霉酚酸酯治疗难治性狼疮性肾炎肾组织病理的变化
作者：王金泉 刘志红 胡伟新 陈惠萍 周虹 唐政 黎磊石
单位：刘志红(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；胡伟新(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；陈惠萍(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；周虹(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；唐政(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)
关键词：狼疮性肾炎；霉酚酸酯；病理形态学
肾脏病与透析肾移植杂志000105 摘 要 目的：进一步阐明霉酚酸酯(MMF)对难治性Ⅳ型狼疮性肾炎(LN)患者肾组织学改变的影响，探讨MMF作用机制。 方法：对15例接受MMF治疗(0.75～1.5 g/d)的难治性Ⅳ-LN患者进行重复肾活检，穿刺组织分别作常规光镜、免疫荧光检查。肾小球系膜区基质增生及肾小管间质半定量分析借助MAPIS-500多媒体病理彩色分析系统。肾组织CD4+与CD8+细胞染色、细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)表达采用PAP四层法。观察治疗前后上述各项指标的改变。 结果：① MMF治疗后肾组织活动性指数明显减少(P<0.01)，平均肾小球细胞计数(P<0.01)、肾小球毛细血管袢坏死发生率(P<0.05)、肾小球毛细血管内血栓形成发生率(P<0.01)和细胞性新月体发生率(P<0.01)均较治疗前明显减少。但肾小球系膜区基质增生较治疗前增加(P<0.05)，肾小球硬化、慢性化指数与治疗前相比较无统计学差异。② MMF治疗后肾小球内浸润的CD68+、增殖细胞核抗原阳性(PCNA+)细胞较治疗前明显减少(分别为P<0.01，P<0.05)。肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞和PCNA+细胞治疗前后均无明显变化。③ MMF治疗后肾小球ICAM-1和VCAM-1表达均较治疗前明显减少(均为P<0.01)，肾间质除平均ICAM-1阳性肾小管百分率较治疗前明显减少外(P<0.01)，ICAM-1+细胞、VCAM-1+细胞、平均VCAM-1阳性肾小管百分率与治疗前相比较均无明显变化。 结论：MMF治疗后肾小球活动性病变明显减轻，肾小球内CD68+细胞与PCNA+细胞明显减少，ICAM-1与VCAM-1表达显著下降。MMF抑制肾小球粘附分子表达可能是肾小球炎细胞浸润减少及病变改善的机制之一。EFFECTS OF MYCOPHENOLATE MOFETIL (MMF) ON RENAL HISTOPATHOLOGY OF REFRACTORY LUPUS NEPHRITIS
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WANG Jinquan LIU Zhihong HU Weixin CHEN Huiping ZHOU Hong TANG Zheng LI Leishi
(Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital.Nanjing University School of Medicine.Nanging，210002)
OBJECTIVE To evaluate the effect of mycophenolate morfetil (MMF) on renal histopathology of refractory severe lupus nephritis and its mechanism. METHODOLOGY Fifteen patients of refractory lupus nephritis were included in this study.All the patients received renal biopsy before and after MMF treatment (0.75-1.5g/day)for 3 months.All samples were routinely processed for optical and immunofluorescence microscopy.In the assessment of glomerular mesangial expansion and tublo-interstial lesion，MAPIS-500 multi-media color image analytical system was applied.Renal CD4+ and CD8+ cell，proliferative cell nuclear antigen(PCNA)+ cell，intercellular adhesion molecule 1，vascular cell adhesion molecule 1 were analyzed by immunohistochemistry of 4-layer PAP method. RESULTS ①The activity index reduced significantly from 16.4±7.82 to 4.05±2.04(P<0.01)，number of cell per glomerulus from 173±42.8 to 135±19.0(P<0.01)，patients with glomerular capillary necrosis from 11/15 to 0/15(P<0.05)，patients with glomerular capillary thrombosis from 7/15 to 0/15(P<0.05)，the patients with cellular crescents from 11/15 to 0/15(P<0.05)，while ratio of mesangial/glomerular area significantly increased from 29.3±4.62 to 35.8±8.78(P<0.05)after treatment.No statistical difference was found in chronic index(1.72±1.03 vs 2.81±2.82)and ratio of interstitial area/interstial and tubular area(28.3±7.78 vs 26.6±8.34)(both P>0.05).②The CD68+ cell per glomerulus(12.6±7.22 vs 1.64±2.32，P<0.01)，the PCNA+ cell per glomerulus (0.965±0.883 vs 0.357±0.275，P<0.05)decreased significantly after treatment.On the other hand，the CD4+ cell/mm2，CD8+ cell/mm2，CD68+ cell/mm2，PCNA+ cell/mm2 of interstitium was not found to change significantly.③The glomerular expression of ICAM-1(P<0.01)and VCAM-1(P<0.01)decreased significantly after treatment.The mean percentage of ICAM-1+ tubule decreased significantly (19.3±14.8 vs 9.14±9.66，P<0.01)，while ICAM+ cell/mm2，VCAM-1+ cell/mm2 of interstitium and the mean percentage of ICAM-1+ tubule had no obvious variant after treatment. CONCLUSION MMF(0.75-1.5g/day)is effective for active glomerular lesion of refractory severe lupus nephritis，by a mechanism in which inhibition of glomerular adhesion molecule expression might be involved.
