自发性高血压大鼠脑缺血后脑区一氧化氮的变化
作者：吴秀丽 张洪 许国英 刘友尧 慕容慎行
单位：吴秀丽(350005 福建医科大学附一医院，福建省神经病学研究所)；张洪(350005 福建医科大学附一医院，福建省神经病学研究所)；许国英(350005 福建医科大学附一医院，福建省神经病学研究所)；慕容慎行(350005 福建医科大学附一医院，福建省神经病学研究所)；刘友尧(福建医科大学生化教研室)
关键词：脑缺血；一氧化氮合酶；亚硝酸盐；自发性高血压大鼠
脑与神经疾病杂志000103 摘 要 目的： 研究自发性高血压大鼠(SHR) 脑缺血后大脑皮质、海马、 纹状体和小脑组织中一氧化氮(NO)的变化。 采用放射免疫法和 荧光分光光度法检测脑组织中一氧化氮合酶(NOS)和亚硝酸盐(NO2)的含量。 结果显示SHR 脑缺血10 min， 各脑区NOS和NO2的含量均明显高于假手术组(P<0.01或P<0.05) 。 说明了SHR脑缺血早期脑组织NO的生成增加， 提示用特异的NO生成抑制剂类药物， 可能 有助于脑缺血的治疗。
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Change of nitric oxide in brain regions of SHR during cere bral ischemia
Wu Xiuli, Zhang Hong, Xu Guoyan, Liu Youyao, Murong Shensing.
Department of Neurology, 1st Affiliated Hospital, Fujian Medical University, F uzhou, 350005
Abstract To study the change of nitric oxide in cerebral co rtex, hippocampus, striatum and cerebellum during cerebral ischemia in SHR. The activity of nitric oxide synthase(NOS) and the level of nitrite(NO2)were measu red with radioimmunoassay and fluorometric method. The results showed that after 10 min cerebral ischemia, the activity of NOS and the level of NO2 in four re gions were significantly higher compared with sham-operated (P<0.01 or P<0 .05). These results indicated that the level of NO in brain regions significan tly increased in SHR during cerebral ischemia. It suggested that using specific NO inhibitor to suppress the excessive production of NO at early stage of ischem ia may benefit to the treatment of cerebral ischemia.
, 百拇医药
Key words cerebral ischemia nitric oxide synthase ni trite spontaneously hypertensive rats.
一氧化氮(NO)是近年来发现的一种新的递质分子， 在 中枢神经系统中具有广泛的作用[1]。 临床研究证实高血压是引起脑卒中的重要因 素之一。 本实验通过检测自发性高血压大鼠(SHR)全脑缺血后脑区一氧化氮合酶(NOS)和一 氧化氮代谢产物(NO2)的变化， 研究NO在脑缺血中的作用。
材料与方法
1. 实验动物及分组： 健康雄性SHR大鼠， 体重240±20g， 由福建省高血压病研究所动 物室提供， 随机分为脑缺血10 min组和假手术组， 每组8只动物。
2. 脑缺血动物模型的制备： 采用改良的Plsinelli方法[2]。 用20%乌拉坦(1g/ kg)腹腔麻醉后， 将大鼠固定在手术台上， 作头背部正中切口， 分离肌肉， 暴露第一颈 椎翼小孔， 分离小孔周围组织， 用尖端约0.5mm直径的电针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉。 在手术显微镜下观察并证实椎动脉已烧断后， 迅速翻转大鼠， 作颈前正中切口， 分离双 侧颈总动脉(CCA)， 用1号丝线结扎双侧CCA， 造成全脑缺血模型。 缺血时间从双侧CCA关 闭的瞬间开始计算。 假手术组分离出翼小孔和CCA， 不行烧灼和结扎。
