中研Ⅱ号抗SIVmac感染机理的初步研究
作者：李平 关崇芬
单位：李平 关崇芬(中国中医研究院基础理论研究所 北京 100700)
关键词：中研Ⅱ号；猴免疫缺陷病毒；艾滋病；恒河猴
北京中医药大学学报000108
摘 要：通过体外和体内实验研究中研Ⅱ号抗猴免疫缺陷病毒(SIV)感染作用和免疫调节作用，结果表明：中研Ⅱ号在体外缺乏直接的抗SIV感染作用；而体内实验显示中研Ⅱ号对SIV感染所致的猴艾滋病模型免疫系统的功能状态具有一定的调节作用，表现为抑制感染早期异常的免疫细胞活化，促进晚期抑制状态的免疫细胞活化，对不同感染时期的免疫功能呈双相调节作用。中研Ⅱ号通过对细胞功能紊乱的调节实现其免疫保护作用，这可能是其治疗艾滋病的药理基础。
分类号：R285.5
, 百拇医药
An Initial Study on Mechanism of Zhong-Yan-Ⅱ in Antiviral Activity Against Simian Immunodeficiency Virus
Li Ping,Guan Chongfen
(The Institute of Basic Theory,China Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100700)
ABSTRACT：Zhong-Yan-Ⅱ is an efficient antiviral complex TCM prescription,but the mechanisms of its action have not been identified.Such an understanding would be of vital importance and potentially useful for its application in clinical practice.Aim of this study was to assess the efficacy of Zhong-Yan-Ⅱ in antiviral activity against Simian Immunodeficiency Virus (SIV) and to examine its immunoregulatory effects on T cell function.The in vitro efficacy of antiviral activity was evaluated in a CEM-SIVmac screening assay system.Ex vivo the cell cycle analysis and the IL-2 level by Con A-stimulated PBMCs from SIVmac251-infected monkey were performed.Results suggested that the antiviral efficacy in vivo of Zhong-Yan-Ⅱ was not directly suppressing viral replication and infection.Its efficacy in HIV infection and AIDS was contributed to its ability to regulate the immune function and induce faster reconstitution of the immune system.
, 百拇医药
KEY WORDS：Zhong-Yan-Ⅱ; Simian immunodeficiency virus; Aids▲
中医中药治疗艾滋病的临床疗效已被许多研究证实[1]，但有关中医中药作用的药理机制，特别是复方制剂，却知之不多。本研究通过对临床和整体实验证明[2]具有抗病毒感染作用的中研II号，进行了体外和体内的实验研究，以探讨其作用机制，为其临床应用和进一步的深入研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型[3]
恒河猴，5岁龄，雄性，体重6.7 kg，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。实验前经血清学检查证实无猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆转录D型病毒(SRV)，猴T淋巴细胞I型病毒(STLV-1)感染。毒株SIVmac251，由美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Preston A.Marx博士惠赠，中国医学科学院实验动物研究所保存，贮备病毒滴度为3.2×103 TCID50/mL,感染剂量为3 MID,以病毒分离阳性证明造模成功。
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1.2 药物
中研II号冲剂由北京长城制药厂加工制备，用三蒸水溶解浓度为36 g/L过滤除菌，4 ℃保存备用。叠氮胸苷(Zidovudine,AZT)为Burroughs Wellcome Co.产品，100 mg/粒，用前用三蒸水溶解为1 mol/L，过滤除菌。
1.3 药物抑毒试验[4]