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Key words lupus nephritis mycophenolate morfetil histopathology
新型免疫抑制剂霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)仅抑制嘌呤合成的从头途径，选择性地抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞增生，与此同时还有研究表明，MMF可以抑制人与大鼠系膜细胞增生，抑制粘附分子表达[1～4]。初步临床研究证明，MMF对难治性Ⅳ型狼疮性肾炎(Lupus nephritis，LN)患者具有满意的疗效，患者肾功能改善，蛋白尿、血尿明显减少，体液免疫亢进得到抑制，肾脏活动性病变减轻[5]。但是MMF对LN肾组织局部粘附分子有何影响及其在MMF治疗机制中的作用尚未见系统研究的报道。在上述研究的基础上，本研究对15例接受MMF治疗并进行重复肾活检的难治性Ⅳ-LN患者肾组织病理改变、肾组织浸润细胞亚群及粘附分子表达进行了分析，以期进一步阐明MMF对难治性Ⅳ-LN患者肾组织学改变的影响，探讨其可能的作用机制。
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1 对象和方法
1.1 观察对象 收集1997年10月至1999年5月间在解放军肾脏病研究所住院经临床、病理、免疫病理确诊的15例难治性Ⅳ-LN患者。所有患者均对传统免疫抑制剂无明显效果和(或)出现严重并发症。其中男3例、女12例。首次住院时平均年龄30.1±8.75(15～47)岁，平均病程36.4±30.2(5～84)个月。采用小剂量激素(强的松10～30 mg/d)联合MMF治疗，治疗期间不再合并使用其它免疫抑制剂。MMF初始剂量为0.75～1.5 g/d，其中0.75 g/d 2例、1.0 g/d 8例、1.5 g/d 5例。于治疗3个月后行重复肾活检。
1.2 观察项目
1.2.1 肾组织病理 穿刺组织分别作常规光镜、免疫荧光检查。常规光镜包括HE、PAS、PAM染色，观察肾小球细胞数、肾小球硬化、新月体的性质和数目、肾小球毛细血管袢坏死、肾小球毛细血管袢内血栓形成等。肾组织活动性指数(AI)及慢性病变指数(CI)计数参考文献[6]。
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1.2.2 肾组织免疫病理 肾组织CD4+与CD8+细胞染色、细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)表达取冰冻切片，采用PAP四层法。肾组织CD68+、增殖性细胞核抗原(PCNA+)阳性细胞染色取石蜡切片，采用PAP四层法。肾小球ICAM-1和VCAM-1分布依据染色强度分为+、2+和3+。肾组织粘附分子分布由同一技师在单盲情况下进行观察记录。
1.2.3 肾组织病理改变半定量分析 肾小球系膜基质增生及肾小管间质半定量分析借助MAPIS-500多媒体病理彩色分析系统(武汉同济医科大学研制)，肾小球系膜基质增生半定量分析取PAS染色切片，每张切片观察5～10个正切肾小球，计数肾小球系膜区面积占整个肾小球面积的百分比。肾小管间质半定量分析取PAM染色切片，每张切片观察5个不含肾小球的皮质视野，计数肾间质面积占整个视野的百分比。
1.3 统计学方法 肾小球毛细血管袢坏死、肾小球毛细血管内血栓形成、肾小球新月体采用四格表确切概率法，肾小球ICAM-1和VCAM-1表达采用配对秩和检验，其余采用配对计数资料t检验。
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2 结 果
2.1 MMF治疗前后肾组织病理改变 MMF治疗后肾组织活动性指数明显减少(P<0.01)，平均肾小球细胞计数(P<0.01)、肾小球毛细血管袢坏死发生率(P<0.05)、肾小球毛细血管内血栓形成发生率(P<0.05)和细胞性新月体发生率(P<0.05)均较治疗前明显减少。与此同时，肾小球系膜区基质增生较治疗前增加(P<0.05)，肾小球硬化、慢性化指数和肾小管间质占皮质整个视野的百分比与治疗前后相比较无统计学差异。在慢性化指数增加的同时，少数患者肾小球硬化增加和(或)出现少数纤维性新月体(表1)。
2.2 MMF对肾组织细胞浸润的影响 MMF治疗后肾小球内浸润的CD68+细胞、PCNA+细胞均较治疗前明显减少(均为P<0.01)。但肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞和PCNA+细胞治疗前后均无明显变化，其中肾间质CD4+细胞反而较前有增加趋势(表2)。
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Table 1. The effect of MMF on renal histopathology
Pre-treatment
Post-treatment
Activity index
16.4±7.82
4.05±2.04**
Cellularity
173±42.8
135±19.0**
Glomerular capillary necrosis(%)
, 百拇医药
11/15(73.3)
0/15(00.0)*
Glomerular capillary thrombosis(%)
7/15(46.7)
0/15(00.0)*
Cellular crescents(%)
11/15(73.3)
5/15(33.3)*
The percentage of mesangial/
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glomerulaer area(%)
30.0±4.62
35.8±8.78*
Chronicity index
1.72±1.03
2.81±2.82
Glomerulosclerosis(%)
11.4±11.8
16.3±19.0
Fibrotic crescents(%)
, 百拇医药 2/14(14.3)
5/14(35.7)
Interstial area/
