血管紧张素Ⅱ对人肾成纤维细胞的影响
作者：方勤 屈燧林 陈高翔
单位：方勤(华西医科大学附属第一医院肾内科 成都，610041)；屈燧林(华西医科大学附属第一医院肾内科 成都，610041)；陈高翔(华西医科大学附属第一医院肾内科 成都，610041)
关键词：血管紧张素Ⅱ；肾成纤维细胞；胶原酶活性
肾脏病与透析肾移植杂志000108 摘 要 目的：观察血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对人肾成纤维细胞(KFB)的影响。 方法：采用ELISA法、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪、免疫组织化学法分别检测Ang Ⅱ对KFB分泌的胶原酶活性、KFB增生、凋亡、Ⅰ型胶原表达的影响。 结果：Ang Ⅱ能提高KFB分泌的总胶原酶活性、促进KFB增生、抑制KFB凋亡、促进KFB Ⅰ型胶原的表达。 结论：Ang Ⅱ能通过促进KFB增生、抑制KFB凋亡、促进KFB Ⅰ型胶原的表达来促进肾间质纤维化。
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EFFECTS OF ANGIOTENSIN Ⅱ ON HUMAN KIDNEY FIBROBLAST
FAN Qin QU Shilin CHENG Gaoxiang
(Division of Nephrology，Department of Medicine，the First University Hospital，West China University of Medical Science，Chendu 610041)
OBJECTIVE To study the effects of angiotensing Ⅱ on human kidney fibroblasts(KFB)in its secreted collagenases activity，proliferation，apoptosis and expression of type Ⅰ collagen. METHODOLOGY The activity of type Ⅰ collagenase，KFB apoptosis，proliferation and collagen Ⅰ expression were detected by ELISA，flow cytometer，MTT and immunohistochemical method respectively. RESULTS Angiotensin Ⅱ enhanced the activity of collagenase secredted by KFB，inhibited KFBs apoptosis，promoted the KFBs proliferation and enhanced the expression of type Ⅰ collagen in KFB. CONCLUSION Angiotensin Ⅱ can induce renal fibrosis by inhibiting apoptosis，promoting proliferation and expression of type Ⅰ collagen of KFB.
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Key words angiotensin Ⅱ fibroblasts apoptosis
肾间质纤维化是多种肾脏病发展至终末期肾功能衰竭的共同通路[1]，因而及早阻止甚至逆转肾间质纤维化对防治终末期肾功能衰竭具有重大意义。研究表明，人肾成纤维细胞(KFB)是肾间质的主要重构细胞，在肾间质纤维化中起重要作用[2]。肾间质纤维化的主要原因是KFB增生及细胞外基质(ECM)过度堆积。KFB增生与细胞增生活跃而凋亡减少有关；ECM堆积与ECM产生及分解失衡相关。近年的研究表明，血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)不仅通过改变肾小球血流动力学促进肾小球硬化，还可通过发挥肾脏生长因子的作用促进系膜细胞(MsC)、血管平滑肌细胞、肾小管细胞增生及ECM堆积，并且Ang Ⅱ的这些作用可能通过诱导细胞产生自分泌因子而介导[3～6]。然而，却缺乏Ang Ⅱ对人胚胎KFB影响的研究，因此，本实验首次研究了Ang Ⅱ对人胚胎KFB的影响，以探索Ang Ⅱ在肾间质纤维化中的作用。
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1 材料和方法
1.1 药品和试剂 MEM-F12(GIBCO公司)，鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体、人Ⅰ型胶原、胰蛋白酶抑制剂(SIGMA公司)，亲和素生物素复合物(ABC)试剂盒(VECTOR公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠Ⅱ抗(华美公司)，二甲亚砜(MERCK公司)，灭活新生小牛血清(四川洪雅力生生化厂)，胰蛋白酶(DIFCO公司)，青霉素、链霉素(华北制药厂)，OPD(西安化学试剂厂)，MTT(上海华顺生物试剂厂)，多聚赖氨酸(中山公司)。