细胞CEM ×174为人 CD4+T淋巴细胞系。24孔培养板，每孔中加入1×108L-1的CEM×174细胞，1×103TCID50/mL的SIVmac悬液，根据实验目的分别加入终浓度为0.27 g/L的中研Ⅱ号，20×10-3mol/L AZT，另设阳性和阴性对照。置37 ℃，5%CO2中培养5 d，进行CPE计数；吸取上清，进行病毒滴度测定及SIVp27抗原测定，洗细胞3次，制备抗原片；感染细胞SIV抗原表达水平的测试用IFA和IEA法，荧光结合物(猴IgG-FITC)和酶结合物(猴IgG-HRP)为医科院动物所自制，普通显微镜下随机计数400个细胞中的阳性细胞数；感染细胞培养上清SIVp27水平的测试用ELISA法(SIV-1 p27 Antigen ELISA Kit为美国Cellular Products Inc.产品)。
, 百拇医药
1.4 感染细胞生长曲线的绘制
MTT法[5]。将细胞浓度为1×108L-1加入24孔板内每孔1 mL，根据实验分别在各孔中加中研Ⅱ号225 μg，AZT 20×10-3mol/L，空白对照，在各孔中加入1×103 TCID50/mL SIVmac毒株悬液100 μL，置于37 ℃，5% CO2培养箱培养，分别于0、3、5、7 d测细胞存活数。
1.5 DNA探针的制备
病毒RNA的提取，按TRIzol LS(B.M)试剂盒提供的方法，病毒RNA的逆转录及特异片断的扩增，引物为：
up stream primer 5'-AAT GAA GAA GCT GCA GAT TGG GAC TTG-3'，down stream primer 3'-GCA CTA GCT TGC AAT CTG GGT TAG C-5'
, 百拇医药
取RNA溶解液10 μL，AMV逆转录酶(AMV Revers Transcriptase，Promega)作用下42 ℃孵育10 min、70 ℃ 5 min、37 ℃ 20 min，收取cDNA 20 μL。取cDNA 10 μL，Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase，P.E)，95 ℃变性3 min，置PCR热循环仪(P.E 480 type)内，于94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min条件下30个循环，72 ℃ 10 min，循环结束。取10 μL扩增产物，行琼酯糖凝胶电泳，观察扩增效率；PCR产物的纯化，Bio-Rad公司Prep-A-GeneDNA纯化系统; DNA探针的地高辛标记，非放射性DNA标记和检测试剂盒(Dig DNA Labeling and Detection Kit，B.M)，在前述PCR扩增条件下进行PCR标记。标记完成后，用4 mol/L的LiCl 2 μL和预冷的乙醇混匀沉淀标记的DNA，置-70 ℃内30 min，用70%的冷乙醇洗1次，空气干燥，用50 μL TE溶后保存于-20 ℃。
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1.6 感染细胞病毒RNA的原位杂交[6]
原位杂交的细胞片制备,将悬浮生长的CEM×174细胞用0.1 mol/L PBS洗涤3次，离心后将悬液吸尽，再用少量液体将细胞悬起，滴加在经0.01%多聚赖氨酸液包被的载玻片上，以细胞铺成单层不重叠为宜，空气干燥，用4%多聚甲醛固定30 min，经预处理后细胞涂片用依次经70%、80%、90%、100%乙醇各5 min逐级脱水，空气干燥，封于塑料袋内保存。将处理过的载玻片经2×SSC预浸，50%去离子甲酰胺孵育，预杂交液42 ℃孵育2 h，进行预杂交；加20 μL预先变性的杂交液，用封口膜封片，54 ℃中杂交10 min，置湿盒中，37 ℃过夜；经洗片后，加1∶1 500稀释的抗Dig抗体(PBS)液于细胞表面，37 ℃孵育30 min，洗片3次，碱性磷酸酶缓冲液室温孵育2 min，加BCIP/NBT显色液，置湿盒中，定期镜下观察着色情况。TE终止反应，按顺序经70%、80%、90%和95%乙醇各5 min脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，避光保存。
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1.7 感染猴淋巴细胞培养和刺激[7]
将分离所得感染猴PBMC用完全RBMI 1640培养液重悬，移入24孔培养板中，调整细胞浓度为1×106细胞/每孔，根据实验要求在各孔中加入终浓度为120 mg/L的中研Ⅱ号和5 mg/L的ConA刺激液(Sigma)，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养刺激72 h。
1.8 细胞周期分析[8]
培养72 h的细胞上清移入0.5 mL的小离心管，分装冻存于-70 ℃保存，检测IL-2水平。洗细胞3次，用2%多聚甲醛磷酸缓冲液于4 ℃固定，过夜。洗细胞2次，用碘化丙啶(Sigma)染液1 mL重悬细胞，流式细胞仪分析(FACS Caliber，B.D)。分析软件为Cell FIT Cell-Cycle Analysis Version 2.01.2。结果以S期细胞百分比(S-phase fraction，SPF)和增殖指数(Proliferous Index ，PI即为S+G2+M期细胞百分比)表示。