Interstial and tubular area
28.3±7.78
26.6±8.34
*P<0.05，**P<0.01Table 2. The effect of MMF on renal inflammatory cells
Pre-treatment
Post-treatment
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Glomeruli△
The CD68+ cell per glomerular
12.6±7.22
1.64±2.32**
The PCNA+cell per glomerular
0.965±0.883
0.357±0.275*
Interstitium
The CD4+cell/mm2，(n＝8)
, 百拇医药
106±60.8
152±97.6
The CD8+cell/mm2，(n＝8)
153±53.3
162±72.5
The CD68+cell/mm2
564±371
480.±378
The PCNA+cell/mm2
14.8±16.1
, 百拇医药
6.38±7.78
△：One patient had no glomerulus in frozen sections after MMF treatment.*P<0.05，**P<0.012.3 MMF对肾组织粘附分子的影响 MMF治疗后肾小球内ICAM-1和VCAM-1表达均较治疗前明显减少(均为P<0.01)。肾间质除平均ICAM-1阳性肾小管百分率较治疗前明显减少外(P<0.01)，ICAM-1+细胞、VCAM-1+细胞、平均VCAM-1阳性肾小管百分率与治疗前相比较无明显变化(表3)。
Table 3. The effect of MMF on glomerular adhesion
molecule expression
, 百拇医药
Pre-treatment
Post-treatment
Glomeruli
ICAM-1 expression(%)△
(+)
1/15(6.67)
6/14(42.9)**
(++)
9/15(60.0)
8/14(57.1)
(+++)
, 百拇医药
5/15(33.3)
VCAM-1 expression(%)△
(-)
1/15(6.67)
10/14(71.4)**
(+)
1/15(6.67)
1/14(7.14)
(++)
7/15(46.7)
3/14(21.4)
, 百拇医药
(+++)
6/15(40.0)
Interstitium
ICAM-1+cell/mm2
235±120
230±110
VCAM-1+cell/mm2
70.6±31.4
58.6±41.7
Percentage of ICAM-1+tubule
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19.3±14.8
9.14±9.66**
Percentage of VCAM-1+tubule
49.0±13.2
32.3±18.4
△：One patient had no glomerulus in frozen sections after MMF treatment.*P<0.05，**P<0.01
3 讨 论
3.1 MMF对难治性Ⅳ-LN患者肾组织病理的影响 本组资料表明，MMF治疗后肾组织病理改变明显减轻，尤其是细胞性新月体、肾小球毛细血管袢坏死和毛细血管内血栓形成发生率较治疗前明显减少。但是MMF治疗后，在肾小球活动性病变明显改善的同时，部分患者遗留有肾小球系膜区细胞外基质增加，肾组织慢性化病变在治疗前后无明显改变。进一步从肾组织病理改变方面再次证实MMF对难治性Ⅳ-LN，尤其是肾小球活动性病变有独特的疗效。
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众所周知，在积极有效的治疗后LN肾组织活动性病变有二种结局： 一是病变彻底消失；二是遗留慢性病变如纤维性新月体、肾小球全球硬化等，系膜增生本身也是肾脏病变修复过程的一种表现。体外实验表明，MMF能够抑制有丝分裂原刺激导致的大鼠和人肾小球系膜细胞增生[4]。虽然我们没有对肾小球系膜细胞进行精确计数，但在观察中我们注意到肾小球系膜细胞数在MMF治疗后明显减少。在观察中，我们发现有2例患者在MMF治疗后，肾组织慢性化指数也同样下降，分析这2例患者，其中1例MMF起始剂量为1.5 g/d，MMF治疗前肾组织活动性指数仅为5；另1例MMF起始剂量为1.0 g/d，在MMF应用的同时就已经合并使用中药大黄。国外研究表明，MMF对肾小球系膜细胞增生作用呈剂量依赖效应，其抑制有丝分裂原刺激的人肾小球系膜细胞增生的IC50为0.19±0.06μm[4]。既往的研究亦证实，中药大黄在体内外均可抑制肾固有细胞及系膜基质的增生，减轻系膜受损后的肾小球硬化还可以对抗炎症因子如IL-2和TGFβ等[7，8]。因此系膜增生、慢性化指数增加是活动性病变治疗的转归和(或)修复过程中的表现，还是MMF作用的局限性、治疗难治性Ⅳ-LN MMF合适的剂量、中药大黄联合MMF治疗难治性Ⅳ-LN的效果等问题有待进一步探讨。
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3.2 MMF对难治性Ⅳ-LN患者肾组织细胞浸润的影响 Ⅳ-LN肾组织病理改变的一个显著特点是肾小球与肾小管间质有大量的炎细胞——包括CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞浸润，并且相当多的浸润细胞处于增生状态，表现为PCNA阳性。经过甲基强的松龙(MP)和环磷酰胺(CTX)冲击治疗后，随着肾小球CD68+细胞、PCNA+细胞和肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞、PCNA+细胞的减少，病变明显改善，表明上述炎性细胞在LN发病过程中扮演重要的角色[9，10]。本组资料证实，MMF治疗后肾小球CD68+细胞浸润和PCNA+细胞显著下降，肾间质CD68+细胞浸润和PCNA+细胞也有所减少，但与治疗前相比无统计学差异。肾间质CD4+、CD8+细胞治疗前后无明显变化。MMF对肾小球、肾间质细胞浸润影响与MP和CTX冲击治疗对肾小球、肾间质细胞浸润影响不完全相同，提示这二种疗法在作用机制上存在着差异，这可能也是为什么在MP和CTX冲击治疗无效的LN患者，MMF治疗后临床表现与病理改变明显改善的原因之一。