1.2 方 法
1.2.1 KFB培养及鉴定 KFB的培养：用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液冲洗水囊引产的5月龄新鲜胎儿肾脏，小心剪去肾脏表面附着的结缔组织及肾皮质，再用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液反复冲洗髓质组织，剪成1×1mm3的碎块，加入0.1%(w/v)胶原酶Ⅳ 1ml消化组织，用200目细胞筛过滤消化液，收集滤液于离心管中，1 000 r/min离心5min，然后用PBS洗涤三次，用DMEM-F12洗涤一次。洗涤后加入含20%灭活的新生小牛血清的DMEM-F12培养基，悬浮细胞，用台盼蓝染色计数，成活率为96%。将细胞悬液接种于75cm2培养瓶中(密度为2×106/瓶)，于37℃、5%CO2孵箱中孵育。次日换液，待细胞生长为单层后，用0.25%的胰蛋白酶于室温消化3min后用含20%的小牛血清的DMEM-F12悬浮细胞行1∶2扩增传代。
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KFB的鉴定：培养的细胞经相差显微镜、透射电镜及免疫学(细胞胞浆肌动蛋白、波形蛋白及Ⅰ型胶原染色阳性)鉴定证实为人胎KFB。
1.2.2 Ang Ⅱ对KFB表达Ⅰ型胶原酶活性的影响 参照文献[7]的方法检测胶原酶的活性，并加以改进。
(1)将3～5代的KFB接种于24孔培养板中，每孔的接种密度为5×107/L。在5%CO2，37℃孵育24 h后，更换成无血清DMEM-F12培养液，继续培养24 h，然后将细胞分为4组：细胞培养板中Ang Ⅱ的终浓度分别为10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、0 mol/L(对照)。每浓度时间点设3复孔。在第24、48及72 h检测培养板各孔胶原酶的活性。
(2)胶原酶活性的检测方法
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包被胶原：将人Ⅰ型胶原溶解于0.4 mol/L的醋酸中，配制成1 g/L的胶原溶液(pH 6.9)，临用前将此溶液用PBS稀释至10 mg/L。酶标板中每孔均加入100 μl的胶原稀释液，于湿盒中4℃包被24 h，次日弃去酶标板中的液体，并用含0.5%(v/v)Tween-20浓度为0.01 mol/L的PBS(pH 7.2)反复清洗酶标板三次。
封闭酶标板：酶标板中加入1%(w/v)的牛血清白蛋白(200 μl/孔)，于37℃孵育1 h，再用PBS反复清洗酶标板。
检测样品：收集细胞培养板中的上清，加入用胶原包被的酶标板中，于湿盒中37℃孵育16 h，去除酶标板中的液体，用含0.5%(v/v)Tween-20浓度为0.01 mol/L的PBS(pH 7.2)反复清洗酶标板，然后酶标板中加入1%(w/v)的牛血清白蛋白(200 μl/孔)，于37℃孵育1 h，再用PBS反复洗涤。酶标板中加入100 μl鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体(1∶2000)，在37℃孵育2.5 h，用PBS反复清洗后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶500)100 μl，在37℃孵育1.5 h，PBS反复清洗后加入显色剂OPD，反应10 min后加入2 mol/L的H2SO4终止反应，酶联免疫检测仪于490 nm处测其A值。A值大小与酶活性呈反相关。
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1.2.3 Ang Ⅱ对人KFB增生的影响 参照文献[8]的方法检测KFB的增生。取处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100 μl，密度为1×108个/L，于37℃，5%CO2孵箱中培养24h，弃上清，加入无血清的DMEM-F12培养基，每孔100 μl，培养24 h，弃上清。将细胞分为4组：细胞培养板中Ang Ⅱ的终浓度分别为10-8 mol/L、10-7mol/L、10-6 mol/L、0 mol/L(对照)。每浓度设三复孔。于37℃，5%的CO2孵箱中培养，分别于培养结束前6h加入MTT 10 μl/孔(5g/L)。于第24、48、72 h结束培养，每孔弃去上清，然后每孔加入二甲亚砜100 μl，于37℃空气浴振荡至甲NB56B结晶完全溶解。分别测定其A570 nm、A630 nm值。A570 nm～A630 nm即反映细胞的增生程度。
1.2.4 Ang Ⅱ对人KFB调亡的影响 参照文献[8]的方法检测KFB的凋亡。细胞以108/L接种于6孔细胞培养板中，在5%CO2，37℃孵育24 h后，更换成无血清DMEM-F12培养液，继续培养24h，然后将细胞分为2组：细胞培养板中Ang Ⅱ的终浓度为10-6 mol/L及0 mol/L(对照)。37℃，5%的CO2中分别孵育24、48 h后，用0.25%的胰蛋白酶于37℃消化细胞5 min，加入生理盐水洗涤，1 000 r/min离心5 min，如此反复三次。取1×106个细胞，用70%的酒精固定12 h，调细胞浓度为1×108个/L，用碘化丙啶染色30 min，尼龙网过滤，流式细胞仪检测细胞凋亡的百分率。每例样品测定约5×103个细胞。