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1.9 培养上清IL-2表达水平的测定
选用IL-2 IMMUNOTECH Enzyme Immunoassay Kit (Immunotech)。按操作手册方法检测,每份样品重复4次。
2 实验结果
2.1 中研Ⅱ号对体外病毒感染的影响
利用CEM×174-SIV药物筛选系统观察中研Ⅱ号体外抑病毒作用，结果显示，中研Ⅱ号对CPE形成和培养上清SIVp27抗原水平的抑制作用较为明显，抑制率分别达到43.97%和49.62%，上清病毒滴度有所降低；而对病毒感染细胞数的作用不明显，抑制率仅为11.54%～19.54%。结果表明，中研II号对感染过程和感染细胞的影响不大，其作用更多地表现在对感染形成后环节的干扰。见表1。
表1 中研Ⅱ号体外抑病毒作用 组 别
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CPE
IFA
IEA
病毒滴度
SIVp27抗原
计数
抑制率/%
含病毒
细胞数
抑制率/%
含病毒
细胞数
抑制率/%
, 百拇医药
OD
抑制率/%
中研Ⅱ号组
65
43.97
70
19.54
46
11.54
1∶40
2.177
49.62
AZT组
, 百拇医药
78
32.28
37
57.48
20
61.54
1∶20
2.244
48.07
感染对照组
116
—
87
, http://www.100md.com
—
52
—
1∶80
4.321
—
阴性对照组
—
—
—
—
—
—
—
, 百拇医药
0.086
—
注：计数和含病毒细胞数均为镜下400个细胞中的阳性细胞
2.2 中研Ⅱ号对感染细胞生长的影响
在感染后3 d内，各组细胞生长良好，数量差别不大；到5 d时，感染各组细胞生长速度开始减慢，其中以感染对照组最为明显，表明在此段时间内中研Ⅱ号和AZT对感染细胞有一定的保护作用；培养至7 d时，中研Ⅱ号组和感染对照组的细胞大量死亡，细胞数量急剧减少，两者速度基本平行，而AZT组细胞数量相对稳定。阴性对照细胞数量的下降原因为细胞生长过密，说明中研Ⅱ号在体外保护细胞的作用十分有限，一旦病毒感染建立，开始大量复制繁殖，中研Ⅱ号对细胞基本失去保护作用；同时进一步表明，中研Ⅱ号对病毒感染复制繁殖过程影响不大。见表2。
表2 感染不同时期细胞数量的变化(mL-1) 组 别
, 百拇医药
3 d
5 d
7 d
中研Ⅱ号组
1.39×106
2.48×106
0.525×106
AZT组
1.18×106
2.75×106
2.62×106
, 百拇医药
感染对照组
1.29×106
1.81×106
<0.05×106
阴性对照组
1.26×106
3.80×106
2.83×106
2.3 中研Ⅱ号对细胞病毒RNA复制水平的影响
采用SIVmac251gag基因内特异DNA片段为探针，观察感染7 d时细胞病毒RNA水平，中研Ⅱ号处理细胞内有大量病毒RNA表达，并伴有明显的CPE形成；而AZT组亦有杂交阳性细胞，但无论是阳性细胞数，还是CPE病变程度均较中研Ⅱ号和感染对照轻。本结果从分子水平证实，中研Ⅱ号在体外单独使用时，其对病毒的抑制作用并不明显。
, 百拇医药
2.4 中研Ⅱ号对感染猴外周血淋巴细胞活化增殖反应的影响
正常细胞在经历72 h刺激后，SPF从4.5%上升到49.9%，说明正常细胞在这一刺激条件下，有半数的细胞由G0/G1期进入S期，处于活化增殖状态。而在感染2周时，细胞对ConA刺激的反应比正常细胞明显增强，表明有大量淋巴细胞被活化；到感染3～4周时，在同样刺激条件下，进入S期的细胞明显减低，SPF仅为9.8%，表明SIV感染细胞存在严重的功能障碍。而当加入中研Ⅱ号后，感染2周时的细胞活化作用被明显的抑制，3～4周时处于抑制状态细胞对Con A刺激的增殖反应得到部分恢复。显示了中研Ⅱ号对SIV感染所致的细胞功能紊乱具有双相调节作用。见图1。
图1 中研Ⅱ号对感染猴淋巴细胞细胞周期分析的影响
, http://www.100md.com 2.5 中研Ⅱ号对SIV感染淋巴细胞分泌IL-2的影响
未感染的正常淋巴细胞对Con A刺激具有高水平表达IL-2的特点(从刺激前的4.5上升到88.66 pg/mL)。SIV感染后2周，IL-2表达水平明显降低，说明感染抑制了IL-2产生和分泌；到4周时，IL-2分泌虽有所增加，但不能恢复到正常水平。中研Ⅱ号处理细胞对感染2周细胞分泌水平影响不大，这与其对细胞周期的影响是一致的，但明显促进感染4周细胞合成IL-2，并已接近正常水平(84.33 pg/mL)。见图2。
图2 中研Ⅱ号对感染细胞分泌IL-2的影响
3 讨 论
HIV感染和艾滋病的治疗分为阻止病毒复制、清除感染细胞和感染并发症的预防、治疗两部分，治疗的目的就是防止和推迟免疫缺陷的形成。