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3.3 MMF对难治性Ⅳ-LN患者肾组织粘附分子的影响 ICAM-1、VCAM-1在白细胞与内皮细胞粘附、迁移及炎症部位浸润过程中起重要作用，不仅如此，二者可以提供协同刺激信号介导T细胞活化、增殖[11，12]。在正常肾组织中，肾小球毛细血管内皮细胞及肾小囊壁层上皮细胞表达ICAM-1，后者同时可以表达VCAM-1。在许多病理状态下，肾近曲小管上皮细胞可以表达ICAM-1和VCAM-1[13]。体外研究证实，多种细胞因子如——TNF、IFN可以上调肾近曲小管上皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达[14]。临床研究亦证实，系统性血管炎患者肾小球内ICAM-1与VCAM-1的表达与肾组织病变的严重程度有关[12，15]。大量的研究表明，MMF除了具有良好的抗排斥反应、抑制肾小球系膜细胞增生外，还可以抑制粘附分子表达[1，15，16]。MMF对肾组织浸润细胞的影响，是直接抑制肾脏局部炎细胞的增生和(或)通过抑制粘附分子的表达间接减少肾脏局部炎细胞的浸润?为此，我们观察了MMF治疗前后肾组织粘附分子表达的改变。结果表明，ICAM-1与VCAM-1弥漫分布于LN患者肾小球与肾小管；MMF治疗后肾小球ICAM-1与VCAM-1表达均较治疗前明显减少；平均ICAM-1阳性小管百分率较治疗前明显减少(P<0.01)，平均ICAM-1阳性小管百分率、肾间质VCAM-1+细胞较治疗前也有所减少，但无统计学差异。肾间质ICAM-1+细胞治疗前后无明显变化。首次在组织学证实，MMF能够抑制肾脏局部粘附分子表达。
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MMF与MP不同之处在于MMF可以阻抑细胞内糖蛋白装配合成过程，对己启动的VCAM-1基因表达有抑制作用[17，18]，我们以往的研究表明，MP冲击治疗后肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞明显减少，但对肾小球、肾小管上皮细胞和肾间质VCAM-1高表达没有明显的影响[18]。本研究表明，MMF可以抑制肾小球粘附分子——VCAM-1和ICAM-1的高表达，对肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞无明显影响。从肾组织免疫病理角度阐明MMF与MP作用机制存在差异。
在明确MMF治疗后难治性Ⅳ-LN患者临床症状明显改善，血清自身抗体转阴或滴度明显下降，肾组织内免疫复合物沉积明显减少的基础上[5，19]，本研究进一步表明，MMF治疗后① 肾小球活动性病变明显减轻，肾小球内CD68+与PCNA+细胞明显减少。② MMF可以抑制肾小球ICAM-1与VCAM-1表达，这是MMF治疗后肾小球炎细胞浸润减少，肾组织病变改善的机制之一；也是MMF与MP作用机制不同之处，部分揭示了为什么在MP和CTX冲击治疗无效的LN患者，MMF治疗后临床表现与病理改变可以明显改善。③ 对肾小球粘附分子表达抑制作用强于对肾小管间质粘附分子表达的抑制，对肾小球炎细胞浸润的影响也优于对肾间质炎细浸润的影响。如何取得MMF治疗难治性LN的最佳效果，仍有一系列问题有待于进一步研究。
, 百拇医药
黎磊石(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)
王金泉(第二军医大学博士研究生)
参考文献
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收稿1999-11-30
修回2000-01-06, 百拇医药
单位：刘志红(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；胡伟新(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；陈惠萍(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；周虹(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；唐政(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)
关键词：狼疮性肾炎；霉酚酸酯；病理形态学
肾脏病与透析肾移植杂志000105 摘 要 目的：进一步阐明霉酚酸酯(MMF)对难治性Ⅳ型狼疮性肾炎(LN)患者肾组织学改变的影响，探讨MMF作用机制。 方法：对15例接受MMF治疗(0.75～1.5 g/d)的难治性Ⅳ-LN患者进行重复肾活检，穿刺组织分别作常规光镜、免疫荧光检查。肾小球系膜区基质增生及肾小管间质半定量分析借助MAPIS-500多媒体病理彩色分析系统。肾组织CD4+与CD8+细胞染色、细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)表达采用PAP四层法。观察治疗前后上述各项指标的改变。 结果：① MMF治疗后肾组织活动性指数明显减少(P<0.01)，平均肾小球细胞计数(P<0.01)、肾小球毛细血管袢坏死发生率(P<0.05)、肾小球毛细血管内血栓形成发生率(P<0.01)和细胞性新月体发生率(P<0.01)均较治疗前明显减少。但肾小球系膜区基质增生较治疗前增加(P<0.05)，肾小球硬化、慢性化指数与治疗前相比较无统计学差异。② MMF治疗后肾小球内浸润的CD68+、增殖细胞核抗原阳性(PCNA+)细胞较治疗前明显减少(分别为P<0.01，P<0.05)。肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞和PCNA+细胞治疗前后均无明显变化。③ MMF治疗后肾小球ICAM-1和VCAM-1表达均较治疗前明显减少(均为P<0.01)，肾间质除平均ICAM-1阳性肾小管百分率较治疗前明显减少外(P<0.01)，ICAM-1+细胞、VCAM-1+细胞、平均VCAM-1阳性肾小管百分率与治疗前相比较均无明显变化。 结论：MMF治疗后肾小球活动性病变明显减轻，肾小球内CD68+细胞与PCNA+细胞明显减少，ICAM-1与VCAM-1表达显著下降。MMF抑制肾小球粘附分子表达可能是肾小球炎细胞浸润减少及病变改善的机制之一。EFFECTS OF MYCOPHENOLATE MOFETIL (MMF) ON RENAL HISTOPATHOLOGY OF REFRACTORY LUPUS NEPHRITIS