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1.2.5 Ang Ⅱ对人KFB Ⅰ型胶原表达的影响 参照文献[8]的方法检测KFB Ⅰ型胶原的表达。将3～5代的细胞以108/L接种于内置经多聚赖氨酸处理的盖玻片的六孔板中，在5%CO2，37℃孵育24h后，更换成无血清DMEM-F12培养液，继续培养24 h，分为2组：细胞培养板中Ang Ⅱ的终浓度为10-6 mol/L及0 mol/L(对照)。48h后小心取出盖玻片，干燥后用甲醇固定30 min，用双蒸水冲洗后，加入1∶10的双氧水在室温下反应20 min，用PBS反复冲洗三次后用10%的牛血清白蛋白封闭10 min，再以PBS反复冲洗三次。分别加入1∶100稀释的Ⅰ型胶原单克隆抗体100 μl，4℃湿盒中孵育24 h后用PBS反复冲洗三次后，分别加入1∶100稀释的生物素标记的IgG 100 μl，37℃湿盒中孵育1 h，用PBS反复冲洗；加入ABC复合物100 μl，37℃湿盒中孵育1 h；用PBS反复冲洗后加入显色剂DAB，反应10 min后以自来水终止反应。将切片做图像分析。
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1.3 统计学方法 Ang Ⅱ对人KFB分泌的Ⅰ型胶原酶活性、人KFB增生的影响用t检验；药物对人KFB凋亡的影响用χ2检验；药物对人KFB胶原表达的影响用医用图像分析仪相应的统计软件进行统计分析。
2 结 果
2.1 Ang Ⅱ对KFB分泌的Ⅰ型胶原酶活性的影响 Ang Ⅱ(10-8～10-6 mol/L)作用于人胚胎KFB能显著增强Ⅰ型胶原酶活性；在24 h时随浓度增加此作用减弱，在48 h时随浓度增加此作用无明显变化，在72 h时随浓度增加此作用增强(表1)。
2.2 Ang Ⅱ对人KFB增生的影响 10-6mol/L的Ang Ⅱ作用48～72 h能明显促进细胞增生；10-8-10-7mol/L的Ang Ⅱ作用24～72 h无明显促进细胞增生作用(表2)。
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Table 1. The impact of angiotensin Ⅱ on the activity of KFB secreted collagenase Groups
24hours
48hours
72hours
Angiotensin Ⅱ at 10-6(mol/L)
0.2000±0.0000△
0.2000±0.0000△
0.1767±0.0058*
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Angiotensin Ⅱ at 10-7(mol/L)
0.1950±0.0050
0.2050±0.0150△
0.1800±0.0265△
Angiotensin Ⅱ at 10-8(mol/L)
0.1850±0.0050＃
0.1800±0.0200△
0.2350±0.0050
Control(mol/L)
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0.2650±0.0150
0.2300±0.0000
0.2300±0.0100
△P<0.05；*P<0.01；＃P<0.001 vs control groupTable 2. The impact of angiotensin Ⅱ on the activity of KFB Groups
24hours
48hours
72hours
Angiotensin Ⅱ at 10-6(mol/L)
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0.3000±0.0100
0.8500±0.0500△
1.0000±0.0500△
Angiotensin Ⅱ at 10-7(mol/L)
0.2500±0.0265
0.7667±0.0289
0.9000±0.0500
Angiotensin Ⅱ at 10-8(mol/L)
0.2733±0.0153
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0.7333±0.0289
0.8833±0.2082
Control(mol/L)
0.2733±0.0115
0.7333±0.0289
0.8667±0.0289
△P<0.022.3 Ang Ⅱ对人KFB凋亡的影响 Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用48h能明显抑制细胞凋亡，而作用24h不能明显抑制细胞凋亡(表3)。
Table 3. The impact of angiotensin Ⅱ on the percentage of apoptotic KFB Groups
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24hours
