紫外分光光度法测定戊二醛的光谱特征分析
作者：于宝东 石杰 初晓 于进彩
单位：山东省青岛市立医院 266011
关键词：戊二醛；盐酸羟胺；紫外分光光度法
首都医药000212摘要 目的：研究反应物浓度、反应时间及pH值等因素对羟胺 缩合紫外分光光度法测戊二醛的吸收光谱的影响，分析光谱特征及其产生的原因；方法：配 制不同pH值的溶液作为稀释液，取不同比例的盐酸羟胺和戊二醛分别以各稀释液稀释至一定 体积进行反应，在10、30、50、分钟时分别扫描各反应溶液的紫外吸收光谱图进行比较；结 果：反应液在255nm～260nm之间的光谱比较平缓，吸收度远远高于同波长下的戊二醛溶液； 在酸性及中性环境下，溶液的吸收光谱随着反应时间的延长向右移动，而在碱性环境下，光 谱不随时间改变；当羟胺浓度增加时，吸收光谱左移；结论：在pH=11的碱性环境下，以1： 2摩尔比例反应约20分钟，在256nm处进行测定，重复性好、结果最稳定。
, 百拇医药
药典和许多地方医院制剂规范都采用加入过量羟胺溶液，使之与羰基缩合成肟，再用强酸滴 定的方法测定戊二醛溶液。该方法在实际运用中存在反应时间长、终点变色不显著等缺点， 缺乏经验者操作时往往会有较大的误差。文献〔1，2〕用紫外光光度法和HPLC法测定 戊二醛的浓度，结果准确、操作简单，适合快检的要求。两种方法都依赖于缩和物的紫外吸 收光谱，但在不同反应条件下，吸收光谱会有所改变本文就其中涉及到的一些问题进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 仪器与药品：HP8453紫外分光光度计(美国惠谱)；戊二醛消毒液(含量2.13%，本院制 剂室提供)，盐酸羟胺、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠均为分析纯。
1.2 羟胺溶液配制：精称盐酸羟胺约3克，加入100ml容量瓶中，以重蒸水溶解并稀释至刻 度。
, 百拇医药 1.3 稀释液配制：按药典附录配制pH=2.5、pH＝7.3的磷 酸盐缓冲溶液；取重蒸水以氢氧化 钠溶液调节成pH=10、pH=11、pH=13的溶液备用。
1.4 稳定性试验1：取50ml的容量瓶6只，按表1精密吸取试液并以稀释液稀释 至刻度，以重蒸水作空白，分别于10、30、50分钟扫描200～300nm范围的紫外吸收光谱，比 较缩合反应的pH 值及时间对吸收光谱的影响，测定255nm、256nm、258nm处的吸收度，并计算相对标准偏差( CV%)，选择最佳测定波长。
表1 羟胺溶液的配制 标号
戊二醛液
(2%)
盐酸羟胺
(3%)
, http://www.100md.com
稀释液
1
2ml
1ml
蒸馏水
2
2ml
2ml
蒸馏水
3
2ml
3ml
蒸馏水
, 百拇医药 4
2ml
4ml
蒸馏水
5
2ml
6ml
蒸馏水
表2 羟胺稀释液的PH值 标号
戊二醛液
(2%)
盐酸羟胺
(3%)
, 百拇医药
稀释液
pH值
1
2ml
2ml
磷酸盐缓冲液
2.5
2
2ml
2ml
蒸馏水
6.7
3
, http://www.100md.com 2ml
2ml
磷酸盐缓冲液
7.3
4
2ml
2ml
氢氧化钠溶液
10
5
2ml
2ml
氢氧化钠溶液
, http://www.100md.com
11
6
2ml
2ml
氢氧化钠溶液
13
1.5 稳定性试验2：取50ml的容量瓶5只，按表2精密吸取试液并以重蒸水稀释至刻度，以重 蒸 水为空白，于30分钟时分别扫描200nm～300nm范围内的紫外吸收光谱，比较不同比例的羟胺 浓度对吸收光谱的影响。
2 结果
2.1 磷酸盐缓冲液、盐酸羟胺溶液戊二醛液及戊二醛羟胺缩合液的吸收光谱见图1。缩合液 的 光谱的255nm到265nm之间较为平滑，且在此区间内，磷酸盐缓冲液及盐酸羟胺溶液均无吸收 ，戊二醛液在试验浓度(约800μg/ml)下的吸收值小于缩合液吸收值的5%。
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2.2 图2～图7分别为表1下的各溶液吸光谱图，各图中包含的三条曲线分别为该溶液在10、 30 及50分钟时的吸收光谱。由图可见在不同的pH环境下缩合溶液的吸收光谱可随反应时间而有 所改变。