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艾滋病的发生涉及感染病原和机体免疫功能状态两方面。在HIV感染过程中，进入机体的病毒首先大量复制，此时针对病毒感染的机体免疫反应异常活跃，大量的淋巴细胞被活化[9],它们在调节病毒复制、控制病毒播散等方面起着重要作用。但大量活化细胞的存在则又是病毒复制和感染所依赖的条件[10]。免疫系统针对HIV的免疫应答，一方面是机体防御HIV感染的机制，另一方面活化的免疫细胞则又成为病毒攻击的靶子，导致大量特异增殖的细胞克隆被灭活。被损伤的细胞主要是针对HIV的特异细胞毒T淋巴细胞(CTL)和CD+4辅助T淋巴细胞，这些细胞克隆的灭活对免疫系统的打击是致命的，是免疫系统走向全面崩溃的直接原因。而到疾病的后期，随着病毒感染的播散，受累的细胞数量逐渐增多，机体免疫功能逐渐衰竭。而且，由于病毒基因表达、病毒蛋白和分泌抑制性细胞因子对淋巴细胞功能的抑制，造成机体免疫系统缺陷。所以，免疫系统在感染过程和疾病不同阶段的变化既是病毒感染的直接后果，又是病毒感染免疫病理损伤的基础。针对感染不同阶段免疫系统的功能状态采取不同的保护措施，对控制病情的发展和预后是十分有益的。
, 百拇医药
中医学认为人体是一个统一、协调的整体，机体内各个系统相互滋助与相互制约，是维持生命活动自稳状态的保证。无论是外界还是内部致病因素，最终都是导致机体的调节功能发生紊乱，从而形成疾病。所以，在艾滋病疗法的研究中，中医在重视寻找直接抑制病毒药物的同时，强调治疗时药物选择与患者的机能状态，即药物与证候的统一，药物产生的疗效是在与机体这一大环境的相互作用中表现和发挥出来的。它不是药物与病原之间的一对一关系，而更可能是药物对机体的多靶点作用。通过调动机体各方面的机能，形成机体的整体调节作用。而抗病毒疗法则不同，其治疗原则就是直接作用于致病原，治疗就是针对性的直接消除病原因素。所以，两种药物疗效的作用机制是不一样的。中医药的疗效只有在与机体整体的相互作用中才能实现，而抗病毒疗法则可以通过针对特定致病原的直接作用中看到。
中研Ⅱ号体外实验并没有得到满意的抗病毒作用，但在与猴外周淋巴细胞的作用时表现出对细胞功能状态的调节，在感染早期对异常活化免疫细胞的抑制，具有保护淋巴细胞免于病毒感染，抑制病毒在体内播散的作用；在感染后期则促进细胞分泌IL-2和增殖活化，恢复被抑制的免疫系统功能，调动机体内固有的抗病自愈能力，清除病毒及感染细胞。从中研Ⅱ号对免疫系统的影响，可以看到其作用可能是多环节、多位点，这不同与一般的免疫替代疗法，其机理的深入研究和探索，将会为中医药治疗艾滋病提供更多的思路和线索。
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本研究工作得到了中国医学科学院实验动物研究所病毒室何伏秋，宋怀燕，蒋虹，丛吉 吉，佟巍等诸位老师的指导和帮助，在此表示衷心地感谢。■
基金项目：“九五”国家科技攻关项目(No.96-906-08-05)
作者简介：李平,男,40岁,医学博士,主治医师
参考文献：
[1]吕维柏.中西医结合治疗艾滋病.北京:人民卫生出版社，1995.170～187
[2]李 平，王 慧，关崇芬.中研Ⅱ号抗猴免疫缺陷病毒SIVmac 251感染的实验研究.中国中医基础理论杂志，1998， 4:26～29
[3]卢耀增，吴小娴，何伏秋，等.猴免疫缺陷病毒(SIV)猴模型的建立.中国实验动物学报，1994.2(2):95～101
, 百拇医药
[4]司徒镇强，吴军正.细胞培养.北京：世界图书出版社，1996.175～176
[5]Dalgleish AG,Weiss RA.AIDS and the New Viruses.London：Academic Press，1990.56～58
[6]姜 泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1995.128～151
[7]薛 彬.免疫毒理学实验技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995.19～21
[8]Gruters RA,Terpstra FG,De Jong R,et al.Selective Loss of T Cell Functions in Different Stages of HIV Infection.Eur J Immunol,1990,20:1039～1044
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[9]Pantaleo G,Demarest JF,Sondeyns H,et al.Major Expansion of CD+8 T Cell with a Predominant V β Usage during the Primary Immune Response of HIV.Nature,1994,370: 463～467
[10]Siekevite M,Josephs SF,Dukovich M,et al..Activation of the HIV-1 LTR by T Cell Mitogens and the Trous-activator Protein of HTLV-1.Science,1987,238:1575～1578
(收稿日期：1999-08-26), 百拇医药
单位：李平 关崇芬(中国中医研究院基础理论研究所 北京 100700)
关键词：中研Ⅱ号；猴免疫缺陷病毒；艾滋病；恒河猴
北京中医药大学学报000108