48hours
Aniotensin Ⅱ at 10-6(mol/L)
2.2
3.5△
Control(mol/L)
2.8
5.0
△P<0.052.4 Ang Ⅱ对人KFB表达Ⅰ型胶原的影响 Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用48 h能明显促进人胎KFB表达Ⅰ型胶原(表4)。
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Table 4. The impact of angiotensin Ⅱ on the expression of collagenase in KFB Groups
n
Brightness×unit area(μm2)
Angiotensin Ⅱ at 10-6(mol/L)
10
5 392.70±162.21△
Control(mol/L)
10
3 995.69±39.49
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△P<0.053 讨 论
MsC与KFB是与肾脏纤维化密切相关的两种细胞。已有研究表明，Ang Ⅱ可促进系膜细胞增生及ECM堆积[3～6]，然而，目前国内外却未见Ang Ⅱ对人胚胎KFB影响的研究报道，本实验首次研究了Ang Ⅱ对人胚胎KFB分泌的Ⅰ型胶原酶活性、KFB增生、凋亡及Ⅰ型胶原表达的影响。
Ⅰ型胶原是肾间质纤维化时的主要胶原[9]，因而特异裂解Ⅰ型胶原的Ⅰ型胶原酶活性的改变，在逆转纤维化中起至关重要的作用。我们采用无血清培养方法研究发现，Ang Ⅱ(10-8～10-6mol/L)作用24h后能显著增强人胚胎KFB胶原酶活性，且在72h后随浓度增加此作用也增强。Ⅰ型胶原酶属于基质金属蛋白酶家族，可被基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)特异性抑制[10]。有学者研究发现，Ang Ⅱ(10-7mol/L)作用2h后小鼠系膜细胞TIMP达高峰，以后逐渐下降[11]。
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KFB大量增生是肾间质纤维化的特征之一，也是大量分泌ECM的基础[2]。本研究发现，10-6mol/L的Ang Ⅱ作用48～72h能明显促进细胞增生，且随浓度增加此作用也增强。
细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡，是由基因控制的细胞自主的有序性的细胞死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等[12]。细胞凋亡在肾间质纤维化中起重要作用。本研究发现，Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用48h能明显抑制细胞凋亡。
由于Ⅰ型胶原是肾间质的主要胶原，因而Ⅰ型胶原表达在肾间质纤维化中的作用颇为重要。本研究发现，Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用48h能明显促进人胚胎KFB表达Ⅰ型胶原。
由此可知，Ang Ⅱ对人KFB存在两方面的作用：一方面通过抑制细胞凋亡，促进细胞增生及Ⅰ型胶原表达发挥致纤维化的作用；另一方面通过增强胶原酶活性发挥抑制纤维化的作用。进一步研究Ang Ⅱ对人KFB作用的分子基础将对预防或逆转肾间质纤维化起重要作用。
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参考文献
1，Jones CL， Buch S， Post M et al. Renal extracellular matrix accumulation in acute puromycin aminonucleoside nephrosis in rats. Am J Pathol，1992，41：1381
2，叶任高，黄锋先.应重视对肾小管、肾间质疾病的研究.中国实用内科杂志，1995，15：323
3，Wolf G， Ziyadeh FN. The role of angiotensin Ⅱ in diabetic nephropathy：emphasis on nonhemodynamic mechanisms. Am J Kidney Dis，1997，29：153
4，方 勤，屈燧林.糖尿病肾病发病机制的研究进展.中国实用内科杂志，1999，19：239
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5，Crupp C， Lottermoser J， Cohen DI et al. Transformation of rat inner medullary fibrosis to myofibroblasts in vitro. Kidney Int，1997，52：1279
6，Chua CC，Hamdy RC， Chua BH. Angiotensin Ⅱ induces Timp-l production in rat heart endothelial cells. Biochem Biophys Acta，1996，1311：175