, http://www.100md.com
WANG Jinquan LIU Zhihong HU Weixin CHEN Huiping ZHOU Hong TANG Zheng LI Leishi
(Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital.Nanjing University School of Medicine.Nanging，210002)
OBJECTIVE To evaluate the effect of mycophenolate morfetil (MMF) on renal histopathology of refractory severe lupus nephritis and its mechanism. METHODOLOGY Fifteen patients of refractory lupus nephritis were included in this study.All the patients received renal biopsy before and after MMF treatment (0.75-1.5g/day)for 3 months.All samples were routinely processed for optical and immunofluorescence microscopy.In the assessment of glomerular mesangial expansion and tublo-interstial lesion，MAPIS-500 multi-media color image analytical system was applied.Renal CD4+ and CD8+ cell，proliferative cell nuclear antigen(PCNA)+ cell，intercellular adhesion molecule 1，vascular cell adhesion molecule 1 were analyzed by immunohistochemistry of 4-layer PAP method. RESULTS ①The activity index reduced significantly from 16.4±7.82 to 4.05±2.04(P<0.01)，number of cell per glomerulus from 173±42.8 to 135±19.0(P<0.01)，patients with glomerular capillary necrosis from 11/15 to 0/15(P<0.05)，patients with glomerular capillary thrombosis from 7/15 to 0/15(P<0.05)，the patients with cellular crescents from 11/15 to 0/15(P<0.05)，while ratio of mesangial/glomerular area significantly increased from 29.3±4.62 to 35.8±8.78(P<0.05)after treatment.No statistical difference was found in chronic index(1.72±1.03 vs 2.81±2.82)and ratio of interstitial area/interstial and tubular area(28.3±7.78 vs 26.6±8.34)(both P>0.05).②The CD68+ cell per glomerulus(12.6±7.22 vs 1.64±2.32，P<0.01)，the PCNA+ cell per glomerulus (0.965±0.883 vs 0.357±0.275，P<0.05)decreased significantly after treatment.On the other hand，the CD4+ cell/mm2，CD8+ cell/mm2，CD68+ cell/mm2，PCNA+ cell/mm2 of interstitium was not found to change significantly.③The glomerular expression of ICAM-1(P<0.01)and VCAM-1(P<0.01)decreased significantly after treatment.The mean percentage of ICAM-1+ tubule decreased significantly (19.3±14.8 vs 9.14±9.66，P<0.01)，while ICAM+ cell/mm2，VCAM-1+ cell/mm2 of interstitium and the mean percentage of ICAM-1+ tubule had no obvious variant after treatment. CONCLUSION MMF(0.75-1.5g/day)is effective for active glomerular lesion of refractory severe lupus nephritis，by a mechanism in which inhibition of glomerular adhesion molecule expression might be involved.
