Tsien R Y. A new generation of Ca2+ indic ators with greatly improved fluorescence properties[J]. JBiod Chem, 1985 ,260(12):3340-3350.
收稿日期：1998年10月15日；修回日期：1999年7月29日, http://www.100md.com