摘 要：通过体外和体内实验研究中研Ⅱ号抗猴免疫缺陷病毒(SIV)感染作用和免疫调节作用，结果表明：中研Ⅱ号在体外缺乏直接的抗SIV感染作用；而体内实验显示中研Ⅱ号对SIV感染所致的猴艾滋病模型免疫系统的功能状态具有一定的调节作用，表现为抑制感染早期异常的免疫细胞活化，促进晚期抑制状态的免疫细胞活化，对不同感染时期的免疫功能呈双相调节作用。中研Ⅱ号通过对细胞功能紊乱的调节实现其免疫保护作用，这可能是其治疗艾滋病的药理基础。
分类号：R285.5
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An Initial Study on Mechanism of Zhong-Yan-Ⅱ in Antiviral Activity Against Simian Immunodeficiency Virus
Li Ping,Guan Chongfen
(The Institute of Basic Theory,China Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100700)
ABSTRACT：Zhong-Yan-Ⅱ is an efficient antiviral complex TCM prescription,but the mechanisms of its action have not been identified.Such an understanding would be of vital importance and potentially useful for its application in clinical practice.Aim of this study was to assess the efficacy of Zhong-Yan-Ⅱ in antiviral activity against Simian Immunodeficiency Virus (SIV) and to examine its immunoregulatory effects on T cell function.The in vitro efficacy of antiviral activity was evaluated in a CEM-SIVmac screening assay system.Ex vivo the cell cycle analysis and the IL-2 level by Con A-stimulated PBMCs from SIVmac251-infected monkey were performed.Results suggested that the antiviral efficacy in vivo of Zhong-Yan-Ⅱ was not directly suppressing viral replication and infection.Its efficacy in HIV infection and AIDS was contributed to its ability to regulate the immune function and induce faster reconstitution of the immune system.
, 百拇医药
KEY WORDS：Zhong-Yan-Ⅱ; Simian immunodeficiency virus; Aids▲
中医中药治疗艾滋病的临床疗效已被许多研究证实[1]，但有关中医中药作用的药理机制，特别是复方制剂，却知之不多。本研究通过对临床和整体实验证明[2]具有抗病毒感染作用的中研II号，进行了体外和体内的实验研究，以探讨其作用机制，为其临床应用和进一步的深入研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型[3]
恒河猴，5岁龄，雄性，体重6.7 kg，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。实验前经血清学检查证实无猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆转录D型病毒(SRV)，猴T淋巴细胞I型病毒(STLV-1)感染。毒株SIVmac251，由美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Preston A.Marx博士惠赠，中国医学科学院实验动物研究所保存，贮备病毒滴度为3.2×103 TCID50/mL,感染剂量为3 MID,以病毒分离阳性证明造模成功。
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1.2 药物
中研II号冲剂由北京长城制药厂加工制备，用三蒸水溶解浓度为36 g/L过滤除菌，4 ℃保存备用。叠氮胸苷(Zidovudine,AZT)为Burroughs Wellcome Co.产品，100 mg/粒，用前用三蒸水溶解为1 mol/L，过滤除菌。
1.3 药物抑毒试验[4]