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Key words lupus nephritis mycophenolate morfetil histopathology
新型免疫抑制剂霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)仅抑制嘌呤合成的从头途径，选择性地抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞增生，与此同时还有研究表明，MMF可以抑制人与大鼠系膜细胞增生，抑制粘附分子表达[1～4]。初步临床研究证明，MMF对难治性Ⅳ型狼疮性肾炎(Lupus nephritis，LN)患者具有满意的疗效，患者肾功能改善，蛋白尿、血尿明显减少，体液免疫亢进得到抑制，肾脏活动性病变减轻[5]。但是MMF对LN肾组织局部粘附分子有何影响及其在MMF治疗机制中的作用尚未见系统研究的报道。在上述研究的基础上，本研究对15例接受MMF治疗并进行重复肾活检的难治性Ⅳ-LN患者肾组织病理改变、肾组织浸润细胞亚群及粘附分子表达进行了分析，以期进一步阐明MMF对难治性Ⅳ-LN患者肾组织学改变的影响，探讨其可能的作用机制。
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1 对象和方法
1.1 观察对象 收集1997年10月至1999年5月间在解放军肾脏病研究所住院经临床、病理、免疫病理确诊的15例难治性Ⅳ-LN患者。所有患者均对传统免疫抑制剂无明显效果和(或)出现严重并发症。其中男3例、女12例。首次住院时平均年龄30.1±8.75(15～47)岁，平均病程36.4±30.2(5～84)个月。采用小剂量激素(强的松10～30 mg/d)联合MMF治疗，治疗期间不再合并使用其它免疫抑制剂。MMF初始剂量为0.75～1.5 g/d，其中0.75 g/d 2例、1.0 g/d 8例、1.5 g/d 5例。于治疗3个月后行重复肾活检。
1.2 观察项目
1.2.1 肾组织病理 穿刺组织分别作常规光镜、免疫荧光检查。常规光镜包括HE、PAS、PAM染色，观察肾小球细胞数、肾小球硬化、新月体的性质和数目、肾小球毛细血管袢坏死、肾小球毛细血管袢内血栓形成等。肾组织活动性指数(AI)及慢性病变指数(CI)计数参考文献[6]。
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1.2.2 肾组织免疫病理 肾组织CD4+与CD8+细胞染色、细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)表达取冰冻切片，采用PAP四层法。肾组织CD68+、增殖性细胞核抗原(PCNA+)阳性细胞染色取石蜡切片，采用PAP四层法。肾小球ICAM-1和VCAM-1分布依据染色强度分为+、2+和3+。肾组织粘附分子分布由同一技师在单盲情况下进行观察记录。
1.2.3 肾组织病理改变半定量分析 肾小球系膜基质增生及肾小管间质半定量分析借助MAPIS-500多媒体病理彩色分析系统(武汉同济医科大学研制)，肾小球系膜基质增生半定量分析取PAS染色切片，每张切片观察5～10个正切肾小球，计数肾小球系膜区面积占整个肾小球面积的百分比。肾小管间质半定量分析取PAM染色切片，每张切片观察5个不含肾小球的皮质视野，计数肾间质面积占整个视野的百分比。
1.3 统计学方法 肾小球毛细血管袢坏死、肾小球毛细血管内血栓形成、肾小球新月体采用四格表确切概率法，肾小球ICAM-1和VCAM-1表达采用配对秩和检验，其余采用配对计数资料t检验。
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2 结 果
2.1 MMF治疗前后肾组织病理改变 MMF治疗后肾组织活动性指数明显减少(P<0.01)，平均肾小球细胞计数(P<0.01)、肾小球毛细血管袢坏死发生率(P<0.05)、肾小球毛细血管内血栓形成发生率(P<0.05)和细胞性新月体发生率(P<0.05)均较治疗前明显减少。与此同时，肾小球系膜区基质增生较治疗前增加(P<0.05)，肾小球硬化、慢性化指数和肾小管间质占皮质整个视野的百分比与治疗前后相比较无统计学差异。在慢性化指数增加的同时，少数患者肾小球硬化增加和(或)出现少数纤维性新月体(表1)。
2.2 MMF对肾组织细胞浸润的影响 MMF治疗后肾小球内浸润的CD68+细胞、PCNA+细胞均较治疗前明显减少(均为P<0.01)。但肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞和PCNA+细胞治疗前后均无明显变化，其中肾间质CD4+细胞反而较前有增加趋势(表2)。
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Table 1. The effect of MMF on renal histopathology
Pre-treatment
Post-treatment
Activity index
16.4±7.82
4.05±2.04**
Cellularity
173±42.8
135±19.0**
Glomerular capillary necrosis(%)
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11/15(73.3)
0/15(00.0)*
Glomerular capillary thrombosis(%)
7/15(46.7)
0/15(00.0)*
Cellular crescents(%)
11/15(73.3)
5/15(33.3)*