2.3 表3是不同pH值时，不同波长下的吸收度随时间改变的变异系数，由表中可以看出在25 6nm处的吸收值比较稳定，而pH=13的环境下在263nm处的吸收值较稳定。
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表3 不同PH值下的吸收度随时间变化情况 标号pH值
A255nm
(CV%)
A256nm
(CV%)
258nm
(CV%)
263nm
(CV%)
A264nm
(CV%)
1
, 百拇医药
2.5
1.541
0.7419
1.389
2
6.7
0.5352
0.686
1.000
, 百拇医药
3
7.3
0.7385
0.8125
0.5925
4
10
0.6895
0.4325
1.780
, 百拇医药
5
11
1.362
0.8565
0.6745
6
13
0.3433
, 百拇医药
0.4287
2.4 图8中的各条光谱对应于表2中的各溶液。可见在戊二醛浓度一定的条件下，加入不同 量的羟胺溶液，其吸收光谱有较大的改变。
3 讨论
3.1 戊二醛与羟胺发生缩合反应后，由于戊二醛分子结构的改变，发生n→π*跃迁的羰 基 被C=N-基团取代，由于氮原子上的2p电子比氧原子上的2p电子能量高，更接近于π反键轨道 (π*)的能量，所以碳氮双键发生n→π*跃迁吸收的能量低，其吸收光谱向长波长方向 移动。试验结果(见图1)与理论相一致。
3.2 由图1可以看出，直接用戊二醛溶液进行紫外分光测定是可行的，220nm～232nm的光谱 比较 平缓，而且磷酸盐缓冲溶液对210nm以后的吸收光谱无影响。加入羟胺溶液发生缩合反应后 ，吸收光谱右移、吸收度明显提高，但在250nm以内的范围内出现较多的尖锐吸收峰，并且 重复测定时不能完全重叠，故这一段不适于作紫外分光测定；在255nm～260nm之间的光谱比 较平缓，吸收度远远高于同波长下的戊二醛溶液，但与单纯戊二醛溶液在220nm～232nm范围 内的吸收度相比较，并无显著增加。
, 百拇医药
3.3 在戊二醛及羟胺浓度相同的情况下，不同的pH缓冲液对吸收光谱有显著的影响，由图2 ～ 图7可以看到，在酸性及中性环境下，溶液的吸收光谱随着反应时间的延长向右移动，在酸 性环境下尤其显著(图2)；而在碱性环境下，光谱不随时间右移，特别在pH=11的缓冲液中， 255nm以外的光谱几乎可以完全重合；pH=13的碱性条件下反应物的吸收度有较大的提高，光 谱右移。戊二醛与羟胺的缩合反应是从碱性生成中性的过程，所以在碱性环境(药典加入 过量的三乙醇胺)下可促进缩和反应的进行，反应速度也较快；而在酸性环境下恰好相反， 故图2有较大的移动。
3.4 图8是戊二醛：羟胺(摩尔浓度)的比值约为1：1、1：2、1：3、1：4、1：6时的紫外吸 收光谱图，当羟胺浓度增加时，吸收光谱左移，且浓度每增加一倍吸收峰将左移约两倍的距 离(nm)。虽然增加羟胺对戊二醛的比例有利于缩合反应进行，可使戊二醛反应得更加完全， 但另一方面，在极性溶剂中，含有O-H、N-H等强极性健的氢原子能与样品分子中的孤电子对 生成氢键，使孤对电子遭到破坏，n-轨道上留下来的一个电子将失去生成氢键的能力，因 此 nπ*跃迁时就要多提供克服一个氢键的能量，故紫外光谱的吸收带向短波长方向(左移) 移动。当水中的羟胺分子较多时，可使溶液中的氢键更多样化、更强，使紫外吸收光谱更加 蓝移(左移)，这就是增加羟胺比例时光谱左移的原因。所以一味地增加羟胺浓度反而会降低 缩合物的吸收强度，从试验结果看，1：2的比例已经足够。
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由上可知，戊二醛、羟胺缩合反应的紫外吸收光谱受反应成份浓度、反应时间及pH环境等的 影响，在pH=11的碱性环境下，以1：2的摩尔比例进行反应约20分钟，在256nm处进行测定， 结果最稳定、重复性好。直接用戊二醛溶液进行紫外分光测定也能够得到满意的结果，当为 了防止其它物质在250nm以内的吸收对测定的干扰时，最好用缩合反应的方法。
参考文献
1，朱维华.HPLC法同时测定消毒液中醋酸洗必泰和戊二醛.药物分析杂志，1993，13 (4)：244
2，江永南.羟胺缩合紫外分光光度法测戊二醛含量.中国医院药学杂志，1997，17(5)：217.