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3. 脑组织NOS活性测定： NOS放射免疫测定试剂由中国医学科学院基础医学研究所药理室 提供。 参照Bredt等方法[3，4]， 所有操作均在0～4℃下进行。 称取冻存脑组织 ， 按1∶5(w/v)比例加入预冷的50mM Hepes pH7.4(内含0.32M蔗糖， 1mM EDTA, 0.1 mM E GTA, 1mM PMSF, 1mM MDTT, 1μM Leupetin, 2μM Pepstatin)， 在冰浴中用玻璃匀浆器匀 浆， 离心(4℃, 20000g) 60min , 上清即为NOS提取液， 取50μl NOS提取液， 加入50μl 反应Buffer, ， 使其终浓度为50mM hepes pH7.4， 内含有0.1mM NADPH, 30μM BH4，10 nM CaM, 1.25mM Cacl2, 1mM EGTA, 0.2μCi 3H-精氨酸， 反应管中加入1mM L-nit ro-Arg 作为本底。 于37℃水溶中反应15min， 用2ml预冷的Buffer C(20M Hepes, PH5. 5, 内含2mM EDTA, 0.2mM EGTA, 1mM L-Cit)终止反应。 再经0.5～0.7ml Dowex 50WX8(Na +型)阳离子交换树脂层析柱分离反应液中的3H-流出液和2ml的蒸馏水洗脱液。 将收集的 样品混匀后取出1ml于闪烁杯中， 加入甲苯-Triton X-100闪烁液7ml。 在液体闪烁计数仪( Beckman L-9800型)上测定样品中的放射性活性。 由此计算3H-胍氨酸的生成量。 结合蛋 白质浓度计算NOS的比活性。
, 百拇医药
4. NO2的测定： 参照Ohta等的方法[5]。 称取冻存脑组织， 加入3ml预冷的1 00mmol/L磷酸钾缓冲液中(含1mmol/L EDTA pH7.5)， 制成匀浆， 离心(4℃、 4000rpm/mi n) 10min。 取上清液2ml， 加入0.04% 4-羟香豆素(用二甲基甲酰胺与2N盐酸1∶1混合配制 )1ml， 0℃放置5min。 再加入8%硫代硫酸钠100ul， 室温放置5min。 加入1.5mol/L的NaOH 1ml， 置室温10min。 用日立F-4000型荧光分光光度计测定样品的荧光强度。 以NaNO2 作标准曲线， 结合蛋白质浓度计算NO2的含量。
5. 组织蛋白质测定： 采用Bradford法[6]。
6. 统计学处理： 实验结果以X±S表示， 组间差别的显著性用t检验。
, 百拇医药
结 果
1. SHR脑缺血后脑区NOS活性的变化(表1)。
表1 SHR脑缺血后不同脑区NOS活性的变化(Pmol/mg 蛋白/min) 组别
大脑皮质
海马
纹状体
小脑
假手术组
64.00±11.91
54.20±9.88
77.77±7.83
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154.32±19.86
脑缺血组
442.44±30.01*
134.16±13.41*
247.06±18.04*
1039.06±82.10*
注： 与假手术组相比*P<0.01 **P<0.05
从表1可见， SHR脑缺血后大脑皮质、海马、纹状体和小脑组织中NOS活性明显高于假手术组(P<0.01)。
2. SHR脑缺血后脑区NO2含量的变化(表2)。
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表2 SHR脑缺血后不同脑区NO2含量的变化(pmol/mg蛋白) 组别
大脑皮质
海马
纹状体
小脑
假手术组
48.13±6.78
44.12±6.49
104.64±11.36
150.05±12.12
脑缺血组
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102.02±14.21*
112.29±14.25*
124.81±16.79**
196.49±10.16*
注： 与假手术组相比*P<0.01， **P<0.05
从表2可见， SHR脑缺血大脑皮质、海马、 纹状体和小脑组织中N O2的含量明显高于假手术组(P<0.01或P<0.05)。
讨 论
近年来的研究证实了NO作为一种新的递质分子， 具有舒张血管、 抑制血管平滑肌增殖以 及血小板粘附等重要的生理作用， 参与机体很多生理活动和病理过程， 在脑缺血的发病中 起重要作用。 由于NO的半衰期短， 仅几秒钟， 使得直接检测组织NO的含量有一定困难。 但是通过检测生成NO的关键酶NOS和NO的代谢产物NO2， 可间接反映组织中NO的含量变化 。
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本实验通过对SHR脑缺血后不同脑区NOS和NO2检测的结果显示大鼠脑缺血10 min脑组织N OS和NO2的含量明显增加， 这一结果与文献报道一致[7]。 脑缺血后早期NO生成 增加可能是由于缺血组织中谷氨酸等兴奋性氨基酸的含量增加， 作用于N-甲基-D-天门 冬氨酸受体， 引起细胞内钙增加， 当细胞内钙达到一定浓度时便可激活NOS[1]； 同时， 脑缺血组织细胞分泌细胞因子如白细胞介素-1和肿瘤坏死因子等增加， 也可刺激 NOS[8]； 另外， 脑缺血时， 由于ATP减少， NOS发生去磷酸化作用， 也可使NOS 活性增加[9]。 由于NOS活性增加， 导致NO生成增加， 经过氧化作用， 使得组织 中NO2的含量也相应增加。 已知一定量的NO具有神经递质或信使的作用， 但过量NO的生 成就有可能通过氧化生成有毒性作用的氧自由基， 使细胞膜发生脂质过氧化作用， 使DNA 受 到破坏， 最终导致神经细胞坏死。 本实验的结果提示了NO参与SHR脑缺血的发病过程， 开 发和选择特异性NO生成抑制剂可能有助于脑缺血的治疗。
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参 考 文 献
1，Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide : physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev, 1991； 43∶109～14 2.