7，Chakrabory A， Eghbali M. An immunoassay for qualitative estimation of collagenase activity in mammalian tissues. Clin Biochem，1991，24：455
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8，司徒镇强，吴军正主编.细胞培养.西安：世界图书出版西安公司，1996.186-305
9，Orphanides C， Fine LG， Norman JT. Hypoxia stimulates proximal tubular cell matrix production via a TGF-betal-independent mechanism. Kidney Int，1997，52：637
10，Cawston TE， Curry VA， Clark IM et al. Identification of a new metalloproteinase inhibitor that forms tight-binding complexes with collagenase. Biochem J，1990，269：183
11，Wolf G， Haberstroh U， Neilson EG. Angiotensin Ⅱ stimulates the proliferation and biosynthesis of type Ⅰ collagen in cultured murine mesangial cells. Am J Pathol，1992，140：95
12，成 军主编.程序性细胞死亡与疾病.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.1-11
收稿1999-10-08
修回1999-12-14, 百拇医药
单位：方勤(华西医科大学附属第一医院肾内科 成都，610041)；屈燧林(华西医科大学附属第一医院肾内科 成都，610041)；陈高翔(华西医科大学附属第一医院肾内科 成都，610041)
关键词：血管紧张素Ⅱ；肾成纤维细胞；胶原酶活性
肾脏病与透析肾移植杂志000108 摘 要 目的：观察血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对人肾成纤维细胞(KFB)的影响。 方法：采用ELISA法、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪、免疫组织化学法分别检测Ang Ⅱ对KFB分泌的胶原酶活性、KFB增生、凋亡、Ⅰ型胶原表达的影响。 结果：Ang Ⅱ能提高KFB分泌的总胶原酶活性、促进KFB增生、抑制KFB凋亡、促进KFB Ⅰ型胶原的表达。 结论：Ang Ⅱ能通过促进KFB增生、抑制KFB凋亡、促进KFB Ⅰ型胶原的表达来促进肾间质纤维化。
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EFFECTS OF ANGIOTENSIN Ⅱ ON HUMAN KIDNEY FIBROBLAST
FAN Qin QU Shilin CHENG Gaoxiang
(Division of Nephrology，Department of Medicine，the First University Hospital，West China University of Medical Science，Chendu 610041)
OBJECTIVE To study the effects of angiotensing Ⅱ on human kidney fibroblasts(KFB)in its secreted collagenases activity，proliferation，apoptosis and expression of type Ⅰ collagen. METHODOLOGY The activity of type Ⅰ collagenase，KFB apoptosis，proliferation and collagen Ⅰ expression were detected by ELISA，flow cytometer，MTT and immunohistochemical method respectively. RESULTS Angiotensin Ⅱ enhanced the activity of collagenase secredted by KFB，inhibited KFBs apoptosis，promoted the KFBs proliferation and enhanced the expression of type Ⅰ collagen in KFB. CONCLUSION Angiotensin Ⅱ can induce renal fibrosis by inhibiting apoptosis，promoting proliferation and expression of type Ⅰ collagen of KFB.