细胞CEM ×174为人 CD4+T淋巴细胞系。24孔培养板，每孔中加入1×108L-1的CEM×174细胞，1×103TCID50/mL的SIVmac悬液，根据实验目的分别加入终浓度为0.27 g/L的中研Ⅱ号，20×10-3mol/L AZT，另设阳性和阴性对照。置37 ℃，5%CO2中培养5 d，进行CPE计数；吸取上清，进行病毒滴度测定及SIVp27抗原测定，洗细胞3次，制备抗原片；感染细胞SIV抗原表达水平的测试用IFA和IEA法，荧光结合物(猴IgG-FITC)和酶结合物(猴IgG-HRP)为医科院动物所自制，普通显微镜下随机计数400个细胞中的阳性细胞数；感染细胞培养上清SIVp27水平的测试用ELISA法(SIV-1 p27 Antigen ELISA Kit为美国Cellular Products Inc.产品)。
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1.4 感染细胞生长曲线的绘制
MTT法[5]。将细胞浓度为1×108L-1加入24孔板内每孔1 mL，根据实验分别在各孔中加中研Ⅱ号225 μg，AZT 20×10-3mol/L，空白对照，在各孔中加入1×103 TCID50/mL SIVmac毒株悬液100 μL，置于37 ℃，5% CO2培养箱培养，分别于0、3、5、7 d测细胞存活数。
1.5 DNA探针的制备
病毒RNA的提取，按TRIzol LS(B.M)试剂盒提供的方法，病毒RNA的逆转录及特异片断的扩增，引物为：
up stream primer 5'-AAT GAA GAA GCT GCA GAT TGG GAC TTG-3'，down stream primer 3'-GCA CTA GCT TGC AAT CTG GGT TAG C-5'
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取RNA溶解液10 μL，AMV逆转录酶(AMV Revers Transcriptase，Promega)作用下42 ℃孵育10 min、70 ℃ 5 min、37 ℃ 20 min，收取cDNA 20 μL。取cDNA 10 μL，Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase，P.E)，95 ℃变性3 min，置PCR热循环仪(P.E 480 type)内，于94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min条件下30个循环，72 ℃ 10 min，循环结束。取10 μL扩增产物，行琼酯糖凝胶电泳，观察扩增效率；PCR产物的纯化，Bio-Rad公司Prep-A-GeneDNA纯化系统; DNA探针的地高辛标记，非放射性DNA标记和检测试剂盒(Dig DNA Labeling and Detection Kit，B.M)，在前述PCR扩增条件下进行PCR标记。标记完成后，用4 mol/L的LiCl 2 μL和预冷的乙醇混匀沉淀标记的DNA，置-70 ℃内30 min，用70%的冷乙醇洗1次，空气干燥，用50 μL TE溶后保存于-20 ℃。
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1.6 感染细胞病毒RNA的原位杂交[6]
原位杂交的细胞片制备,将悬浮生长的CEM×174细胞用0.1 mol/L PBS洗涤3次，离心后将悬液吸尽，再用少量液体将细胞悬起，滴加在经0.01%多聚赖氨酸液包被的载玻片上，以细胞铺成单层不重叠为宜，空气干燥，用4%多聚甲醛固定30 min，经预处理后细胞涂片用依次经70%、80%、90%、100%乙醇各5 min逐级脱水，空气干燥，封于塑料袋内保存。将处理过的载玻片经2×SSC预浸，50%去离子甲酰胺孵育，预杂交液42 ℃孵育2 h，进行预杂交；加20 μL预先变性的杂交液，用封口膜封片，54 ℃中杂交10 min，置湿盒中，37 ℃过夜；经洗片后，加1∶1 500稀释的抗Dig抗体(PBS)液于细胞表面，37 ℃孵育30 min，洗片3次，碱性磷酸酶缓冲液室温孵育2 min，加BCIP/NBT显色液，置湿盒中，定期镜下观察着色情况。TE终止反应，按顺序经70%、80%、90%和95%乙醇各5 min脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，避光保存。
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1.7 感染猴淋巴细胞培养和刺激[7]
将分离所得感染猴PBMC用完全RBMI 1640培养液重悬，移入24孔培养板中，调整细胞浓度为1×106细胞/每孔，根据实验要求在各孔中加入终浓度为120 mg/L的中研Ⅱ号和5 mg/L的ConA刺激液(Sigma)，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养刺激72 h。
1.8 细胞周期分析[8]
培养72 h的细胞上清移入0.5 mL的小离心管，分装冻存于-70 ℃保存，检测IL-2水平。洗细胞3次，用2%多聚甲醛磷酸缓冲液于4 ℃固定，过夜。洗细胞2次，用碘化丙啶(Sigma)染液1 mL重悬细胞，流式细胞仪分析(FACS Caliber，B.D)。分析软件为Cell FIT Cell-Cycle Analysis Version 2.01.2。结果以S期细胞百分比(S-phase fraction，SPF)和增殖指数(Proliferous Index ，PI即为S+G2+M期细胞百分比)表示。