2，Pulsinelli WA, Brierley JB A new model of bilateral h emispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 1979；10∶267～272.
3，Bredt DS, Snyder SH. Isolation of nitric oxide synthet ase,a calmodulin requiring enzyme Proc Natl Acad Sci USA, 1990； 87∶682～685.
, 百拇医药
4，Mayer B, John M, Bohme E. Purification of a Ca2+ Cal modulin-dependent nitric oxide synthase from portine cerebellum; cofactor role o f tetrahydrobiopterin. FEBS Lett. 1990；227∶215～219.
5，Ohta T , Arai Y, Takitani S. Flurometric determinatio n of nitrite with 4-hydroxycoumarin. Anal Chem. 1986, 58∶3132～3135.
6，Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quan t itation of microgram quitities of protein utilizing the principle of protein-dy e-binding. Anal Bilchem. 1976, 72∶248～250.
, 百拇医药
7，Kader A, Frazzini VI, Solomn RA, et al.Nitric oxide pr oduction during focal cerebral ischemia in rats. Stroke,1993；24∶1709～1716.
8，Wang X, Yue TL, Barone FC, et al. Concomitant cortical expression of TNF-alpha and IL-1 beta mRNAs follows early response gene expres sion in transient focal ischemia. Mol Chem Neuro Pathol,1994；23∶103～114.
9，Bredt DS, Ferris CD, Snyder SH. Nitric oxide synthase regulatory sites:phosphorylaion by cyclic AMP dependent protein kinase, protein kinase C, and calcium/calmodulin protein kinase; identification of flavin and ca lmodulin binding sties. J Bilo Chem, 1992；267∶10976～10981.
(1999-07-10 收稿), http://www.100md.com
单位：吴秀丽(350005 福建医科大学附一医院，福建省神经病学研究所)；张洪(350005 福建医科大学附一医院，福建省神经病学研究所)；许国英(350005 福建医科大学附一医院，福建省神经病学研究所)；慕容慎行(350005 福建医科大学附一医院，福建省神经病学研究所)；刘友尧(福建医科大学生化教研室)
关键词：脑缺血；一氧化氮合酶；亚硝酸盐；自发性高血压大鼠
脑与神经疾病杂志000103 摘 要 目的： 研究自发性高血压大鼠(SHR) 脑缺血后大脑皮质、海马、 纹状体和小脑组织中一氧化氮(NO)的变化。 采用放射免疫法和 荧光分光光度法检测脑组织中一氧化氮合酶(NOS)和亚硝酸盐(NO2)的含量。 结果显示SHR 脑缺血10 min， 各脑区NOS和NO2的含量均明显高于假手术组(P<0.01或P<0.05) 。 说明了SHR脑缺血早期脑组织NO的生成增加， 提示用特异的NO生成抑制剂类药物， 可能 有助于脑缺血的治疗。
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Change of nitric oxide in brain regions of SHR during cere bral ischemia
Wu Xiuli, Zhang Hong, Xu Guoyan, Liu Youyao, Murong Shensing.
Department of Neurology, 1st Affiliated Hospital, Fujian Medical University, F uzhou, 350005
Abstract To study the change of nitric oxide in cerebral co rtex, hippocampus, striatum and cerebellum during cerebral ischemia in SHR. The activity of nitric oxide synthase(NOS) and the level of nitrite(NO2)were measu red with radioimmunoassay and fluorometric method. The results showed that after 10 min cerebral ischemia, the activity of NOS and the level of NO2 in four re gions were significantly higher compared with sham-operated (P<0.01 or P<0 .05). These results indicated that the level of NO in brain regions significan tly increased in SHR during cerebral ischemia. It suggested that using specific NO inhibitor to suppress the excessive production of NO at early stage of ischem ia may benefit to the treatment of cerebral ischemia.