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Key words angiotensin Ⅱ fibroblasts apoptosis
肾间质纤维化是多种肾脏病发展至终末期肾功能衰竭的共同通路[1]，因而及早阻止甚至逆转肾间质纤维化对防治终末期肾功能衰竭具有重大意义。研究表明，人肾成纤维细胞(KFB)是肾间质的主要重构细胞，在肾间质纤维化中起重要作用[2]。肾间质纤维化的主要原因是KFB增生及细胞外基质(ECM)过度堆积。KFB增生与细胞增生活跃而凋亡减少有关；ECM堆积与ECM产生及分解失衡相关。近年的研究表明，血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)不仅通过改变肾小球血流动力学促进肾小球硬化，还可通过发挥肾脏生长因子的作用促进系膜细胞(MsC)、血管平滑肌细胞、肾小管细胞增生及ECM堆积，并且Ang Ⅱ的这些作用可能通过诱导细胞产生自分泌因子而介导[3～6]。然而，却缺乏Ang Ⅱ对人胚胎KFB影响的研究，因此，本实验首次研究了Ang Ⅱ对人胚胎KFB的影响，以探索Ang Ⅱ在肾间质纤维化中的作用。
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1 材料和方法
1.1 药品和试剂 MEM-F12(GIBCO公司)，鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体、人Ⅰ型胶原、胰蛋白酶抑制剂(SIGMA公司)，亲和素生物素复合物(ABC)试剂盒(VECTOR公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠Ⅱ抗(华美公司)，二甲亚砜(MERCK公司)，灭活新生小牛血清(四川洪雅力生生化厂)，胰蛋白酶(DIFCO公司)，青霉素、链霉素(华北制药厂)，OPD(西安化学试剂厂)，MTT(上海华顺生物试剂厂)，多聚赖氨酸(中山公司)。
1.2 方 法
1.2.1 KFB培养及鉴定 KFB的培养：用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液冲洗水囊引产的5月龄新鲜胎儿肾脏，小心剪去肾脏表面附着的结缔组织及肾皮质，再用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液反复冲洗髓质组织，剪成1×1mm3的碎块，加入0.1%(w/v)胶原酶Ⅳ 1ml消化组织，用200目细胞筛过滤消化液，收集滤液于离心管中，1 000 r/min离心5min，然后用PBS洗涤三次，用DMEM-F12洗涤一次。洗涤后加入含20%灭活的新生小牛血清的DMEM-F12培养基，悬浮细胞，用台盼蓝染色计数，成活率为96%。将细胞悬液接种于75cm2培养瓶中(密度为2×106/瓶)，于37℃、5%CO2孵箱中孵育。次日换液，待细胞生长为单层后，用0.25%的胰蛋白酶于室温消化3min后用含20%的小牛血清的DMEM-F12悬浮细胞行1∶2扩增传代。
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KFB的鉴定：培养的细胞经相差显微镜、透射电镜及免疫学(细胞胞浆肌动蛋白、波形蛋白及Ⅰ型胶原染色阳性)鉴定证实为人胎KFB。
1.2.2 Ang Ⅱ对KFB表达Ⅰ型胶原酶活性的影响 参照文献[7]的方法检测胶原酶的活性，并加以改进。
(1)将3～5代的KFB接种于24孔培养板中，每孔的接种密度为5×107/L。在5%CO2，37℃孵育24 h后，更换成无血清DMEM-F12培养液，继续培养24 h，然后将细胞分为4组：细胞培养板中Ang Ⅱ的终浓度分别为10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、0 mol/L(对照)。每浓度时间点设3复孔。在第24、48及72 h检测培养板各孔胶原酶的活性。
(2)胶原酶活性的检测方法
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包被胶原：将人Ⅰ型胶原溶解于0.4 mol/L的醋酸中，配制成1 g/L的胶原溶液(pH 6.9)，临用前将此溶液用PBS稀释至10 mg/L。酶标板中每孔均加入100 μl的胶原稀释液，于湿盒中4℃包被24 h，次日弃去酶标板中的液体，并用含0.5%(v/v)Tween-20浓度为0.01 mol/L的PBS(pH 7.2)反复清洗酶标板三次。
封闭酶标板：酶标板中加入1%(w/v)的牛血清白蛋白(200 μl/孔)，于37℃孵育1 h，再用PBS反复清洗酶标板。
检测样品：收集细胞培养板中的上清，加入用胶原包被的酶标板中，于湿盒中37℃孵育16 h，去除酶标板中的液体，用含0.5%(v/v)Tween-20浓度为0.01 mol/L的PBS(pH 7.2)反复清洗酶标板，然后酶标板中加入1%(w/v)的牛血清白蛋白(200 μl/孔)，于37℃孵育1 h，再用PBS反复洗涤。酶标板中加入100 μl鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体(1∶2000)，在37℃孵育2.5 h，用PBS反复清洗后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶500)100 μl，在37℃孵育1.5 h，PBS反复清洗后加入显色剂OPD，反应10 min后加入2 mol/L的H2SO4终止反应，酶联免疫检测仪于490 nm处测其A值。A值大小与酶活性呈反相关。