(2000-01-15 收稿), 百拇医药
单位：山东省青岛市立医院 266011
关键词：戊二醛；盐酸羟胺；紫外分光光度法
首都医药000212摘要 目的：研究反应物浓度、反应时间及pH值等因素对羟胺 缩合紫外分光光度法测戊二醛的吸收光谱的影响，分析光谱特征及其产生的原因；方法：配 制不同pH值的溶液作为稀释液，取不同比例的盐酸羟胺和戊二醛分别以各稀释液稀释至一定 体积进行反应，在10、30、50、分钟时分别扫描各反应溶液的紫外吸收光谱图进行比较；结 果：反应液在255nm～260nm之间的光谱比较平缓，吸收度远远高于同波长下的戊二醛溶液； 在酸性及中性环境下，溶液的吸收光谱随着反应时间的延长向右移动，而在碱性环境下，光 谱不随时间改变；当羟胺浓度增加时，吸收光谱左移；结论：在pH=11的碱性环境下，以1： 2摩尔比例反应约20分钟，在256nm处进行测定，重复性好、结果最稳定。
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药典和许多地方医院制剂规范都采用加入过量羟胺溶液，使之与羰基缩合成肟，再用强酸滴 定的方法测定戊二醛溶液。该方法在实际运用中存在反应时间长、终点变色不显著等缺点， 缺乏经验者操作时往往会有较大的误差。文献〔1，2〕用紫外光光度法和HPLC法测定 戊二醛的浓度，结果准确、操作简单，适合快检的要求。两种方法都依赖于缩和物的紫外吸 收光谱，但在不同反应条件下，吸收光谱会有所改变本文就其中涉及到的一些问题进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 仪器与药品：HP8453紫外分光光度计(美国惠谱)；戊二醛消毒液(含量2.13%，本院制 剂室提供)，盐酸羟胺、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠均为分析纯。
1.2 羟胺溶液配制：精称盐酸羟胺约3克，加入100ml容量瓶中，以重蒸水溶解并稀释至刻 度。
, 百拇医药 1.3 稀释液配制：按药典附录配制pH=2.5、pH＝7.3的磷 酸盐缓冲溶液；取重蒸水以氢氧化 钠溶液调节成pH=10、pH=11、pH=13的溶液备用。
1.4 稳定性试验1：取50ml的容量瓶6只，按表1精密吸取试液并以稀释液稀释 至刻度，以重蒸水作空白，分别于10、30、50分钟扫描200～300nm范围的紫外吸收光谱，比 较缩合反应的pH 值及时间对吸收光谱的影响，测定255nm、256nm、258nm处的吸收度，并计算相对标准偏差( CV%)，选择最佳测定波长。
表1 羟胺溶液的配制 标号
戊二醛液
(2%)
盐酸羟胺
(3%)
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稀释液
1
2ml
1ml
蒸馏水
2
2ml
2ml
蒸馏水
3
2ml
3ml
蒸馏水
, 百拇医药 4
2ml
4ml
蒸馏水
5
2ml
6ml
蒸馏水
表2 羟胺稀释液的PH值 标号
戊二醛液
(2%)
盐酸羟胺
(3%)
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稀释液
pH值
1
2ml
2ml
磷酸盐缓冲液
2.5
2
2ml
2ml
蒸馏水
6.7
3
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2ml
磷酸盐缓冲液
7.3
4
2ml
2ml
氢氧化钠溶液
10
5
2ml
2ml
氢氧化钠溶液
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11
6
2ml
2ml
氢氧化钠溶液
13
1.5 稳定性试验2：取50ml的容量瓶5只，按表2精密吸取试液并以重蒸水稀释至刻度，以重 蒸 水为空白，于30分钟时分别扫描200nm～300nm范围内的紫外吸收光谱，比较不同比例的羟胺 浓度对吸收光谱的影响。
2 结果
2.1 磷酸盐缓冲液、盐酸羟胺溶液戊二醛液及戊二醛羟胺缩合液的吸收光谱见图1。缩合液 的 光谱的255nm到265nm之间较为平滑，且在此区间内，磷酸盐缓冲液及盐酸羟胺溶液均无吸收 ，戊二醛液在试验浓度(约800μg/ml)下的吸收值小于缩合液吸收值的5%。
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2.2 图2～图7分别为表1下的各溶液吸光谱图，各图中包含的三条曲线分别为该溶液在10、 30 及50分钟时的吸收光谱。由图可见在不同的pH环境下缩合溶液的吸收光谱可随反应时间而有 所改变。