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Key words cerebral ischemia nitric oxide synthase ni trite spontaneously hypertensive rats.
一氧化氮(NO)是近年来发现的一种新的递质分子， 在 中枢神经系统中具有广泛的作用[1]。 临床研究证实高血压是引起脑卒中的重要因 素之一。 本实验通过检测自发性高血压大鼠(SHR)全脑缺血后脑区一氧化氮合酶(NOS)和一 氧化氮代谢产物(NO2)的变化， 研究NO在脑缺血中的作用。
材料与方法
1. 实验动物及分组： 健康雄性SHR大鼠， 体重240±20g， 由福建省高血压病研究所动 物室提供， 随机分为脑缺血10 min组和假手术组， 每组8只动物。
2. 脑缺血动物模型的制备： 采用改良的Plsinelli方法[2]。 用20%乌拉坦(1g/ kg)腹腔麻醉后， 将大鼠固定在手术台上， 作头背部正中切口， 分离肌肉， 暴露第一颈 椎翼小孔， 分离小孔周围组织， 用尖端约0.5mm直径的电针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉。 在手术显微镜下观察并证实椎动脉已烧断后， 迅速翻转大鼠， 作颈前正中切口， 分离双 侧颈总动脉(CCA)， 用1号丝线结扎双侧CCA， 造成全脑缺血模型。 缺血时间从双侧CCA关 闭的瞬间开始计算。 假手术组分离出翼小孔和CCA， 不行烧灼和结扎。
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3. 脑组织NOS活性测定： NOS放射免疫测定试剂由中国医学科学院基础医学研究所药理室 提供。 参照Bredt等方法[3，4]， 所有操作均在0～4℃下进行。 称取冻存脑组织 ， 按1∶5(w/v)比例加入预冷的50mM Hepes pH7.4(内含0.32M蔗糖， 1mM EDTA, 0.1 mM E GTA, 1mM PMSF, 1mM MDTT, 1μM Leupetin, 2μM Pepstatin)， 在冰浴中用玻璃匀浆器匀 浆， 离心(4℃, 20000g) 60min , 上清即为NOS提取液， 取50μl NOS提取液， 加入50μl 反应Buffer, ， 使其终浓度为50mM hepes pH7.4， 内含有0.1mM NADPH, 30μM BH4，10 nM CaM, 1.25mM Cacl2, 1mM EGTA, 0.2μCi 3H-精氨酸， 反应管中加入1mM L-nit ro-Arg 作为本底。 于37℃水溶中反应15min， 用2ml预冷的Buffer C(20M Hepes, PH5. 5, 内含2mM EDTA, 0.2mM EGTA, 1mM L-Cit)终止反应。 再经0.5～0.7ml Dowex 50WX8(Na +型)阳离子交换树脂层析柱分离反应液中的3H-流出液和2ml的蒸馏水洗脱液。 将收集的 样品混匀后取出1ml于闪烁杯中， 加入甲苯-Triton X-100闪烁液7ml。 在液体闪烁计数仪( Beckman L-9800型)上测定样品中的放射性活性。 由此计算3H-胍氨酸的生成量。 结合蛋 白质浓度计算NOS的比活性。
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4. NO2的测定： 参照Ohta等的方法[5]。 称取冻存脑组织， 加入3ml预冷的1 00mmol/L磷酸钾缓冲液中(含1mmol/L EDTA pH7.5)， 制成匀浆， 离心(4℃、 4000rpm/mi n) 10min。 取上清液2ml， 加入0.04% 4-羟香豆素(用二甲基甲酰胺与2N盐酸1∶1混合配制 )1ml， 0℃放置5min。 再加入8%硫代硫酸钠100ul， 室温放置5min。 加入1.5mol/L的NaOH 1ml， 置室温10min。 用日立F-4000型荧光分光光度计测定样品的荧光强度。 以NaNO2 作标准曲线， 结合蛋白质浓度计算NO2的含量。
5. 组织蛋白质测定： 采用Bradford法[6]。
6. 统计学处理： 实验结果以X±S表示， 组间差别的显著性用t检验。
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结 果
1. SHR脑缺血后脑区NOS活性的变化(表1)。
表1 SHR脑缺血后不同脑区NOS活性的变化(Pmol/mg 蛋白/min) 组别
大脑皮质
海马
纹状体
小脑
假手术组
64.00±11.91
54.20±9.88
77.77±7.83
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154.32±19.86
脑缺血组
442.44±30.01*
134.16±13.41*
247.06±18.04*
1039.06±82.10*
注： 与假手术组相比*P<0.01 **P<0.05
从表1可见， SHR脑缺血后大脑皮质、海马、纹状体和小脑组织中NOS活性明显高于假手术组(P<0.01)。
2. SHR脑缺血后脑区NO2含量的变化(表2)。
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表2 SHR脑缺血后不同脑区NO2含量的变化(pmol/mg蛋白) 组别
大脑皮质
海马
纹状体
小脑
假手术组
48.13±6.78
44.12±6.49
104.64±11.36
150.05±12.12
脑缺血组
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102.02±14.21*
112.29±14.25*
124.81±16.79**
196.49±10.16*