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1.2.3 Ang Ⅱ对人KFB增生的影响 参照文献[8]的方法检测KFB的增生。取处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100 μl，密度为1×108个/L，于37℃，5%CO2孵箱中培养24h，弃上清，加入无血清的DMEM-F12培养基，每孔100 μl，培养24 h，弃上清。将细胞分为4组：细胞培养板中Ang Ⅱ的终浓度分别为10-8 mol/L、10-7mol/L、10-6 mol/L、0 mol/L(对照)。每浓度设三复孔。于37℃，5%的CO2孵箱中培养，分别于培养结束前6h加入MTT 10 μl/孔(5g/L)。于第24、48、72 h结束培养，每孔弃去上清，然后每孔加入二甲亚砜100 μl，于37℃空气浴振荡至甲NB56B结晶完全溶解。分别测定其A570 nm、A630 nm值。A570 nm～A630 nm即反映细胞的增生程度。
1.2.4 Ang Ⅱ对人KFB调亡的影响 参照文献[8]的方法检测KFB的凋亡。细胞以108/L接种于6孔细胞培养板中，在5%CO2，37℃孵育24 h后，更换成无血清DMEM-F12培养液，继续培养24h，然后将细胞分为2组：细胞培养板中Ang Ⅱ的终浓度为10-6 mol/L及0 mol/L(对照)。37℃，5%的CO2中分别孵育24、48 h后，用0.25%的胰蛋白酶于37℃消化细胞5 min，加入生理盐水洗涤，1 000 r/min离心5 min，如此反复三次。取1×106个细胞，用70%的酒精固定12 h，调细胞浓度为1×108个/L，用碘化丙啶染色30 min，尼龙网过滤，流式细胞仪检测细胞凋亡的百分率。每例样品测定约5×103个细胞。
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1.2.5 Ang Ⅱ对人KFB Ⅰ型胶原表达的影响 参照文献[8]的方法检测KFB Ⅰ型胶原的表达。将3～5代的细胞以108/L接种于内置经多聚赖氨酸处理的盖玻片的六孔板中，在5%CO2，37℃孵育24h后，更换成无血清DMEM-F12培养液，继续培养24 h，分为2组：细胞培养板中Ang Ⅱ的终浓度为10-6 mol/L及0 mol/L(对照)。48h后小心取出盖玻片，干燥后用甲醇固定30 min，用双蒸水冲洗后，加入1∶10的双氧水在室温下反应20 min，用PBS反复冲洗三次后用10%的牛血清白蛋白封闭10 min，再以PBS反复冲洗三次。分别加入1∶100稀释的Ⅰ型胶原单克隆抗体100 μl，4℃湿盒中孵育24 h后用PBS反复冲洗三次后，分别加入1∶100稀释的生物素标记的IgG 100 μl，37℃湿盒中孵育1 h，用PBS反复冲洗；加入ABC复合物100 μl，37℃湿盒中孵育1 h；用PBS反复冲洗后加入显色剂DAB，反应10 min后以自来水终止反应。将切片做图像分析。
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1.3 统计学方法 Ang Ⅱ对人KFB分泌的Ⅰ型胶原酶活性、人KFB增生的影响用t检验；药物对人KFB凋亡的影响用χ2检验；药物对人KFB胶原表达的影响用医用图像分析仪相应的统计软件进行统计分析。
2 结 果
2.1 Ang Ⅱ对KFB分泌的Ⅰ型胶原酶活性的影响 Ang Ⅱ(10-8～10-6 mol/L)作用于人胚胎KFB能显著增强Ⅰ型胶原酶活性；在24 h时随浓度增加此作用减弱，在48 h时随浓度增加此作用无明显变化，在72 h时随浓度增加此作用增强(表1)。
2.2 Ang Ⅱ对人KFB增生的影响 10-6mol/L的Ang Ⅱ作用48～72 h能明显促进细胞增生；10-8-10-7mol/L的Ang Ⅱ作用24～72 h无明显促进细胞增生作用(表2)。
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Table 1. The impact of angiotensin Ⅱ on the activity of KFB secreted collagenase Groups
24hours
48hours
72hours
Angiotensin Ⅱ at 10-6(mol/L)
0.2000±0.0000△
0.2000±0.0000△
0.1767±0.0058*
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Angiotensin Ⅱ at 10-7(mol/L)
0.1950±0.0050
0.2050±0.0150△
0.1800±0.0265△
Angiotensin Ⅱ at 10-8(mol/L)
0.1850±0.0050＃
0.1800±0.0200△
0.2350±0.0050
Control(mol/L)
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0.2650±0.0150
0.2300±0.0000
0.2300±0.0100