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1.9 培养上清IL-2表达水平的测定
选用IL-2 IMMUNOTECH Enzyme Immunoassay Kit (Immunotech)。按操作手册方法检测,每份样品重复4次。
2 实验结果
2.1 中研Ⅱ号对体外病毒感染的影响
利用CEM×174-SIV药物筛选系统观察中研Ⅱ号体外抑病毒作用，结果显示，中研Ⅱ号对CPE形成和培养上清SIVp27抗原水平的抑制作用较为明显，抑制率分别达到43.97%和49.62%，上清病毒滴度有所降低；而对病毒感染细胞数的作用不明显，抑制率仅为11.54%～19.54%。结果表明，中研II号对感染过程和感染细胞的影响不大，其作用更多地表现在对感染形成后环节的干扰。见表1。
表1 中研Ⅱ号体外抑病毒作用 组 别
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CPE
IFA
IEA
病毒滴度
SIVp27抗原
计数
抑制率/%
含病毒
细胞数
抑制率/%
含病毒
细胞数
抑制率/%
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OD
抑制率/%
中研Ⅱ号组
65
43.97
70
19.54
46
11.54
1∶40
2.177
49.62
AZT组
, 百拇医药
78
32.28
37
57.48
20
61.54
1∶20
2.244
48.07
感染对照组
116
—
87
, http://www.100md.com
—
52
—
1∶80
4.321
—
阴性对照组
—
—
—
—
—
—
—
, 百拇医药
0.086
—
注：计数和含病毒细胞数均为镜下400个细胞中的阳性细胞
2.2 中研Ⅱ号对感染细胞生长的影响
在感染后3 d内，各组细胞生长良好，数量差别不大；到5 d时，感染各组细胞生长速度开始减慢，其中以感染对照组最为明显，表明在此段时间内中研Ⅱ号和AZT对感染细胞有一定的保护作用；培养至7 d时，中研Ⅱ号组和感染对照组的细胞大量死亡，细胞数量急剧减少，两者速度基本平行，而AZT组细胞数量相对稳定。阴性对照细胞数量的下降原因为细胞生长过密，说明中研Ⅱ号在体外保护细胞的作用十分有限，一旦病毒感染建立，开始大量复制繁殖，中研Ⅱ号对细胞基本失去保护作用；同时进一步表明，中研Ⅱ号对病毒感染复制繁殖过程影响不大。见表2。
表2 感染不同时期细胞数量的变化(mL-1) 组 别
, 百拇医药
3 d
5 d
7 d
中研Ⅱ号组
1.39×106
2.48×106
0.525×106
AZT组
1.18×106
2.75×106
2.62×106
, 百拇医药
感染对照组
1.29×106
1.81×106
<0.05×106
阴性对照组
1.26×106
3.80×106
2.83×106
2.3 中研Ⅱ号对细胞病毒RNA复制水平的影响
采用SIVmac251gag基因内特异DNA片段为探针，观察感染7 d时细胞病毒RNA水平，中研Ⅱ号处理细胞内有大量病毒RNA表达，并伴有明显的CPE形成；而AZT组亦有杂交阳性细胞，但无论是阳性细胞数，还是CPE病变程度均较中研Ⅱ号和感染对照轻。本结果从分子水平证实，中研Ⅱ号在体外单独使用时，其对病毒的抑制作用并不明显。
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2.4 中研Ⅱ号对感染猴外周血淋巴细胞活化增殖反应的影响
正常细胞在经历72 h刺激后，SPF从4.5%上升到49.9%，说明正常细胞在这一刺激条件下，有半数的细胞由G0/G1期进入S期，处于活化增殖状态。而在感染2周时，细胞对ConA刺激的反应比正常细胞明显增强，表明有大量淋巴细胞被活化；到感染3～4周时，在同样刺激条件下，进入S期的细胞明显减低，SPF仅为9.8%，表明SIV感染细胞存在严重的功能障碍。而当加入中研Ⅱ号后，感染2周时的细胞活化作用被明显的抑制，3～4周时处于抑制状态细胞对Con A刺激的增殖反应得到部分恢复。显示了中研Ⅱ号对SIV感染所致的细胞功能紊乱具有双相调节作用。见图1。
图1 中研Ⅱ号对感染猴淋巴细胞细胞周期分析的影响
, http://www.100md.com 2.5 中研Ⅱ号对SIV感染淋巴细胞分泌IL-2的影响
未感染的正常淋巴细胞对Con A刺激具有高水平表达IL-2的特点(从刺激前的4.5上升到88.66 pg/mL)。SIV感染后2周，IL-2表达水平明显降低，说明感染抑制了IL-2产生和分泌；到4周时，IL-2分泌虽有所增加，但不能恢复到正常水平。中研Ⅱ号处理细胞对感染2周细胞分泌水平影响不大，这与其对细胞周期的影响是一致的，但明显促进感染4周细胞合成IL-2，并已接近正常水平(84.33 pg/mL)。见图2。
图2 中研Ⅱ号对感染细胞分泌IL-2的影响
3 讨 论
HIV感染和艾滋病的治疗分为阻止病毒复制、清除感染细胞和感染并发症的预防、治疗两部分，治疗的目的就是防止和推迟免疫缺陷的形成。