The percentage of mesangial/
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glomerulaer area(%)
30.0±4.62
35.8±8.78*
Chronicity index
1.72±1.03
2.81±2.82
Glomerulosclerosis(%)
11.4±11.8
16.3±19.0
Fibrotic crescents(%)
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5/14(35.7)
Interstial area/
Interstial and tubular area
28.3±7.78
26.6±8.34
*P<0.05，**P<0.01Table 2. The effect of MMF on renal inflammatory cells
Pre-treatment
Post-treatment
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Glomeruli△
The CD68+ cell per glomerular
12.6±7.22
1.64±2.32**
The PCNA+cell per glomerular
0.965±0.883
0.357±0.275*
Interstitium
The CD4+cell/mm2，(n＝8)
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106±60.8
152±97.6
The CD8+cell/mm2，(n＝8)
153±53.3
162±72.5
The CD68+cell/mm2
564±371
480.±378
The PCNA+cell/mm2
14.8±16.1
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6.38±7.78
△：One patient had no glomerulus in frozen sections after MMF treatment.*P<0.05，**P<0.012.3 MMF对肾组织粘附分子的影响 MMF治疗后肾小球内ICAM-1和VCAM-1表达均较治疗前明显减少(均为P<0.01)。肾间质除平均ICAM-1阳性肾小管百分率较治疗前明显减少外(P<0.01)，ICAM-1+细胞、VCAM-1+细胞、平均VCAM-1阳性肾小管百分率与治疗前相比较无明显变化(表3)。
Table 3. The effect of MMF on glomerular adhesion
molecule expression
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Pre-treatment
Post-treatment
Glomeruli
ICAM-1 expression(%)△
(+)
1/15(6.67)
6/14(42.9)**
(++)
9/15(60.0)
8/14(57.1)
(+++)
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5/15(33.3)
VCAM-1 expression(%)△
(-)
1/15(6.67)
10/14(71.4)**
(+)
1/15(6.67)
1/14(7.14)
(++)
7/15(46.7)
3/14(21.4)
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(+++)
6/15(40.0)
Interstitium
ICAM-1+cell/mm2
235±120
230±110
VCAM-1+cell/mm2
70.6±31.4
58.6±41.7
Percentage of ICAM-1+tubule
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19.3±14.8
9.14±9.66**
Percentage of VCAM-1+tubule
49.0±13.2
32.3±18.4
△：One patient had no glomerulus in frozen sections after MMF treatment.*P<0.05，**P<0.01
3 讨 论
3.1 MMF对难治性Ⅳ-LN患者肾组织病理的影响 本组资料表明，MMF治疗后肾组织病理改变明显减轻，尤其是细胞性新月体、肾小球毛细血管袢坏死和毛细血管内血栓形成发生率较治疗前明显减少。但是MMF治疗后，在肾小球活动性病变明显改善的同时，部分患者遗留有肾小球系膜区细胞外基质增加，肾组织慢性化病变在治疗前后无明显改变。进一步从肾组织病理改变方面再次证实MMF对难治性Ⅳ-LN，尤其是肾小球活动性病变有独特的疗效。
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众所周知，在积极有效的治疗后LN肾组织活动性病变有二种结局： 一是病变彻底消失；二是遗留慢性病变如纤维性新月体、肾小球全球硬化等，系膜增生本身也是肾脏病变修复过程的一种表现。体外实验表明，MMF能够抑制有丝分裂原刺激导致的大鼠和人肾小球系膜细胞增生[4]。虽然我们没有对肾小球系膜细胞进行精确计数，但在观察中我们注意到肾小球系膜细胞数在MMF治疗后明显减少。在观察中，我们发现有2例患者在MMF治疗后，肾组织慢性化指数也同样下降，分析这2例患者，其中1例MMF起始剂量为1.5 g/d，MMF治疗前肾组织活动性指数仅为5；另1例MMF起始剂量为1.0 g/d，在MMF应用的同时就已经合并使用中药大黄。国外研究表明，MMF对肾小球系膜细胞增生作用呈剂量依赖效应，其抑制有丝分裂原刺激的人肾小球系膜细胞增生的IC50为0.19±0.06μm[4]。既往的研究亦证实，中药大黄在体内外均可抑制肾固有细胞及系膜基质的增生，减轻系膜受损后的肾小球硬化还可以对抗炎症因子如IL-2和TGFβ等[7，8]。因此系膜增生、慢性化指数增加是活动性病变治疗的转归和(或)修复过程中的表现，还是MMF作用的局限性、治疗难治性Ⅳ-LN MMF合适的剂量、中药大黄联合MMF治疗难治性Ⅳ-LN的效果等问题有待进一步探讨。