2.3 表3是不同pH值时，不同波长下的吸收度随时间改变的变异系数，由表中可以看出在25 6nm处的吸收值比较稳定，而pH=13的环境下在263nm处的吸收值较稳定。
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表3 不同PH值下的吸收度随时间变化情况 标号pH值
A255nm
(CV%)
A256nm
(CV%)
258nm
(CV%)
263nm
(CV%)
A264nm
(CV%)
1
, 百拇医药
2.5
1.541
0.7419
1.389
2
6.7
0.5352
0.686
1.000
, 百拇医药
3
7.3
0.7385
0.8125
0.5925
4
10
0.6895
0.4325
1.780
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5
11
1.362
0.8565
0.6745
6
13
0.3433
, 百拇医药
0.4287
2.4 图8中的各条光谱对应于表2中的各溶液。可见在戊二醛浓度一定的条件下，加入不同 量的羟胺溶液，其吸收光谱有较大的改变。
3 讨论
3.1 戊二醛与羟胺发生缩合反应后，由于戊二醛分子结构的改变，发生n→π*跃迁的羰 基 被C=N-基团取代，由于氮原子上的2p电子比氧原子上的2p电子能量高，更接近于π反键轨道 (π*)的能量，所以碳氮双键发生n→π*跃迁吸收的能量低，其吸收光谱向长波长方向 移动。试验结果(见图1)与理论相一致。
3.2 由图1可以看出，直接用戊二醛溶液进行紫外分光测定是可行的，220nm～232nm的光谱 比较 平缓，而且磷酸盐缓冲溶液对210nm以后的吸收光谱无影响。加入羟胺溶液发生缩合反应后 ，吸收光谱右移、吸收度明显提高，但在250nm以内的范围内出现较多的尖锐吸收峰，并且 重复测定时不能完全重叠，故这一段不适于作紫外分光测定；在255nm～260nm之间的光谱比 较平缓，吸收度远远高于同波长下的戊二醛溶液，但与单纯戊二醛溶液在220nm～232nm范围 内的吸收度相比较，并无显著增加。
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3.3 在戊二醛及羟胺浓度相同的情况下，不同的pH缓冲液对吸收光谱有显著的影响，由图2 ～ 图7可以看到，在酸性及中性环境下，溶液的吸收光谱随着反应时间的延长向右移动，在酸 性环境下尤其显著(图2)；而在碱性环境下，光谱不随时间右移，特别在pH=11的缓冲液中， 255nm以外的光谱几乎可以完全重合；pH=13的碱性条件下反应物的吸收度有较大的提高，光 谱右移。戊二醛与羟胺的缩合反应是从碱性生成中性的过程，所以在碱性环境(药典加入 过量的三乙醇胺)下可促进缩和反应的进行，反应速度也较快；而在酸性环境下恰好相反， 故图2有较大的移动。
3.4 图8是戊二醛：羟胺(摩尔浓度)的比值约为1：1、1：2、1：3、1：4、1：6时的紫外吸 收光谱图，当羟胺浓度增加时，吸收光谱左移，且浓度每增加一倍吸收峰将左移约两倍的距 离(nm)。虽然增加羟胺对戊二醛的比例有利于缩合反应进行，可使戊二醛反应得更加完全， 但另一方面，在极性溶剂中，含有O-H、N-H等强极性健的氢原子能与样品分子中的孤电子对 生成氢键，使孤对电子遭到破坏，n-轨道上留下来的一个电子将失去生成氢键的能力，因 此 nπ*跃迁时就要多提供克服一个氢键的能量，故紫外光谱的吸收带向短波长方向(左移) 移动。当水中的羟胺分子较多时，可使溶液中的氢键更多样化、更强，使紫外吸收光谱更加 蓝移(左移)，这就是增加羟胺比例时光谱左移的原因。所以一味地增加羟胺浓度反而会降低 缩合物的吸收强度，从试验结果看，1：2的比例已经足够。
, http://www.100md.com
由上可知，戊二醛、羟胺缩合反应的紫外吸收光谱受反应成份浓度、反应时间及pH环境等的 影响，在pH=11的碱性环境下，以1：2的摩尔比例进行反应约20分钟，在256nm处进行测定， 结果最稳定、重复性好。直接用戊二醛溶液进行紫外分光测定也能够得到满意的结果，当为 了防止其它物质在250nm以内的吸收对测定的干扰时，最好用缩合反应的方法。
参考文献
1，朱维华.HPLC法同时测定消毒液中醋酸洗必泰和戊二醛.药物分析杂志，1993，13 (4)：244
2，江永南.羟胺缩合紫外分光光度法测戊二醛含量.中国医院药学杂志，1997，17(5)：217.
(2000-01-15 收稿), 百拇医药