△P<0.05；*P<0.01；＃P<0.001 vs control groupTable 2. The impact of angiotensin Ⅱ on the activity of KFB Groups
24hours
48hours
72hours
Angiotensin Ⅱ at 10-6(mol/L)
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0.3000±0.0100
0.8500±0.0500△
1.0000±0.0500△
Angiotensin Ⅱ at 10-7(mol/L)
0.2500±0.0265
0.7667±0.0289
0.9000±0.0500
Angiotensin Ⅱ at 10-8(mol/L)
0.2733±0.0153
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0.7333±0.0289
0.8833±0.2082
Control(mol/L)
0.2733±0.0115
0.7333±0.0289
0.8667±0.0289
△P<0.022.3 Ang Ⅱ对人KFB凋亡的影响 Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用48h能明显抑制细胞凋亡，而作用24h不能明显抑制细胞凋亡(表3)。
Table 3. The impact of angiotensin Ⅱ on the percentage of apoptotic KFB Groups
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24hours
48hours
Aniotensin Ⅱ at 10-6(mol/L)
2.2
3.5△
Control(mol/L)
2.8
5.0
△P<0.052.4 Ang Ⅱ对人KFB表达Ⅰ型胶原的影响 Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用48 h能明显促进人胎KFB表达Ⅰ型胶原(表4)。
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Table 4. The impact of angiotensin Ⅱ on the expression of collagenase in KFB Groups
n
Brightness×unit area(μm2)
Angiotensin Ⅱ at 10-6(mol/L)
10
5 392.70±162.21△
Control(mol/L)
10
3 995.69±39.49
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△P<0.053 讨 论
MsC与KFB是与肾脏纤维化密切相关的两种细胞。已有研究表明，Ang Ⅱ可促进系膜细胞增生及ECM堆积[3～6]，然而，目前国内外却未见Ang Ⅱ对人胚胎KFB影响的研究报道，本实验首次研究了Ang Ⅱ对人胚胎KFB分泌的Ⅰ型胶原酶活性、KFB增生、凋亡及Ⅰ型胶原表达的影响。
Ⅰ型胶原是肾间质纤维化时的主要胶原[9]，因而特异裂解Ⅰ型胶原的Ⅰ型胶原酶活性的改变，在逆转纤维化中起至关重要的作用。我们采用无血清培养方法研究发现，Ang Ⅱ(10-8～10-6mol/L)作用24h后能显著增强人胚胎KFB胶原酶活性，且在72h后随浓度增加此作用也增强。Ⅰ型胶原酶属于基质金属蛋白酶家族，可被基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)特异性抑制[10]。有学者研究发现，Ang Ⅱ(10-7mol/L)作用2h后小鼠系膜细胞TIMP达高峰，以后逐渐下降[11]。
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KFB大量增生是肾间质纤维化的特征之一，也是大量分泌ECM的基础[2]。本研究发现，10-6mol/L的Ang Ⅱ作用48～72h能明显促进细胞增生，且随浓度增加此作用也增强。
细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡，是由基因控制的细胞自主的有序性的细胞死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等[12]。细胞凋亡在肾间质纤维化中起重要作用。本研究发现，Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用48h能明显抑制细胞凋亡。
由于Ⅰ型胶原是肾间质的主要胶原，因而Ⅰ型胶原表达在肾间质纤维化中的作用颇为重要。本研究发现，Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用48h能明显促进人胚胎KFB表达Ⅰ型胶原。
由此可知，Ang Ⅱ对人KFB存在两方面的作用：一方面通过抑制细胞凋亡，促进细胞增生及Ⅰ型胶原表达发挥致纤维化的作用；另一方面通过增强胶原酶活性发挥抑制纤维化的作用。进一步研究Ang Ⅱ对人KFB作用的分子基础将对预防或逆转肾间质纤维化起重要作用。
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收稿1999-10-08
修回1999-12-14, 百拇医药