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3.2 MMF对难治性Ⅳ-LN患者肾组织细胞浸润的影响 Ⅳ-LN肾组织病理改变的一个显著特点是肾小球与肾小管间质有大量的炎细胞——包括CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞浸润，并且相当多的浸润细胞处于增生状态，表现为PCNA阳性。经过甲基强的松龙(MP)和环磷酰胺(CTX)冲击治疗后，随着肾小球CD68+细胞、PCNA+细胞和肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞、PCNA+细胞的减少，病变明显改善，表明上述炎性细胞在LN发病过程中扮演重要的角色[9，10]。本组资料证实，MMF治疗后肾小球CD68+细胞浸润和PCNA+细胞显著下降，肾间质CD68+细胞浸润和PCNA+细胞也有所减少，但与治疗前相比无统计学差异。肾间质CD4+、CD8+细胞治疗前后无明显变化。MMF对肾小球、肾间质细胞浸润影响与MP和CTX冲击治疗对肾小球、肾间质细胞浸润影响不完全相同，提示这二种疗法在作用机制上存在着差异，这可能也是为什么在MP和CTX冲击治疗无效的LN患者，MMF治疗后临床表现与病理改变明显改善的原因之一。
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3.3 MMF对难治性Ⅳ-LN患者肾组织粘附分子的影响 ICAM-1、VCAM-1在白细胞与内皮细胞粘附、迁移及炎症部位浸润过程中起重要作用，不仅如此，二者可以提供协同刺激信号介导T细胞活化、增殖[11，12]。在正常肾组织中，肾小球毛细血管内皮细胞及肾小囊壁层上皮细胞表达ICAM-1，后者同时可以表达VCAM-1。在许多病理状态下，肾近曲小管上皮细胞可以表达ICAM-1和VCAM-1[13]。体外研究证实，多种细胞因子如——TNF、IFN可以上调肾近曲小管上皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达[14]。临床研究亦证实，系统性血管炎患者肾小球内ICAM-1与VCAM-1的表达与肾组织病变的严重程度有关[12，15]。大量的研究表明，MMF除了具有良好的抗排斥反应、抑制肾小球系膜细胞增生外，还可以抑制粘附分子表达[1，15，16]。MMF对肾组织浸润细胞的影响，是直接抑制肾脏局部炎细胞的增生和(或)通过抑制粘附分子的表达间接减少肾脏局部炎细胞的浸润?为此，我们观察了MMF治疗前后肾组织粘附分子表达的改变。结果表明，ICAM-1与VCAM-1弥漫分布于LN患者肾小球与肾小管；MMF治疗后肾小球ICAM-1与VCAM-1表达均较治疗前明显减少；平均ICAM-1阳性小管百分率较治疗前明显减少(P<0.01)，平均ICAM-1阳性小管百分率、肾间质VCAM-1+细胞较治疗前也有所减少，但无统计学差异。肾间质ICAM-1+细胞治疗前后无明显变化。首次在组织学证实，MMF能够抑制肾脏局部粘附分子表达。
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MMF与MP不同之处在于MMF可以阻抑细胞内糖蛋白装配合成过程，对己启动的VCAM-1基因表达有抑制作用[17，18]，我们以往的研究表明，MP冲击治疗后肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞明显减少，但对肾小球、肾小管上皮细胞和肾间质VCAM-1高表达没有明显的影响[18]。本研究表明，MMF可以抑制肾小球粘附分子——VCAM-1和ICAM-1的高表达，对肾间质CD4+细胞、CD8+细胞、CD68+细胞无明显影响。从肾组织免疫病理角度阐明MMF与MP作用机制存在差异。
在明确MMF治疗后难治性Ⅳ-LN患者临床症状明显改善，血清自身抗体转阴或滴度明显下降，肾组织内免疫复合物沉积明显减少的基础上[5，19]，本研究进一步表明，MMF治疗后① 肾小球活动性病变明显减轻，肾小球内CD68+与PCNA+细胞明显减少。② MMF可以抑制肾小球ICAM-1与VCAM-1表达，这是MMF治疗后肾小球炎细胞浸润减少，肾组织病变改善的机制之一；也是MMF与MP作用机制不同之处，部分揭示了为什么在MP和CTX冲击治疗无效的LN患者，MMF治疗后临床表现与病理改变可以明显改善。③ 对肾小球粘附分子表达抑制作用强于对肾小管间质粘附分子表达的抑制，对肾小球炎细胞浸润的影响也优于对肾间质炎细浸润的影响。如何取得MMF治疗难治性LN的最佳效果，仍有一系列问题有待于进一步研究。
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黎磊石(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)
王金泉(第二军医大学博士研究生)
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收稿1999-11-30
修回2000-01-06, 百拇医药