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艾滋病的发生涉及感染病原和机体免疫功能状态两方面。在HIV感染过程中，进入机体的病毒首先大量复制，此时针对病毒感染的机体免疫反应异常活跃，大量的淋巴细胞被活化[9],它们在调节病毒复制、控制病毒播散等方面起着重要作用。但大量活化细胞的存在则又是病毒复制和感染所依赖的条件[10]。免疫系统针对HIV的免疫应答，一方面是机体防御HIV感染的机制，另一方面活化的免疫细胞则又成为病毒攻击的靶子，导致大量特异增殖的细胞克隆被灭活。被损伤的细胞主要是针对HIV的特异细胞毒T淋巴细胞(CTL)和CD+4辅助T淋巴细胞，这些细胞克隆的灭活对免疫系统的打击是致命的，是免疫系统走向全面崩溃的直接原因。而到疾病的后期，随着病毒感染的播散，受累的细胞数量逐渐增多，机体免疫功能逐渐衰竭。而且，由于病毒基因表达、病毒蛋白和分泌抑制性细胞因子对淋巴细胞功能的抑制，造成机体免疫系统缺陷。所以，免疫系统在感染过程和疾病不同阶段的变化既是病毒感染的直接后果，又是病毒感染免疫病理损伤的基础。针对感染不同阶段免疫系统的功能状态采取不同的保护措施，对控制病情的发展和预后是十分有益的。
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中医学认为人体是一个统一、协调的整体，机体内各个系统相互滋助与相互制约，是维持生命活动自稳状态的保证。无论是外界还是内部致病因素，最终都是导致机体的调节功能发生紊乱，从而形成疾病。所以，在艾滋病疗法的研究中，中医在重视寻找直接抑制病毒药物的同时，强调治疗时药物选择与患者的机能状态，即药物与证候的统一，药物产生的疗效是在与机体这一大环境的相互作用中表现和发挥出来的。它不是药物与病原之间的一对一关系，而更可能是药物对机体的多靶点作用。通过调动机体各方面的机能，形成机体的整体调节作用。而抗病毒疗法则不同，其治疗原则就是直接作用于致病原，治疗就是针对性的直接消除病原因素。所以，两种药物疗效的作用机制是不一样的。中医药的疗效只有在与机体整体的相互作用中才能实现，而抗病毒疗法则可以通过针对特定致病原的直接作用中看到。
中研Ⅱ号体外实验并没有得到满意的抗病毒作用，但在与猴外周淋巴细胞的作用时表现出对细胞功能状态的调节，在感染早期对异常活化免疫细胞的抑制，具有保护淋巴细胞免于病毒感染，抑制病毒在体内播散的作用；在感染后期则促进细胞分泌IL-2和增殖活化，恢复被抑制的免疫系统功能，调动机体内固有的抗病自愈能力，清除病毒及感染细胞。从中研Ⅱ号对免疫系统的影响，可以看到其作用可能是多环节、多位点，这不同与一般的免疫替代疗法，其机理的深入研究和探索，将会为中医药治疗艾滋病提供更多的思路和线索。
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本研究工作得到了中国医学科学院实验动物研究所病毒室何伏秋，宋怀燕，蒋虹，丛吉 吉，佟巍等诸位老师的指导和帮助，在此表示衷心地感谢。■
基金项目：“九五”国家科技攻关项目(No.96-906-08-05)
作者简介：李平,男,40岁,医学博士,主治医师
参考文献：
[1]吕维柏.中西医结合治疗艾滋病.北京:人民卫生出版社，1995.170～187
[2]李 平，王 慧，关崇芬.中研Ⅱ号抗猴免疫缺陷病毒SIVmac 251感染的实验研究.中国中医基础理论杂志，1998， 4:26～29
[3]卢耀增，吴小娴，何伏秋，等.猴免疫缺陷病毒(SIV)猴模型的建立.中国实验动物学报，1994.2(2):95～101
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[4]司徒镇强，吴军正.细胞培养.北京：世界图书出版社，1996.175～176
[5]Dalgleish AG,Weiss RA.AIDS and the New Viruses.London：Academic Press，1990.56～58
[6]姜 泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1995.128～151
[7]薛 彬.免疫毒理学实验技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995.19～21
[8]Gruters RA,Terpstra FG,De Jong R,et al.Selective Loss of T Cell Functions in Different Stages of HIV Infection.Eur J Immunol,1990,20:1039～1044
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[9]Pantaleo G,Demarest JF,Sondeyns H,et al.Major Expansion of CD+8 T Cell with a Predominant V β Usage during the Primary Immune Response of HIV.Nature,1994,370: 463～467
[10]Siekevite M,Josephs SF,Dukovich M,et al..Activation of the HIV-1 LTR by T Cell Mitogens and the Trous-activator Protein of HTLV-1.Science,1987,238:1575～1578
(收稿日期：1999-08-26), 百拇医药