注： 与假手术组相比*P<0.01， **P<0.05
从表2可见， SHR脑缺血大脑皮质、海马、 纹状体和小脑组织中N O2的含量明显高于假手术组(P<0.01或P<0.05)。
讨 论
近年来的研究证实了NO作为一种新的递质分子， 具有舒张血管、 抑制血管平滑肌增殖以 及血小板粘附等重要的生理作用， 参与机体很多生理活动和病理过程， 在脑缺血的发病中 起重要作用。 由于NO的半衰期短， 仅几秒钟， 使得直接检测组织NO的含量有一定困难。 但是通过检测生成NO的关键酶NOS和NO的代谢产物NO2， 可间接反映组织中NO的含量变化 。
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本实验通过对SHR脑缺血后不同脑区NOS和NO2检测的结果显示大鼠脑缺血10 min脑组织N OS和NO2的含量明显增加， 这一结果与文献报道一致[7]。 脑缺血后早期NO生成 增加可能是由于缺血组织中谷氨酸等兴奋性氨基酸的含量增加， 作用于N-甲基-D-天门 冬氨酸受体， 引起细胞内钙增加， 当细胞内钙达到一定浓度时便可激活NOS[1]； 同时， 脑缺血组织细胞分泌细胞因子如白细胞介素-1和肿瘤坏死因子等增加， 也可刺激 NOS[8]； 另外， 脑缺血时， 由于ATP减少， NOS发生去磷酸化作用， 也可使NOS 活性增加[9]。 由于NOS活性增加， 导致NO生成增加， 经过氧化作用， 使得组织 中NO2的含量也相应增加。 已知一定量的NO具有神经递质或信使的作用， 但过量NO的生 成就有可能通过氧化生成有毒性作用的氧自由基， 使细胞膜发生脂质过氧化作用， 使DNA 受 到破坏， 最终导致神经细胞坏死。 本实验的结果提示了NO参与SHR脑缺血的发病过程， 开 发和选择特异性NO生成抑制剂可能有助于脑缺血的治疗。
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1，Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide : physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev, 1991； 43∶109～14 2.
2，Pulsinelli WA, Brierley JB A new model of bilateral h emispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 1979；10∶267～272.
3，Bredt DS, Snyder SH. Isolation of nitric oxide synthet ase,a calmodulin requiring enzyme Proc Natl Acad Sci USA, 1990； 87∶682～685.
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4，Mayer B, John M, Bohme E. Purification of a Ca2+ Cal modulin-dependent nitric oxide synthase from portine cerebellum; cofactor role o f tetrahydrobiopterin. FEBS Lett. 1990；227∶215～219.
5，Ohta T , Arai Y, Takitani S. Flurometric determinatio n of nitrite with 4-hydroxycoumarin. Anal Chem. 1986, 58∶3132～3135.
6，Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quan t itation of microgram quitities of protein utilizing the principle of protein-dy e-binding. Anal Bilchem. 1976, 72∶248～250.
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7，Kader A, Frazzini VI, Solomn RA, et al.Nitric oxide pr oduction during focal cerebral ischemia in rats. Stroke,1993；24∶1709～1716.
8，Wang X, Yue TL, Barone FC, et al. Concomitant cortical expression of TNF-alpha and IL-1 beta mRNAs follows early response gene expres sion in transient focal ischemia. Mol Chem Neuro Pathol,1994；23∶103～114.
9，Bredt DS, Ferris CD, Snyder SH. Nitric oxide synthase regulatory sites:phosphorylaion by cyclic AMP dependent protein kinase, protein kinase C, and calcium/calmodulin protein kinase; identification of flavin and ca lmodulin binding sties. J Bilo Chem, 1992；267∶10976～10981.
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